一种醉茄素A和瘦素的组合物及其在制备预防和或治疗出血性脑卒中药物中的应用的制作方法

一种醉茄素a和瘦素的组合物及其在制备预防和或治疗出血性脑卒中药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种醉茄素a和瘦素的组合物及其在制备预防和或治疗出血性脑卒中药物中的应用，属于医药技术领域。


背景技术：

2.出血性脑卒中，是一种突然发病的血液循环障碍疾病，临床上表现为一过性或永久性功能障碍，是脑卒中重要类型，约为15%。中国人群脑出血致死患者约占脑血管病致死患者的61.7 %，其高发病率和死亡率已成为国人首要致死疾病。尽管脑出血病理生理研究已有巨大进步，但有效治疗手段尚局限于手术清除血肿、脱水、降颅压、神经保护。从疗效上看，无论是手术治疗还是药物干预，脑出血的病死率仍然居高，复发率、并发症、后遗症仍很多。因此，寻求新药、新靶点和新机制对出血性脑卒中的治疗极为重要。
3.醉茄素a (withaferina，wfa)是从天然植物醉茄的根部提取纯化后得到的含28 个碳的类固醇内酯类活性成分。一系列研究也证实了醉茄素类化合物在焦虑、认知障碍、失眠、帕金森综合症、阿尔茨海默病、中风、神经损伤等多种神经系统疾病中均显示了良好的神经保护作用（廖儒佳et al，中国药理学通报2018）。我们之前的研究也报道了醉茄素a可有效改善脑外伤后的炎症反应及血管内皮细胞的凋亡（廖儒佳 et al，european journal of pharmacology 2020）。上述结果均提示醉茄素a可能是有效预防、治疗出血性脑卒中的药物。但尚未有报道。
4.瘦素(leptin，lep) 是一种主要由脂肪细胞合成与分泌的重要激素，主要调控食物摄取和能量代谢平衡，同时也参与许多其它生理过程，包括免疫反应、氧化应激、内分泌、免疫和神经发育等。最早so
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derberg, stefan等的一个人群队列研究报道了瘦素可能是首次出血性脑卒中的重要风险因素（stroke，1994）。提高瘦素水平与脑出血比较差的预后密切相关。在小鼠出血性脑卒中模型中，外源性给予瘦素可增加脑水肿、神经功能缺陷，该作用被认为是瘦素促进stat3的激活，进而上调了cox
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2、inos等炎症相关因子表达水平产生的（j cereb blood flow metab，2013）。值得注意的，在该研究中，脑出血后给予stat3抑制剂却未能有效改善脑水肿，改善脑出血，这一矛盾的结果说明瘦素在脑出血的中的作用还有待进一步解析。
5.出血性脑卒中，有效治疗手段有限，从疗效上看，无论是手术治疗还是药物干预，脑出血的病死率仍然居高，复发率、并发症、后遗症仍很多。因此，寻求新药、新靶点和新机制对出血性脑卒中的治疗极为重要。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种含醉茄素a/瘦素的药物组合物在制备预防和或治疗出血性脑卒中药物中的应用，所述醉茄素a与瘦素在质量比为（20mg/kg : 4mg/kg）下能够防治出血性脑卒中，不仅明显降低各自使用剂量，更能达到优于单独使用的效果。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种含醉茄素a/瘦素的药物组合物，包括醉茄素a和瘦素，所述醉茄素a与瘦素的质量比为20mg/kg : 4mg/kg。
8.本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备防治出血性脑卒中的药物中的应用。
9.本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备增加神经前体细胞的数量的药物中的应用。
10.本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。
11.优选的，所述药物以醉茄素a和瘦素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。
12.优选的，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。
13.与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供的一种醉茄素a和瘦素的组合物及其在制备预防和或治疗出血性脑卒中药物中的应用，不仅为制备预防和/或治疗出血性脑卒中的药物提供了一种新来源，同时也发掘出了醉茄素a和瘦素的新的药用价值。
附图说明
14.图1 是醉茄素a和瘦素的化学结构式图及其作用示意图；图2是自体血注射诱导的出血性脑卒中模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素a（40mg/kg）、瘦素（8mg/kg）以及醉茄素a(20mg/kg)+瘦素(4mg/kg) 7天后，检测小鼠转棒实验结果统计图，n=12，
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p<0.01；图3是体血注射诱导的出血性脑卒中模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素a（40mg/kg）、瘦素（8mg/kg）以及醉茄素a(20mg/kg)+瘦素(4mg/kg) 7天后，检测小鼠足迹分析实验结果示意图和统计图, n=12，
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p<0.01, *
p<0.05；图4是体血注射诱导的出血性脑卒中模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素a（40mg/kg）、瘦素（8mg/kg）以及醉茄素a(20mg/kg)+瘦素(4mg/kg) 7天后，小鼠侧脑室区神经前体细胞数量, n=6，
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p<0.01, *
p<0.05；图5是自体血注射诱导的出血性脑卒中模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素a（40mg/kg）、瘦素（8mg/kg）以及醉茄素a(20mg/kg)+瘦素(4mg/kg) 7天后，小鼠出血周边区iba1阳性细胞水平，n=6，
