一种抗流感的中药组合物、中药提取物及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及抗流感药物技术领域，特别是涉及一种抗流感的中药组合物、 中药提取物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.流行性感冒是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，其临床特点为起 病急，全身中毒症状明显，如高热、头痛、全身酸痛、软弱无力等，而呼吸道 症状较轻。流行性感冒主要通过接触及飞沫传播，传染性强，轻症患者病程短， 常呈自限性，重症患者需进行药物治疗，一般可治愈。
3.中药是中国乃至世界的医学宝库，中药治疗病毒性感染的疾病已经有几千 年的历史。中药抗流感病毒疗效显著，抗流感病毒谱广，一般无耐药性产生， 比单一抗病毒药物治疗退热消炎，减轻上呼吸道症状更具优势。
4.然而，目前采用中药组合物治疗流感病毒引起的感冒，常常包含麻黄，例 如，公开号cn 107890503 a的专利公开了一种抗流感病毒的中药组合物，其中 是由藏麻黄与香附、矮紫堇、大黄等多味中药复配而成；再例如张仲景《伤寒 论》中记载的大青龙汤为一峻汗方，由麻黄、桂枝、炙甘草、苦杏仁、生姜、 大枣和石膏七味药组成。麻黄又是快速退热的关键中药，治疗感冒的中药配方 中，缺少了麻黄，发汗效果不好，不能达到快速降温的目的。


技术实现要素：

5.为了解决上述问题，本发明提供了一种抗流感的中药组合物、中药提取物 及其制备方法和应用。本发明提供的抗流感中药组合物在不含麻黄的条件下依 然对流行性感冒具有很好的治疗效果，达到快速降温的目的。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种抗流感的中药组合物，包括以下重量份的组分：
8.羌活5～10份、防风5～10份、荆芥穗3～8份、桂枝3～8份、香薷3～8份、 苍术3～8份、胡椒3～8份、野菊花3～6份、青蒿3～6份、知母3～6份、青风藤 3～6份和甘草2～5份。
9.本发明还提供了一种抗流感的中药提取物的制备方法，包括以下步骤：
10.1)将对应上述中药组合物的中药粉进行超临界co2萃取，得到第一挥发油 和中药残渣；
11.2)将所述中药残渣在体积浓度为95％乙醇水溶液参与下进行超临界co2萃取，得到第二挥发油；
12.将所述第一挥发油和第二挥发油混合，得到抗流感的中药提取物。
13.优选的，步骤1)和步骤2)中所述超临界co2萃取的萃取压力分别为 25～32mpa，萃取温度分别为35～45℃。
14.优选的，步骤1)和步骤2)中所述超临界co2萃取的co2萃取流量分别为 25l/h/kg。
15.优选的，步骤1)中所述超临界co2萃取的萃取时间为55～65min，分离压 力为8～
10mpa，分离温度为48～52℃。
16.优选的，步骤2)中所述超临界co2萃取的萃取时间为35～45min，分离压 力为4～6mpa，分离温度为33～37℃。
17.优选的，步骤2)中所述乙醇水溶液与步骤1)中所述中药粉的体积重量比 为(0.25～0.5)l:1kg。
18.本发明还提供了上述中药组合物或利用上述制备方法制备得到的中药提取 物在制备治疗流行性感冒的药物中的应用。
19.本发明还提供了上述中药组合物或利用上述制备方法制备得到的中药提取 物在制备具有多种功效药物中的应用，所述多种功效包括抑菌、消炎、退热、 镇痛和调节免疫中的一种或多种。
20.本发明还提供了一种抗流感的中药颗粒，包括利用上所述制备方法制备得 到的中药提取物和颗粒辅料。
21.有益效果：
22.本发明提供了一种抗流感的中药组合物，包括以下重量份的组分：羌活5～10 份、防风5～10份、荆芥穗3～8份、桂枝3～8份、香薷3～8份、苍术3～8份、胡 椒3～8份、野菊花3～6份、青蒿3～6份、知母3～6份、青风藤3～6份和甘草2～5 份。本发明提供的中药组合物配方以羌防剂为主，根据流感常见风寒表实又兼 挟湿邪阻滞的临床特点，并加强和中化湿之品，共取解表散寒疏风祛湿之功， 用治流感风寒挟湿之证；其中羌活和防风为君药，发挥解表散寒祛风除湿作用； 荆芥穗、桂枝、香薷、苍术和胡椒为臣药，发挥发汗解表兼化湿和中、祛风止 痛的作用；知母、青蒿、野菊花和青风藤为佐药，其中青蒿透邪外达、知母泻 热润肺、野菊花清热解毒既佐助解热之功又可佐制君臣诸药辛温之性；青风藤 祛风通络助疏风散邪止痛之功；甘草作为使药，发挥清热解毒，调和诸药的作 用。同时胡椒和青风藤在配方中具有促进患者发汗，快速退烧的作用。实验表 明，本发明提供的中药组合物在患者给药1h后即可实现抑制体温上升，实现快 速退烧。
具体实施方式
23.本发明提供了一种抗流感的中药组合物，包括以下重量份的组分：
