一种防治肝损伤和/或肝癌的药物组合物及其制备方法和用途

1.本发明属于生物医药领域，具体涉及一种防治肝损伤和/或肝癌的药物组合物及其制备方法和用途。


背景技术：

2.肝损伤是由体内代谢产物对肝细胞的破坏与毒性作用所引的，以肝脏代谢紊乱为基础的急、慢性肝脏官疾病。肝损伤是临床常见的危害人类健康的疾病，全世界每年有140万慢性肝病患者，我国是一个肝病高发国家，大约有1亿乙肝病毒携带者，有2000万慢性肝炎患者。
3.造成肝损伤的致病因素主要有两类：1、由病原微生物如病毒感染而引起的肝脏炎症，如甲肝、乙肝等。2、化学性肝损伤，即由化学性肝毒性物质所造成的肝损伤，其机理包括脂肪变性、脂质过氧化反应、胆汁淤积等。作为人体的重要解毒器官的肝脏，具有肝动脉和肝静脉双重血液供应，化学物质可通过胃肠道门静脉或体循环进入肝脏进行转化，因此肝脏容易受到化学物质中的毒性物质损害。酒精、环境中的化学毒物等均可造成对肝脏的损害。肝损伤严重时引发的肝功能衰竭和肝性脑病等，发病率和死亡率高，极大地威胁着人类的健康。
4.原发性肝癌(hcc)是全球第六大最常见肿瘤，癌症相关死亡率的第三大原因，5年总生存期(os)仅为10％
‑
15％，其中hbv感染、酒精、黄曲霉菌、超重和糖尿病是其主要病因。早期原发性肝癌患者根治术后易复发和中晚期患者缺乏有效抗肿瘤药物是导致患者预后不佳的重要原因。因此，迫切需要寻找预防肿瘤复发、延长生存期的治疗手段。
5.无论是治疗肝损伤还是肝癌，使用化学药物治疗副作用大，长期使用可产生耐药性，造成药物残留；而近年来，我国传统药材及其制剂在我国在肝病治疗方面的临床应用日益增多，展现出毒副作用低等独特的优势。不过，部分传统药材也被发现具有潜在的肝毒性，或者治疗效果仍不理想。
6.因此，进一步研发一种新的，毒性小且防治肝损伤和肝癌的效果优异的药物，具有重要的意义与价值。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种调畅气机、调和肝胃、健脾利湿的药物组合物。
8.本发明提供了一种防治肝损伤和/或肝癌的药物组合物，它由如下原料药制成：
9.柴胡200～300份、黄芩150～250份、黄芪200～300份、甘草50～150份、连翘200～300份、白术100～200份、白芍200～300份、茜草20～120份、麦芽20～120份、海螵蛸50～150份、鳖甲20～120份、鸡内金20～120份、肉桂10～110份、冰片1～10份、薄荷脑1～10份。
10.进一步地，它由如下原料药制成：
11.柴胡250～300份、黄芩180～230份、黄芪200～250份、甘草50～100份、连翘200～
250份、白术100～150份、白芍200～250份、茜草20～50份、麦芽20～50份、海螵蛸50～100份、鳖甲20～50份、鸡内金20～50份、肉桂10～50份、冰片1～5份、薄荷脑1～5份。
12.更进一步地，它由如下原料药制成：
13.柴胡266.7份、黄芩200份、黄芪222.2份、甘草66.7份、连翘222.2份、白术133.3份、白芍222.2份、茜草22.2份、麦芽44.4份、海螵蛸88.9份、鳖甲44.4份、鸡内金44.4份、肉桂22.2份、冰片2.2份、薄荷脑2.2份。
14.更进一步地，上述黄芩为酒黄芩，甘草为炙甘草，白术为麸炒白术，鳖甲为醋鳖甲。
15.更进一步地，上述药物组合物是由所述原料药的原生药粉、水或有机溶剂提取物为活性成分，加上或不加药学上可接受的辅料制备而成的制剂。
16.进一步地，上述制剂是口服制剂。
17.更进一步地，上述口服制剂为丸剂、散剂、胶囊剂、汤剂、颗粒剂；优选为丸剂；更优选地，所述丸剂每1g相当于原料药1.5～1.7g。
18.本发明还提供了上述的丸剂的制备方法，包括如下步骤：
19.(1)按比例称取连翘、白术、白芍、茜草、麦芽、海螵蛸、鳖甲、鸡内金、肉桂、冰片、薄荷脑混合粉碎成细粉；