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p<0.01, *
p<0.05。
具体实施方式
15.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
16.本发明提供了一种含醉茄素a/瘦素的药物组合物，所述醉茄素a与瘦素的质量比为20mg/kg : 4mg/kg（醉茄素a和瘦素的化学结构式图见图1）。
17.本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备防治出血性脑卒中的药
物中的应用。在本发明中，所述药物优选以醉茄素a和瘦素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。本发明对所述醉茄素a和瘦素在上述剂型中的用量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的用量即可。本发明对所述上述剂型使用的辅料或者辅助性成分的种类和含量没有特殊限定，采用常规即可。
18.本发明对所述醉茄素a和瘦素的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。
19.实施例1以下实施例所使用的小鼠为：7
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8周龄雄性spf级c57 bl/6小鼠，购买于长沙斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：scxk(湘)2016
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0002。动物饲养于桂林医学院附院医院spf级实验动物中心，实验动物室温度20～26℃(日温差≤4℃) ，湿度40％～70％，照明12h:12h明暗交替。
20.小鼠出血性脑卒中模型的建立：雄性c57bl/6小鼠通过10 % 水合氯醛（40 mg / kg）腹腔注射麻醉。麻醉后将小鼠置于脑立体定位仪上固定，根据小鼠脑图谱定位右侧脑基底节进针点，具体位置为前颅起，前后:
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0.0 mm，左右: + 1.0 mm, 深度：
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3. 0 mm。钻孔至硬脑膜，将小鼠尾部脱毛后，用酒精摩擦使尾部血管膨胀，同时按住尾部根部使血液不能回流使尾动脉血充盈，用消毒后的手术刀片将尾动脉割破，使血液滴落一张蜡纸上后用微量进样针抽取约20
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l的动脉血后以2
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l / min的速度匀速注血，待注射10
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l后留针5 min后将针向上拔出约0.5 mm后继续将余下的动脉血注射完毕后，留针10 min后退针。骨蜡封闭骨空并缝合头皮。对照组采用相同的方法从右侧基底节脑注入等量生理盐水，其余处理相同。
21.动物分组：假手术组、脑出血模型组、模型+醉茄素a（40 mg/kg）组，模型+瘦素（8 mg/kg）组，模型+醉茄素a（20 mg/kg）+瘦素（4 mg/kg）组，小鼠脑出血造模后，根据组别随机分配。
22.检测每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，各组行为学指标的变化情况。行为学指标检测：脑出血模型建立后，于各组药物注射第7天开始进行，在安静、适宜的环境中，进行小鼠行为学指标检测练习，按相关的行为学规范进行检测。
23.转动棒实验将小鼠移至测试房间，习惯化1h。将小鼠放置于测试仪器(转杆)上，初始速度为4rpm，逐渐加速，在5min时转速增加至40rpm后不再加速。记录小鼠从杆上掉落的时间。同一批小鼠每天测试3次，每次间隔20min，连续测试三天，取平均值。其中，与正常组相比，模型组行为学指标显著下调，出现明显的运动障碍；而醉茄素a+瘦素联合用药组能够显著恢复脑出血所引起的小鼠运动功能障碍，且效果优于单一给药组(结果见图2)。
24.足迹分析实验将小鼠移至测试房间，习惯化1h。将小鼠放置于全自动足迹分析检测器上，设定好参数后进行检测。同一批小鼠每天测试3次，每次间隔20min，取平均值。其中，与正常组相比，模型组错步次数显著增加，出现明显的运动障碍；而醉茄素a+瘦素联合用药组能够显著改善脑出血所引起的小鼠足迹运动失常，且效果优于单一给药组(结果见图3)。
25.小鼠侧脑室区神经前体细胞数量神经前体细胞是促进脑损伤后损伤区域的神经再生的关键细胞，其数量的高低显
示了脑损伤后的修复能力。出血性脑卒中模型建立后，检测每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，利用免疫组化技术各组小鼠侧脑室区神经前体细胞数量。结果为：与正常组相比，模型组小鼠侧脑室阳性神经前体细胞数量无显著变化。而醉茄素a+瘦素联合用药组能够显著升高侧脑室阳性神经前体细胞数量，且效果优于单一给药组(结果见图4)。
26.抑制出血性脑卒中后的神经炎症目前认为，神经炎症的发生与发展是出血性脑卒中进展的重要因素之一，神经炎症在出血性脑卒中进程中促进介导神经元进行性死亡的作用已被广泛证实。神经炎症的发生主要包括小胶质细胞激活等炎性反应。进一步这些中枢的炎性细胞通过多种机制相互作用，产生促炎细胞因子放大炎症信号，产生直接作用在神经元的神经毒素，最后加重出血性脑卒中损伤。出血性脑卒中模型建立后，检测每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，利用免疫组化技术各组小鼠出血周边区激活小胶质细胞的数量。结果为：与正常组相比，模型组小鼠出血周边区激活小胶质细胞的数量显著增加。而醉茄素a+瘦素联合用药组能够显著降低激活小胶质细胞的数量，且效果优于单一给药组(结果见图5)。