24.羌活5～10份、防风5～10份、荆芥穗3～8份、桂枝3～8份、香薷3～8份、 苍术3～8份、胡椒3～8份、野菊花3～6份、青蒿3～6份、知母3～6份、青风藤 3～6份和甘草2～5份。
25.如无特殊说明，本发明对所述中药组合物的各组分来源没有特殊要求，采 用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
26.本发明提供的中药组合物包括5～10重量份的羌活，优选为6～9份，更优选 为7份。本发明所述羌活具有辛温解表散寒、祛湿和止痛的作用，主要用于风 寒感冒。
27.本发明提供的中药组合物包括5～10重量份的防风，优选为6～9份，更优选 为8份。本发明所述防风具有祛风解表，胜湿止痛，止痉等功效；主要用于感 冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风等病证。
28.本发明所述羌活和防风为君药，共同发挥解表散寒祛风除湿作用。
29.本发明提供的中药组合物包括3～8重量份的荆芥穗，优选为4～7份，更优 选为5份。本发明所述荆芥穗具有发汗祛寒、抗菌、消炎、止血和解表的作用； 主要应用于感冒、头
痛和鼻塞等情况。
30.本发明提供的中药组合物包括3～8重量份的桂枝，优选为4～7份，更优选 为5份。本发明所述桂枝性温，味辛、甘，具有发汗解肌和温经通脉之功效。
31.本发明提供的中药组合物包括3～8重量份的香薷，优选为4～7份，更优选 为5份。本发明所述香薷具有发汗解表、和中利湿的作用。
32.本发明提供的中药组合物包括3～8重量份的苍术，优选为4～7份，更优选 为5份。本发明所述苍术性味苦、辛、温，具有燥湿健脾，祛风湿的功效。
33.本发明提供的中药组合物包括3～8重量份的胡椒，优选为4～7份，更优选 为5份。本发明所述胡椒，味辛，性热；归胃、大肠经；具有温中散寒，温煦 中焦，祛脾胃中焦之寒，散胃中寒邪而开胃的功效，还有下气行滞，消痰宽胸 的功效。
34.本发明所述荆芥穗、桂枝、香薷、苍术和胡椒为臣药，共同发挥发汗解表 兼化湿和中、祛风止痛的作用。在本发明中，所述中药组合物中荆芥穗、桂枝、 香薷、苍术和胡椒的重量份优选相同。
35.本发明提供的中药组合物包括3～6重量份的野菊花，优选为3.5～5份，更优 选为4份。本发明所述野菊花具有清热解毒和舒风凉肝的作用。
36.本发明提供的中药组合物包括3～6重量份的青蒿，优选为3.5～5份，更优选 为4份。本发明所述青蒿具有凉血止血、清热解毒和抗疟疾的作用。
37.本发明提供的中药组合物包括3～6重量份的知母，优选为3.5～5份，更优选 为4份。本发明所述所述知母可以滋阴润燥、补肾，用于阴虚火旺、肺肾亏虚 所致的骨蒸潮热，可以治疗盗汗、心烦，有滋阴降火的作用。
38.本发明提供的中药组合物包括3～6重量份的青风藤，优选为3.5～5份，更优 选为4份。本发明所述青风藤具有祛风除湿、利尿消肿的功效。
39.本发明所述知母、青蒿、野菊花和青风藤为佐药，其中青蒿透邪外达、知 母泻热润肺、野菊花清热解毒既佐助解热之功又可佐制君臣诸药辛温之性；青 风藤祛风通络助疏风散邪止痛之功。
40.本发明提供的中药组合物包括2～5重量份的甘草，优选为3.5～4.5份，更优 选为4份。本发明所述甘草为使药，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳和止 痛的功效。
41.在本发明中，所述中药组合物中知母、青蒿、野菊花、青风藤和甘草的重 量份优选相同。
42.本发明提供的中药组合物无需使用麻黄仍能快速降温，对于流感有突出的 治疗效果。
43.本发明还提供了一种抗流感的中药提取物的制备方法，包括以下步骤：
44.1)将对应上述中药组合物的中药粉进行超临界co2萃取，得到第一挥发油 和中药残渣；
45.2)将所述中药残渣在体积浓度为95％乙醇水溶液参与下进行超临界co2萃取，得到第二挥发油；
46.将所述第一挥发油和第二挥发油混合，得到抗流感的中药提取物。
47.本发明在萃取前优选将上述的中药组合物粉碎，得到中药粉。在本发明中， 所述中药粉的粒径优选为20～60目，更优选为40目。本发明对所述粉碎的方法 没有特殊要求，
采用本领域技术人员所熟知的粉碎方法即可。
48.得到中药粉后，将对应上述中药组合物的中药粉进行超临界co2萃取，得 到第一挥发油和中药残渣。在本发明中，步骤1)中所述超临界co2萃取的萃取 压力优选为25～32mpa，更优选为29mpa；步骤1)中所述超临界co2萃取的萃 取温度优选为35～45℃，更优选为45℃；步骤1)中所述超临界co2萃取的co2萃取流量优选为25l/h/kg；步骤1)中所述超临界co2萃取的萃取时间优选为 55～65min，更优选为60min；步骤1)中所述第一挥发油和中药残渣的分离压力 优选为8～10mpa，更优选为9mpa；步骤1)中所述第一挥发油和中药残渣的分 离温度优选为48～52℃，更优选为50℃。本发明通过适宜的萃取条件可以制备 得到更多具有解表发汗作用的异欧前胡素和桂皮醛，提高了中药提取物解表发 汗的功效。