20.(2)按比例称取柴胡、黄芩、黄芪、甘草加水浸泡、煎煮过滤，滤液浓缩成稠膏；
21.(3)将步骤(1)得到的细粉与步骤(2)得到的稠膏混匀，制丸。
22.本发明还提供了上述的药物组合物在制备防治肝损伤和肝癌的药物中的用途。
23.进一步地，上述防治肝损伤的药物是保护肝细胞、提升肝功能的药物；所述防治肝癌的药物是抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡、抑制肝癌细胞侵袭与迁移的药物。
24.实验结果表明，本发明药物组合物毒性低，能够有效防治肝损伤，抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移，作为护肝、治疗肝癌的药物，具有非常好的临床应用前景。
25.本发明方中柴胡疏肝理气，黄芩清泄邪热，二者配伍，为小柴胡之意，调和少阳枢机，共为君药；鸡内金善化瘀积，降胃气，麦芽行气消食，疏肝气，两药配伍使肝气升发，胃气通降，脾气健运，共为臣药；黄芪、白术健益脾气，顾护后天之本，肉桂固先天之本，以抑肝木之横恣，且活血通经，茜草活血化瘀，海螵蛸疏通血脉，鳖甲软坚散结，连翘清热散结，白芍润以柔肝护肝体，共为佐药；甘草甘以缓肝，兼调和诸药，冰片、薄荷脑芳香通肝络，共为使药。诸药配伍，使气机调畅，肝胃调和，脾气得健，湿热清利，癥积自消。
26.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
27.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
28.图1为小鼠肝大叶he染色结果。
29.图2为本发明药物组合物对细胞增殖活性的影响；注：a:hepg2细胞，低、中、高剂量分别为7.5、15、30mg/ml；b:smmc
‑
7721细胞，低、中、高剂量分别为4.5、9、18mg/ml。
30.图3为本发明药物组合物对肝癌细胞克隆增殖能力的影响；注：hepg2细胞低、中、
高剂量分别为7.5、15、30mg/ml；smmc
‑
7721细胞低、中、高剂量分别为4.5、9、18mg/ml。
31.图4为本发明药物组合物对肝癌细胞划痕愈合能力的影响；注：a:hepg2细胞中本发明药物组合物不同浓度(低、中、高剂量分别为7.5、15、30mg/ml)对划痕愈合的影响，b:hepg2细胞划痕愈合面积百分比；c:smmc
‑
7721细胞中本发明药物组合物不同浓度(低、中、高剂量分别为4.5、9、18mg/ml)对划痕愈合的影响，d:smmc
‑
7721细胞划痕愈合面积百分比。
32.图5为本发明药物组合物对肝癌细胞侵袭能力的影响(结晶紫染色)；注：hepg2细胞低、中、高剂量分别为7.5、15、30mg/ml；smmc
‑
7721细胞低、中、高剂量分别为4.5、9、18mg/ml。
33.图6为本发明药物组合物对肝癌细胞迁移能力的影响(结晶紫染色)；注：hepg2细胞低、中、高剂量分别为7.5、15、30mg/ml；smmc
‑
7721细胞低、中、高剂量分别为4.5、9、18mg/ml。
具体实施方式
34.四川省中医药科学院实验动物中心提供，生产许可证号：scxk(川)2018
‑
19。小鼠寄养于四川省中医药科学院动物中心spf屏障系统，室内温度20
‑
22℃，相对湿度50％左右，照明12h明亮，12h黑暗。环境使用许可证号为syxk(川)2018
‑
100。自由饮水，全营养颗粒饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供。
35.统计学分析：所有数据用平均值
±
标准差(x
±
s)表示。计量资料采用方差分析，组间差异采用student t检验。
36.除另有说明外，本发明其余所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