49.得到第一挥发油和中药残渣后，本发明将所述中药残渣在体积浓度为95％ 乙醇水溶液参与下进行超临界co2萃取，得到第二挥发油；将所述第一挥发油 和第二挥发油混合，得到抗流感的中药提取物。在本发明中，步骤2)中所述超 临界co2萃取的萃取压力优选为25～32mpa，更优选为29mpa；步骤2)中所述 超临界co2萃取的萃取温度优选为35～45℃，更优选为45℃；步骤2)中所述超 临界co2萃取的co2萃取流量优选为25l/h/kg；步骤2)中所述超临界co2萃 取的萃取时间优选为35～45min，更优选为40min；步骤2)中所述第二挥发油和 中药残渣的分离压力优选为4～6mpa，更优选为5mpa；步骤2)中所述第二挥 发油和中药残渣的分离温度优选为32～37℃，更优选为35℃；步骤2)中所述乙 醇水溶液与步骤1)中所述中药粉的体积重量比优选为(0.25～0.5)l:1kg，更有 选为0.35l:1kg。本发明通过二次萃取可以提高中药组合物的利用率，适宜的萃 取条件可以提高挥发油的出油率以及提高胡薄荷酮、异欧前胡素、苍术素、胡 椒碱和桂皮醛等主要物质的转移率，从而提供中药组合物抗流感的功效。
50.本发明还提供了上述中药组合物或利用上述制备方法制备得到的中药提取 物在制备治疗流行性感冒的药物中的应用。本发明提供的抗流感中药组合物或 中药提取物在不含麻黄的条件下依然对流行性感冒具有很好的治疗效果，达到 快速降温的目的。
51.本发明还提供了上述中药组合物或利用上述制备方法制备得到的中药提取 物在制备具有多种功效药物中的应用，所述多种功效包括抑菌、消炎、退热、 镇痛和调节免疫中的一种或多种；所述调剂免疫优选包括抑制迟发性过敏反应。 本发明提供的抗流感中药组合物或中药提取物具有明显的抑菌、消炎、退热、 镇痛和抑制迟发性过敏的功效。
52.本发明还提供了一种抗流感的中药颗粒，包括利用上述制备方法制备得到 的中药提取物和颗粒辅料。本发明对所述颗粒辅料的组分及用量配比没有特殊 要求，采用本领域技术人员所熟知的颗粒辅料即可。
53.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种抗流感的中 药组合物、中药提取物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理 解为对本发明保护范围的限定。
54.实施例1
55.一种抗流感的中药组合物，由以下组分组成：羌活175g(7重量份)、防 风200g(8重量份)、荆芥穗125g(5重量份)、桂枝125g(5重量份)、香 薷125g(5重量份)、苍术125g(5重量份)、胡椒125g(5重量份)、野菊 花100g(4重量份)、青蒿100g(4重量份)、知母100g(4重量份)、青风 藤100g(4重量份)和甘草100g(4重量份)；上述各组分均购自河北仁心药 业有限
公司。
56.实施例2
57.一种抗流感的中药组合物，由以下组分组成：羌活50g(5重量份)、防风 50g(5重量份)、荆芥穗30g(3重量份)、桂枝30g(3重量份)、香薷30g (3重量份)、苍术30g(3重量份)、胡椒30g(3重量份)、野菊花30g(3 重量份)、青蒿30g(3重量份)、知母30g(3重量份)、青风藤30g(3重量 份)和甘草20g(2重量份)；上述各组分均购自河北仁心药业有限公司。
58.实施例3
59.一种抗流感的中药组合物，由以下组分组成：羌活100g(10重量份)、防 风100g(10重量份)、荆芥穗80g(8重量份)、桂枝80g(8重量份)、香薷 80g(8重量份)、苍术80g(8重量份)、胡椒80g(8重量份)、野菊花60g (6重量份)、青蒿60g(6重量份)、知母60g(6重量份)、青风藤60g(6 重量份)和甘草50g(5重量份)；上述各组分均购自河北仁心药业有限公司。
60.实施例4
61.一种抗流感的中药颗粒，该中药颗粒的制备方法为：
62.1)将实施例1中的中药组合物粉碎，得到中药粉(粒径20目)；
63.2)将中药粉进行两次超临界co2萃取(超临界co2萃取设备由华安科研仪 器有限公司生产，型号为ha222
‑
50
‑
07)，萃取压力均为29mpa，萃取温度均 为45℃，co2萃取流量为25l/h/kg；第一次分离压力为9mpa，温度为50℃；第 二次分离压力为5mpa，温度为35℃；第一次co2超临界萃取1h，第二次加入 体积浓度为95％乙醇(乙醇溶液与中药粉的体积重量比为0.5l:1kg，乙醇购自 济南联顺化工有限公司)超临界萃取40min，将两次萃取得到的萃取液合并，得 到中药提取物；
64.3)将0.23ghpmce50(羟丙基甲基纤维素e50)和7.44g80％(重量浓度) 乙醇溶液放置于搅拌罐中，混合均匀，无结块，呈澄清透明状，配制成 3wt.％hpmc溶液，备用；
65.4)将步骤2)得到的中药提取物5.81g和3wt.％hpmc溶液7.67kg投入湿 法制粒机中，开启搅拌，转速65rpm，搅拌30min；
66.5)将称量好的二氧化硅5.81g，加入到步骤4)中的湿法制粒机中，开启搅 拌，转速65rpm，搅拌25min，得到混合粉；
67.6)将步骤5)制备的混合粉置于热风干燥箱中，45℃烘干(水分≤2％)；
68.7)干燥后的混合粉过80目筛，得到包合粉；
69.8)取步骤7)制备的包合粉11g、乳糖26.02g、黄原胶0.5g、柠檬酸1.88g 和三氯蔗糖0.19g投入湿法制粒机中，搅拌20min，至混合均匀，转速50rpm， 搅拌5min以上，呈一握成团，一摁即散的状态，得软材，备用；
70.9)步骤8)制备的软材过摇摆制粒机，10目筛制粒，于热风干燥箱中干燥 (45～50℃，水分≤7％)，10目筛整粒，得到中药颗粒。
71.实施例5
72.一种与实施例4相似的抗流感的中药颗粒，唯一区别在于，萃取温度均为 40℃。
73.实施例6
74.一种与实施例4相似的抗流感的中药颗粒，区别在于，萃取温度均为35℃， 萃取压力均为25mpa。
75.实施例7
76.一种与实施例4相似的抗流感的中药颗粒，唯一区别在于，第二次加入体 积浓度为95％乙醇，其中乙醇溶液与中药粉的体积重量比为0.2l:1kg。
77.实施例8
78.一种与实施例4相似的抗流感的中药颗粒，唯一区别在于，第二次加入体 积浓度为95％乙醇，其中乙醇溶液与中药粉的体积重量比为0.3l:1kg。
79.实施例9
80.一种与实施例4相似的抗流感的中药颗粒，唯一区别在于，第二次加入体 积浓度为95％乙醇，其中乙醇溶液与中药粉的体积重量比为0.35l:1kg，萃取得 到的中药提取物命名为中药感冒药二号。
81.应用例1
82.采用高效液相色谱法(hplc)，测定实施例4～5中步骤2)萃取得到的中 药提取物中挥发油出油率以及异欧前胡素、胡薄荷酮、胡椒碱、苍术素和桂皮 醛的检出量和转移率，测定结果见表1和表2，其中出油率＝超临界提取物重量/ 药材投料量*100％；有效物质检出量和转移率根据中国药典(2010版)高效液 相色谱法测定(通则0512)。
83.表1不同萃取条件下的出油率和有效物质检出量
[0084][0085]
表2不同萃取条件下的有效物质转移率
[0086][0087]
由表1和表2可知，萃取参数为29mpa/45℃时，出油率、桂皮醛检出量和 转移率较高，在25mpa/35℃时，胡薄荷酮和苍术素检出量和转移率较高，因异 欧前胡素和桂皮醛与本药物组合物的解表发汗有重要作用，因此，实施例1中 步骤2)的萃取条件为提取中药活性成分的最佳工艺参数。
[0088]
应用例2
[0089]
一种与实施例4相似的抗流感的中药颗粒，唯一区别在于，步骤2)的萃取 工艺为：将中药粉进行三次超临界co2萃取(超临界co2萃取设备由华安科研 仪器有限公司生产，型号为ha222
‑
50
‑
07)，萃取压力均为29mpa，萃取温度 均为45℃，co2萃取流量为25l/h/kg；第一次分离压力为9mpa，温度为50℃； 第二次分离压力为5mpa，温度为35℃；第三次分离压力为5mpa，温度为35℃； 第一次co2超临界萃取1h，第二次加入体积浓度为95％乙醇(乙醇溶液与中药 粉的体积重量比为0.35l:1kg，乙醇购自济南联顺化工有限公司)超临界萃取 40min，第三次加入体积浓度为95％乙醇(乙醇溶液与中药粉的体积重量比为 0.15l:1kg，乙醇购自济南联顺化工有限公司)超临界萃取40min，将三次萃取 得到的萃取液合并，得到
中药提取物。
[0090]
采用高效液相色谱法(hplc)，测定应用例2中步骤2)第一次萃取、第 二次萃取和第三次萃取得到的不同中药提取物中挥发油出油率以及异欧前胡 素、胡薄荷酮、胡椒碱、苍术素和桂皮醛的检出量和转移率，测定结果见表3 和表4；其中出油率＝超临界提取物重量/药材投料量*100％；有效物质检出量和 转移率根据中国药典(2010版)高效液相色谱法测定(通则0512)。
[0091]
表3三次萃取条件下的出油率和有效物质检出量
[0092][0093][0094]
表4三次萃取条件下的有效物质转移率
[0095][0096]
由表3和表4可知，第三次加入95％乙醇(乙醇与中药粉的体积重量比为 0.15l:1kg)超临界萃取后，出油率、胡薄荷酮、异欧前胡素、苍术素、胡椒碱 和桂皮醛检出量较少，因此从萃取成本和萃取时间综合考虑，确定最适宜的萃 取次数为2次。
[0097]
应用例3
[0098]