37.实施例1、本发明药物组合物的制备
38.【处方】
[0039][0040]
【制法】以上十五味，连翘、麸炒白术、白芍、茜草、麦芽、海螵蛸、醋鳖甲、鸡内金混合粉碎成细粉，电热灭菌，干燥；肉桂粉碎成细粉，加乙醇密闭保温，干燥；上述两种细粉加冰片、薄荷脑混合粉碎，待用。柴胡、酒黄芩、黄芪、炙甘草加8倍量水，浸泡1小时，煎煮三次，每次0.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩成稠膏，与上述细粉混匀，制丸，干燥(60℃)，选丸，分装，即得。
[0041]
【性状】本品为棕褐色的水丸；气微香，味凉。
[0042]
【规格】每1g产品相当于原药材1.604g。
[0043]
实施例2、本发明药物组合物的制备
[0044]
【处方】
[0045][0046]
【制法】以上十五味，连翘、麸炒白术、白芍、茜草、麦芽、海螵蛸、醋鳖甲、鸡内金混合粉碎成细粉，电热灭菌，干燥；肉桂粉碎成细粉，加乙醇密闭保温，干燥；上述两种细粉加冰片、薄荷脑混合粉碎，待用。柴胡、酒黄芩、黄芪、炙甘草加8倍量水，浸泡1小时，煎煮三次，每次0.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩成稠膏，与上述细粉混匀，制丸，干燥(60℃)，选丸，分装，即得。
[0047]
【性状】本品为棕褐色的水丸；气微香，味凉。
[0048]
【规格】每1g产品相当于原药材1.5g。
[0049]
实施例3、本发明药物组合物的制备
[0050]
【处方】
[0051][0052][0053]
【制法】以上十五味，连翘、麸炒白术、白芍、茜草、麦芽、海螵蛸、醋鳖甲、鸡内金混合粉碎成细粉，电热灭菌，干燥；肉桂粉碎成细粉，加乙醇密闭保温，干燥；上述两种细粉加冰片、薄荷脑混合粉碎，待用。柴胡、酒黄芩、黄芪、炙甘草加8倍量水，浸泡1小时，煎煮三次，每次0.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩成稠膏，与上述细粉混匀，制丸，干燥(60℃)，选丸，分装，即得。
[0054]
【性状】本品为棕褐色的水丸；气微香，味凉。
[0055]
【规格】每1g产品相当于原药材1.7g。
[0056]
实施例4、本发明药物组合物的制备
[0057]
【处方】
[0058][0059]
【制法】以上十五味，连翘、麸炒白术、白芍、茜草、麦芽、海螵蛸、醋鳖甲、鸡内金混合粉碎成细粉，电热灭菌，干燥；肉桂粉碎成细粉，加乙醇密闭保温，干燥；上述两种细粉加
冰片、薄荷脑混合粉碎，待用。柴胡、酒黄芩、黄芪、炙甘草加8倍量水，浸泡1小时，煎煮三次，每次0.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩成稠膏，与上述细粉混匀，制丸，干燥(60℃)，选丸，分装，即得。
[0060]
【性状】本品为棕褐色的水丸；气微香，味凉。
[0061]
【规格】每1g产品相当于原药材1.6g。
[0062]
实施例5、本发明药物组合物的制备
[0063]
【处方】
[0064][0065]
【制法】以上十五味，连翘、麸炒白术、白芍、茜草、麦芽、海螵蛸、醋鳖甲、鸡内金混合粉碎成细粉，电热灭菌，干燥；肉桂粉碎成细粉，加乙醇密闭保温，干燥；上述两种细粉加冰片、薄荷脑混合粉碎，待用。柴胡、酒黄芩、黄芪、炙甘草加8倍量水，浸泡1小时，煎煮三次，每次0.5小时，煎液滤过，滤液合并，浓缩成稠膏，与上述细粉混匀，制丸，干燥(60℃)，选丸，分装，即得。
[0066]
【性状】本品为棕褐色的水丸；气微香，味凉。
[0067]
【规格】每1g产品相当于原药材1.65g。
[0068]
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
[0069]
实验例1、本发明药物组合物的毒性研究
[0070]
1、实验方法
[0071]
由预实验结果可知本发明药物组合物其急性毒性作用较弱，故对其做最大给药量试验。
[0072]
将体质量18
‑
22g spf级昆明小鼠40只，雌雄各半，适应性喂养1d后按体质量随机分为对照组和给药组共两组，每组20只，雌雄各半。小鼠禁食不禁水14h后，以最大浓度(0.864g原生药/ml)，最大给药体积(0.4ml/10g)对给药组灌胃给药一次，使其服用剂量达到34.55g原生药/kg，对照组以同样的方法灌胃0.5％cmc
‑
na溶液。观察并记录动物在给药后续14d内的中毒表现及死亡情况，于给药前、给药后第7d、14d称体质量。试验结束时脱臼处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾称脏器质量，并计算脏器指数。
[0073]
脏器指数＝脏器质量(mg)/小鼠体质量(g)*10g
[0074]
2、实验结果
[0075]
从表1可见，小鼠灌胃给予实施例1制备的药物，未发现小鼠死亡或行为学、排泄物、分泌物等出现异常。给药组体质量与对照组比较无统计学差异。
[0076]
表1本发明药物组合物最大耐受量对小鼠体质量的影响(x
±
s)
[0077][0078][0079]
试验结束时处死小鼠，解剖肉眼检验各组小鼠主要脏器均未发现肉眼可见异常；从表2可见，实施例1药物对小鼠脏器指数无明显影响，与对照组比较差异无统计学差异。实施例1药物半数致死量(ld50)>34.55g原生药/kg。
[0080]
表2本发明药物组合物对小鼠脏器指数的影响(x
±
s)
[0081][0082]
上述结果中，本发明的药物组合物半数致死量(ld50)>34.55g原生药/kg，说明本发明药物毒性低。
[0083]
实验例2、本发明药物组合物和对小鼠肝损伤的影响
[0084]
1、实验方法
[0085]
将体质量18
‑
22g spf级昆明雄鼠66只，适应性喂养1d。按体重随机分为对照，模型，双环醇(100mg/kg)，实施例1的药物(12g原生药/kg、6g原生药/kg、3g原生药/kg)，共6组，按0.2ml/10g灌胃以上各组及等体积0.5％cmc
‑
na溶液，每天一次，连续十天。在连续给药三天后，按0.1ml/10g腹腔注射二甲基亚硝胺(dmn)溶液(10mg/kg)诱导肝损伤，对照组腹腔注射等体积生理盐水，隔天一次，连续三天。末次给药后，禁食不禁水14h，颈动脉取血，血清生化检测alt、ast、alp、tp、alb、tbil、dbil及tba肝功能指标；取肝脏称湿重，计算脏器指数；肝大叶10％甲醛固定，he染色后病理分析。
[0086]
实验结束后取肝脏，经10％福尔马林充分固定后，梯度酒精脱水、石蜡包埋，制成3
‑
5μm病理切片，在光学显微镜下观察肝脏组织学结构。
[0087]
标本分组及数量如下：
[0088][0089]
组织病理学评分：肝脏损伤组织学评分标准，参考文献内容并结合本实验实际情况，拟定“肝细胞空泡形成”及“肝细胞坏死”为观测指标。病变程度采用半定量分析：1级，轻微；2级，轻度；3级，中度；4级，重度；5级，严重。
[0090]
病变统计：依据组织病理学评分标准，对每例肝脏标本病变进行半定量评分，每例标本得分累计后，使用秩和检验，模型对照组与空白对照组及各给药组之间进行等级资料的两样本分析。所有检验均为双侧检验，α＝0.05，所有统计分析均在spss for windows 20.0软件下完成。
[0091]
2、实验结果
[0092]
如表3所示，实施例1药物组合物各剂量对dmn致肝损伤小鼠体质量和肝指数没有明显影响，与模型组比较差异无统计学差异，说明本发明药物组合物无明显肝毒性。
[0093]
表3本发明药物组合物对dmn致肝损伤小鼠体质量和肝脏的影响
[0094][0095]