采用高效液相色谱法(hplc)，测定实施例7～9中步骤2)两次萃取得到 的中药提取物中挥发油出油率以及异欧前胡素、胡薄荷酮、胡椒碱、苍术素和 桂皮醛的检出量和转移率，以挥发油出油率(按式i计算)以及异欧前胡素、胡 薄荷酮、胡椒碱、苍术素和桂皮醛的总量(按式i分别计算各功效成分总量)为 评价指标，比较三次萃取的差异，测定结果见表5～7；其中出油率＝超临界提取 物重量/药材投料量*100％；有效物质检出量和转移率根据中国药典(2010版) 高效液相色谱法测定(通则0512)。
[0099]
出油率总量(％)＝纯co2第一次萃取出油率(％)+95％乙醇
‑
纯co2第二 次萃取出油率(％)
ꢀꢀ
式i
[0100]
各功效成分的总量＝第一次和第二次提取出功效成分/中药粗粉中所述功能 成分的总质量
×
100％
ꢀꢀ
式ii
[0101]
表5实施例7中步骤2)萃取物的测定结果
[0102][0103]
表6实施例8中步骤2)萃取物的测定结果
[0104][0105][0106]
表7实施例9中步骤2)萃取物的测定结果
[0107][0108]
由表5～7的结果可知，实施例9中萃取得到的中药提取物在出油率以及胡 薄荷酮、异欧前胡素、苍术素和胡椒碱的检出量和转移率较高，综合考虑实施 例9中步骤2)的萃取条件为提取中药活性成分的最佳工艺参数。
[0109]
应用例4
[0110]
本发明实施例9制备的中药提取物(记为中药感冒药二号)与市场上抑菌 药物的体外抗菌对比。
[0111]
通过体外最小抑茵浓度试验(mic)和最小杀菌浓度试验(mbc)来考察受试 物中药感冒药二号在不同浓度作用下对金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、大肠杆菌(escherichiacoli)、肺炎 克雷伯菌(klebsiella)以及流感嗜血杆菌(moraxellacatarrhalis)的抗菌能力。 分析受试物抗菌能力及抗菌谱筛选，为受试物中药感冒药二号治疗感冒及流行 性感冒的药物研究提供临床前实验数据。
[0112]
试验方法
[0113]
受试物剂量设计和给药方案
[0114]
针对每个菌株的抗菌试验共设22组，即：溶剂对照组；阳性对照组；阳性 药对照1～10组；受试物a～j组。详见表8。
[0115]
表8组别、剂量设计一览表
[0116]
组号受试物或对照品名称受试物浓度1：1混匀后终浓度1溶剂对照组002阳性对照组003～12阳性药对照1～10组0.49～100(μg/ml)0.977～50.00(μg/ml)13～22中药感冒药二号a～j组1.25～625.00(mg/ml)0.61～312.50(mg/ml)
[0117]
受试物配置方法：
[0118]
1)中药感冒药二号贮存液：取1g原液于10ml容量瓶中，加入pbs，配置 成10ml体积，浓度为625mg/ml。10ml注射器吸取药液，用0.22μm过滤器过滤 灭菌。无菌管密封，详细填写配制标签，于
‑
20℃保存。使用时提前30分钟拿出 复温，震荡混匀。各浓度受试物通过二倍稀释法进行配置，具体配制方法如表9。
[0119]
表9：感冒药二号的微量二倍肉汤稀释法
[0120][0121]
注：
①
受试物的药物配制采用二倍稀释法配制。
[0122]
2)阳性药配置方法：用天平称取1mg对应阳性药，置于10ml容量瓶中， 用pbs溶解定容，制得浓度为0.1mg/ml的阳性药母液。0.22μm滤膜过滤除菌， 无菌管密封，详细填写配制标签，放置于2
‑
8℃冰箱暂存，有效期为1周。使用 时提前30分钟拿出复温，震荡混匀。各浓度受试物通过二倍稀释法进行配置， 具体配制方法见表10和表11。
[0123]
表10各受试菌的相应阳性对照及浓度
[0124]
细菌名称阳性对照金黄色葡萄球菌头孢克肟铜绿假单胞菌头孢拉定大肠杆菌头孢呋辛钠肺炎克雷伯菌头孢拉定流感嗜血杆菌头孢呋辛钠
[0125]
表11阳性药的微量二倍肉汤稀释法
[0126][0127][0128]
菌液制备
[0129]
将活化的细菌在平板培养基上，分区划线种植，并在37℃的环境下培养24h。 挑选单菌落，接种至含5ml液体营养基试管中，放置恒温培养箱中35
±
2℃200 rpm培养16～20h。于无菌操作台上，取少量细菌培养液测定od值(od600＝0.5 时浓度一般为10^8/ml)，用相应的营养肉汤液体培养基稀释100倍调整浓度至1～ 2
×
10^6cfu/ml备用。
[0130]
mic测定
[0131]
于无菌超净台上，靠近酒精灯，用排枪在96孔板每个孔加入对应细菌的 液体营养基100μl。在a/b/c三排的第一孔加配好的药物储存液100μl，然后 对药物进行二倍稀释。即，第一孔中加入药液后用移液枪充分吹打(至少三 次以上)使药物与肉汤充分混匀，然后吸取100μl加入第二孔再充分吹打使 之与肉汤充分混匀，照此重复直至最后一孔，第12列吸出100ul扔掉(此时 每孔含100μl含药培养基)。再在每一孔中加入稀释好的菌液100μl，重复三 孔(a/b/c三排样品)。在同一排的d/e/f三排以同样的操作，做阳性药对 照(加菌液加阳性药液)。在同一块板上的g、h排上做一排阴性对照(仅 加空白肉汤不加菌液)以及阳性对照(加菌液不加药液)。将96孔板放入 37℃恒温培养箱35
±
2℃200rpm培养16～20小时后，观察结果。若有菌生 长孔板底部会有白色沉淀。
[0132]
mic值的判定：96孔板上横排中未有沉淀的最后一孔所对应的浓度便为 该药的mic值。
[0133]
mbc测定
[0134]
试验当天制作24孔固态培养基平皿，将肉眼未见细菌生长的孔(符号为
ꢀ‑
或
‑
/+)内菌液轻柔吹打混匀后，吸取菌液，接种在不含抗菌药物的24孔固 态培养基平皿上，接种环涂布均匀，再经35
±
2℃培养18～48h培养后，进行 菌落计数。琼脂平皿上未见细菌菌落生长或菌落数少于5的药物浓度为最低 杀菌浓度。每个浓度3个复板。
[0135]
实验结果
[0136]
不同组别的给药浓度见表12，不同药物浓度下对不同菌种培养后的mic 和mbc的测定结果见表13～表17。
[0137]
表12不同组别的给药浓度
[0138][0139][0140]
表13不同药物浓度下对金黄色葡萄球菌培养后的mic的测定结果
[0141][0142]
表14不同药物浓度下对铜绿假单胞菌培养后的mic和mbc的测定结果
[0143][0144]
表15不同药物浓度下对肺炎克雷伯菌培养后的mic和mbc的测定结果
[0145][0146][0147]
表16不同药物浓度下对大肠杆菌培养后的mic测定结果
[0148][0149]
表17不同药物浓度下对流感嗜血杆菌培养后的mic和mbc的测定结果
[0150][0151]
注：表13～17中的
“‑”
表示澄清；“+”表示浑浊有沉淀；'
‑
/+表示极微量沉淀
[0152]
由表13～17可知，感冒药二号对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)和大 肠杆菌(肠杆菌)未检测出抑菌活性，感冒药二号在≧156.25mg/kg浓度对铜 绿假单胞菌(非发酵革兰
氏阴性杆菌)具有抑菌活性；在≧78.13mg/kg浓度 对肺炎克雷伯菌(革兰阴性杆菌)具有抑菌活性，在≧78.13mg/kg浓度对流 感嗜血杆菌(革兰阴性杆菌)具有抑菌活性。在本实验室条件下，感冒药二 号对上述细菌均未检测出杀菌活性。
[0153]
应用例5
[0154]
本发明实施例9制备的中药提取物(中药感冒药二号)与市场上感冒药物 对内毒素致热大鼠模型的作用对比。
[0155]
试验目的
[0156]
通过在动物体内注射脂多糖(lipopolysaccharides,lps)致热形成内源性致 热原，诱导动物发热建立发热动物模型，观察受试物的解热作用，为受试物中 药感冒药二号治疗感冒及流行性感冒的药物研究提供临床前实验数据
[0157]
试验方案
[0158]
受试物剂量设计和给药方案见表18
[0159]
表18：解热试验组别、剂量设计一览表
[0160][0161]
剂量设计理由
[0162]
参考《药理实验方法学》、《中药药理研究方法学》(第三版)及委托方 提供的与受试物相关的信息和相关文献资料，设计本专题试验的药物剂量和浓 度：
[0163]
(1)中药感冒药二号临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量17.772g， 体重按70kg计算，根据体重
‑
体表面积转换折算大鼠剂量为1.60g/kg。本研究 解热试验中药感冒药二号的剂量为临床剂量等效剂量的1/4、1/2、1倍，即0.40、 0.80、1.60g/kg。
[0164]
(2)cgsn
‑
01临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量20.22g，体重按 70kg计算，根据体重
‑
体表面积转换折算大鼠剂量为1.827g/kg。本研究解热试 验cgsn
‑
01冻干粉作为提取工艺对照组，剂量设置为临床剂量的等效剂量，即 1.827g/kg。
[0165]
(3)连花清瘟颗粒：连花清瘟颗粒在成人临床用量为18g/70kg，本项目 按照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到大鼠约为1.62g/kg。
[0166]
(4)对乙酰氨基酚片：对乙酰氨基酚片在成人临床用量为0.5g/70kg，本项 目按照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到大鼠约为0.045 g/kg。
[0167]
动物筛选与分组
[0168]
实验前选用筛选过的体温合格大鼠，根据肛温、性别均衡随机分为正常对 照组、模型对照组、中药感冒药二号的低、中、高剂量组、阳性对照组(连花 清瘟颗粒)、阳性对照组(对乙酰氨基酚片)、cgsn
‑