与模型组比较，*p＜0.05**p＜0.01***p＜0.001(下同)。
[0096]
如表4所示，与模型组比较发现，对dmn致肝损伤小鼠肝功能指标，本发明药物组合物各剂量显著性降低alt指标，实施例1药物12g原生药/kg和6g原生药/kg显著性降低ast指标；实施例1药物12g原生药/kg显著性降低tbil和tba指标，具有统计学差异。上述结果说明：本发明药物组合物能够改善肝损伤小鼠肝功能。
[0097]
表4本发明药物组合物对dmn致肝损伤小鼠肝功能的影响
[0098][0099]
从图1可以看出，本发明药物组合物能够明显减少肝细胞空泡形成，减少肝细胞坏死。从对肝脏组织学结构的观察来看：
[0100]
(1)空白对照组：共10例标本，所有标本肝小叶结构清晰，肝细胞形态未见异常，间质未见增生及炎细胞浸润。
[0101]
(2)模型对照组：共12例标本，均可见肝细胞坏死(7例2级，5例3级)以及肝细胞内空泡形成(2例1级，3例3级，3例4级，4例5级)。表现出轻微至轻度的肝细胞坏死以及轻微至严重的肝细胞内空泡形成，与空白对照组比较，病变严重，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0102]
(3)双环醇100mg/kg组：共12例标本，均可见肝细胞坏死(8例1级，4例2级)以及肝细胞内空泡形成(3例1级，5例3级，4例4级)。表现出轻微至轻度的肝细胞坏死以及轻微至重度的肝细胞内空泡形成，与模型对照组比较，病变严重程度减轻，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0103]
(4)实施例1药物3g原生药/kg组：共10例标本，其中9例可见肝细胞坏死(5例1级，3例2级，1例4级)，10例标本均可见肝细胞内空泡形成(1例1级，6例2级，1例3级，2例4级)。表现出轻微至重度的肝细胞坏死以及轻微至重度的肝细胞内空泡形成，与模型对照组比较，病变严重程度减轻，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0104]
(5)实施例1药物6g原生药/kg组：共11例标本，均可见肝细胞坏死(6例1级，3例2级，2例3级)以及肝细胞内空泡形成(3例1级，2例2级，4例3级，1例4级，1例5级)。表现出轻微至中度的肝细胞坏死以及轻微至严重的肝细胞内空泡形成，与模型对照组比较，病变严重程度减轻，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0105]
(6)实施例1药物12g原生药/kg组：共9例标本，其中5例可见肝细胞坏死(2例1级，3例2级)，8例可见肝细胞内空泡形成(1例1级，2例2级，2例3级，3例4级)。表现出轻微至轻度的肝细胞坏死以及轻微至重度的肝细胞内空泡形成，与模型对照组比较，病变严重程度减轻，差异具有统计学意义(p<0.05)。
[0106]
具体数据见表5。
[0107]
表5.各组标本组织学分级结果
[0108][0109][0110]
*
：差异有统计学意义(p<0.05)。
[0111]
因此，从he染色后病例分析结果以及组织病理学检测结果可以看出，本发明药物
组合物可以保护肝细胞，减轻肝细胞坏死，减少肝细胞内空泡形成，具有防治肝损伤的作用。
[0112]
试验例3、本发明药物组合物对不同肝癌细胞系的影响
[0113]
1.材料与方法
[0114]
(1)实验材料
[0115]
实施例1的药物，人肝癌细胞hepg2及smmc
‑
7721为发明人实验室保存。
[0116]
1.2实验试剂
[0117]
dmem高糖培养基(gibco，美国)、胎牛血清(pan，德国)、cck8试剂盒(同仁化学，日本)、martige基质胶(bd公司，美国)、annexin
‑
vfitc细胞凋亡检测试剂盒(碧云天公司，中国)。
[0118]