01对照组，每组10只大 鼠，雌雄各半。每次测量肛温前均用凡士林润滑体温计，且每次插入体温计时 深度均为2cm。
[0169]
试验方法与观测指标
[0170]
试验当日各组sd大鼠进行肛温测定，测定肛温前让大鼠排空粪便，每只 sd大鼠测定体温2次，取其平均值作为基础体温。测量完成后，除正常对照组 外，其余各组于大鼠颈背部进行lps溶液皮下注射(剂量150μg/kg，注射体积 2ml/kg)，正常对照组注射等体积生理盐水。各组注射造模后即刻按10ml/kg体 积灌胃给药，正常对照组和模型对照组给予等量纯水灌胃。试验中具体观察和 检查指标包括以下内容：
[0171]
体温测定
[0172]
于给药后1、2、3、4、5、6、7、8小时测量大鼠的肛温。
[0173]
实验结果见表19。
[0174]
表19不同组别大鼠与造模前肛温变化测定结果
[0175]
[0176][0177]
注：与正常对照组相比，“#”表示p<0.05，"##"表示p<0.01；与模型对照组相比，"*"表 示p<0.05，"**"表示p<0.01。
[0178]
由表19可知，本发明制备的感冒药二号具有明显的解热药效，且与浓度呈 正相关，当前数据显示其解热药效优于莲花清瘟颗粒。
[0179]
应用例6
[0180]
本发明实施例9制备的中药提取物(中药感冒药二号)与市场上感冒药物 对角叉菜胶致大鼠足肿胀模型的作用对比。
[0181]
试验目的
[0182]
通过足底注射角叉菜胶溶液，建立角叉菜胶致大鼠炎症模型，观察受试物 对炎症动物模型的作用，为受试物中药感冒药二号治疗感冒及流行性感冒的药 物研究提供临床前实验数据。
[0183]
试验方案
[0184]
受试物剂量设计和给药方案见表20。
[0185]
表20：抗炎试验组别、剂量设计一览表
[0186][0187]
剂量设计理由与应用例5中设计理由相似，唯一区别在于，应用例5中的 (4)对乙酰氨基酚片替换为吲哚美辛胶囊，剂量设计如下：
[0188]
(4)吲哚美辛胶囊：吲哚美辛肠溶片在成人临床用量为75mg/70kg，本项 目按照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到大鼠约为 6.75mg/kg。文献中阳性对照吲哚美辛用于大鼠角叉菜胶致足跖肿胀模型的剂量 为7mg/kg。综合换算结果与参考文献，选取7mg/kg为本项目给药剂量。
[0189]
动物筛选与分组
[0190]
试验前一天选用足容积筛选过的合格动物，根据足容积均衡随机分为正常 对照组、模型对照组、中药感冒药二号的低、中、高剂量组、阳性对照组(连 花清瘟颗粒)、阳性对照组(吲哚美辛胶囊)、cgsn
‑
01对照组，每组9只雄 性大鼠。
[0191]
试验方法与观测指标
[0192]
试验第一天先用足跖容积测量仪测量右后足的容积，连续测两次，取其平 均值作为基础容积。随后模型对照组和受试物组动物右后足跖掌腱筋膜下注射 1％角叉菜胶混悬液，每只0.1ml；空白对照组动物注射等体积的生理盐水；各 组注射角叉菜胶后立即按10ml/kg体积灌胃给予相应受试物。空白对以及模型 对照照组组按照10ml/kg给予溶灌胃剂。给药后观察和检查以下指标：
[0193]
足跖容积测定
[0194]
分别于注射后1、2、3、4、5、6h测量各组动物右后足的足跖容积，连续 测2次，取其平均值作为造模后的足跖容积。根据致炎后不同时间点的足跖容 积，计算足跖肿胀率及肿胀抑制率，并与模型组作比较，进行统计学分析。当 阳性对照组和受试物不同剂量组大鼠
足趾肿胀率明显低于模型组，则表示该药 物对角叉菜胶致大鼠足趾肿胀模型具有抗炎作用。
[0195]
肿胀率e(％)＝(vt
‑
vn)/vn
×
100％
[0196]
其中vn和vt分别代表用致炎剂前后足趾容积值
[0197]
实验结果见表21.
[0198]
表21不同组别大鼠与造模前比肿胀率测定结果
[0199][0200]
注：模型对照组相比，“#”表示p<0.05，"##"表示p<0.01。
[0201]
由表21可知，本发明制备的感冒药二号在临床计量等效、1/2以及1/4计量浓 度下对交叉菜胶诱发的足肿胀模型均具有明显的抗炎药效。与阳性对照药相比 较，抗炎药效与已上市中药感冒药连花清瘟颗粒想比较具有明显优势，且起效 时间迅速。
[0202]
应用例7
[0203]
本发明实施例9制备的中药提取物(中药感冒药二号)与市场上感冒药物对 二甲苯致小鼠耳肿胀模型的作用对比。
[0204]
试验目的
[0205]
小鼠耳廓涂布二甲苯，对皮肤黏膜产生刺激作用，诱发急性炎症模型，给 予受试物中药感冒药二号，观察中药感冒药二号对小鼠耳廓肿胀，水肿后耳重 的影响。为受试物中药感冒药二号抗炎消肿，治疗感冒及流行性感冒引发的局 部急性炎症反应的药物研究
提供临床前实验数据。
[0206]
试验方案
[0207]
受试物剂量设计和给药方案见表22.