(2)实验方法
[0119]
2.1药物水提取
[0120]
实施例1的药物碎成粉末，取粉末5g，加入8倍量超纯水，超声提取30min(功率250w，频率40khz)，冷却至室温，12000rpm离心10min，收集上清液，0.22um除菌滤器过滤除菌。
[0121]
2.2药物浓度筛选及细胞活力测定
[0122]
将处于对数生长期的肝癌细胞smmc
‑
7721及hepg2分别接种于96孔板，24小时后加入不同浓度实施例1的药物干预。根据说明书按照完全培养基∶cck8试剂＝10∶1的比例配制cck8工作液，充分混匀后，每孔加入100μl工作液，37℃孵箱孵育1h，酶标仪450nm检测吸光度的值(a值)。细胞活力＝(a加药
‑
a空白)/(a对照
‑
a空白)
×
100％。筛选出最佳药物浓度(hepg2最佳药物浓度为15mg/ml、smmc
‑
7721最佳药物浓度为9mg/ml)，同时根据最佳药物浓度的2倍及1/2倍设置高剂量、低剂量组，分别检测24小时、48小时、72小时细胞活力。
[0123]
2.3平板克隆实验
[0124]
将细胞按照3000
‑
5000个/孔接种于6孔板中，24小时后予以不同的药物浓度干预，每隔2
‑
3天换一次液，当细胞出现肉眼可见的克隆时终止克隆，pbs清洗一次，甲醇固定30min，0.1％的结晶紫染色20min，拍照记录。
[0125]
2.4细胞划痕实验
[0126]
将smmc
‑
7721及hepg2细胞接种于12孔板中，当细胞长到80％左右，进行药物干预24小时，待细胞长满后，在细胞内做直线划痕，pbs清洗，更换无血清培养基，观察24小时，48小时及72小时细胞愈合情况，并拍照记录。
[0127]
2.5细胞侵袭实验
[0128]
按照matrigel基质胶的说明书，将适量基质胶加入transwell小室中，放入37℃，5％co2孵箱中孵育1h凝固后取出。将经不同药物浓度药物干预后的smmc
‑
7721肝癌细胞按照1
×
105个/ml用无血清培养基制成细胞悬液加入上室中，下室加入600ul含20％胎牛血清的完全培养基，放入37℃，5％co2孵箱，24小时后取出，pbs清洗、甲醇固定、结晶紫染色，在显微镜下观察穿膜细胞数并拍照记录。
[0129]
2.6细胞迁移实验
[0130]
除未在上室中加入基质胶，其余步骤同细胞侵袭实验。
[0131]
2.7统计学方法
[0132]
所有数据均采用spss 22.0软件进行分析，符合正态分布的计量资料以表示，组间比较采用配对t检验，以p＜0.05为差异有统计学意义。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.0001。
[0133]
3.结果
[0134]
3.1本发明药物组合物对人肝癌细胞增殖、凋亡的影响
[0135]
与对照组相比，随着作用时间及药物浓度的升高，本发明药物抑制人肝癌细胞hepg2及smmc
‑
7721细胞活力(图2，**p＜0.01，***p＜0.0001)及增殖能力(图3)的作用愈强，差异具有统计学意义。说明本发明药物组合物能够抑制肝癌细胞增殖、促进肝癌细胞凋亡。
[0136]
3.2本发明药物组合物对人肝癌细胞迁移、侵袭能力的影响
[0137]
本发明药物组合物不同药物浓度干预均可降低hepg2及smmc
‑
7721的细胞愈合速度(图4)、抑制细胞的侵袭(图5)与迁移(图6)能力，且呈剂量依赖性，药物浓度越高，作用越强，差异具有统计学意义(*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.0001)。说明本发明药物组合物能够抑制肝癌细胞侵袭与迁移。
[0138]
综上，本发明提供了一种防治肝损伤及抑制肝癌细胞活性的药物组合物，毒性低，对肝细胞有修复作用，能够抑制肝癌细胞的进展，实现护肝和抗肝癌的作用，具有很好的临床应用前景。