[0208]
表22：试验组别、剂量设计一览表
[0209][0210]
剂量设计理由
[0211]
参考《药理实验方法学》、《中药药理研究方法学》(第三版)及委托方 提供的与受试物相关的信息和相关文献资料，设计本专题试验的药物剂量和浓 度：
[0212]
(1)中药感冒药二号临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量17.772g， 体重按70kg计算，根据体重
‑
体表面积转换折算小鼠剂量为2.31g/kg。本研究解 热试验中药感冒药二号的剂量为临床剂量等效剂量的1/4、1/2、1倍，即0.58、1.16、 2.31g/kg。
[0213]
2)cgsn
‑
01临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量20.22g，体重按70kg 计算，根据体重
‑
体表面积转换折算小鼠剂量为2.63g/kg。本研究解热试验 cgsn
‑
01冻干粉作为提取工艺对照组，剂量设置为临床剂量的等效剂量，即2.63 g/kg。
[0214]
(3)连花清瘟颗粒：连花清瘟颗粒在成人临床用量为18g/70kg，本项目按 照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到小鼠约为2.34g/kg。
[0215]
(4)氢化可的松片：氢化可的松片在成人临床用量为30mg/70kg，本项目 按照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到小鼠约为3.9mg/kg。
[0216]
动物筛选与分组
[0217]
选用观察后合格的小鼠，根据体重、性别均衡随机分为溶剂对照组、模型 对照组、中药感冒药二号的低、中、高剂量组、阳性对照组(连花清瘟颗粒)、 阳性对照组(氢化可的松片)、cgsn
‑
01对照组，每组10只小鼠。
[0218]
试验方法与观测指标
[0219]
选用观察后合格的小鼠，根据体重、性别均衡随机分为空白对照组、模型 对照组、中药感冒药一号低、中、高剂量组，每组10只小鼠。分组后各试验组 动物均进行灌胃给药，1次/天，受试物连续给药3天。第3天给药1h后，在每 只小鼠右耳廓中点双面均匀涂抹0.1ml
二甲苯，左耳不做处理。涂抹1h后将小 鼠颈椎脱臼法处死，用直径8mm的打孔器分别在小鼠左右耳同一部位(于二甲 苯涂布范围内)各打下圆耳片，用电子天平称重，根据计算公式计算小鼠耳廓 肿胀度及药物的抑制率。
[0220]
耳廓肿胀度
[0221]
沿小鼠耳廓基线剪下双耳，用直径8mm的打孔器分别在小鼠左右耳同一部 位各打下圆耳片，用电子天平称重，根据计算公式计算小鼠耳廓肿胀度及药物 的抑制率：
[0222]
肿胀度＝右耳质量－左耳质量
[0223]
药物的抑肿率(％)＝(生理盐水组肿胀度
‑
给药组肿胀度)/生理盐水组肿胀度
ꢀ×
100％。
[0224]
实验结果见表23.
[0225]
表23不同组别小鼠肿胀度和肿胀度抑制率的测定结果
[0226][0227]
注：与模型对照组相比，"*"表示p<0.05，"**"表示p<0.01。
[0228]
由表23可知，本发明制备的感冒药二号高剂量具有明显抑制小鼠突发急性 炎症模型的效果；低、中计量统计学上未见显著抑制药效。感冒药二号高剂量 连续给药3天后对小鼠突发急性炎症的药效与阳性药氢化可的松片无明显差异。
[0229]
应用例8
[0230]
本发明实施例9制备的中药提取物(中药感冒药二号)与市场上感冒药物 对醋酸致小鼠疼痛模型的作用对比。
[0231]
试验目的
[0232]
中药感冒药二号对醋酸致小鼠疼痛模型的作用实验研究，为受试物中药感 冒药二号镇痛治疗感冒及流行性感冒引发的疼痛反应的药物研究提供临床前实 验数据。
[0233]
试验方案见表24。
[0234]
受试物剂量设计和给药方案
[0235]
表24：镇痛试验组别、剂量设计一览表
[0236][0237]
剂量设计理由
[0238]
参考《药理实验方法学》、《中药药理研究方法学》(第三版)及委托方 提供的与受试物相关的信息和相关文献资料，设计本专题试验的药物剂量和浓 度：
[0239]
(1)中药感冒药二号临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量17.772g， 体重按70kg计算，根据体重
‑
体表面积转换折算小鼠剂量为2.31g/kg。本研究解 热试验中药感冒药二号的剂量为临床剂量等效剂量的1/4、1/2、1倍，即0.58、 1.16、2.31g/kg。
[0240]
2)cgsn
‑
01临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量20.22g，体重按 70kg计算，根据体重
‑
体表面积转换折算小鼠剂量为2.63g/kg。本研究解热试验 cgsn
‑
01冻干粉作为提取工艺对照组，剂量设置为临床剂量的等效剂量，即2.63 g/kg。
[0241]
(3)连花清瘟颗粒：连花清瘟颗粒在成人临床用量为18g/70kg，本项目 按照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到小鼠约为2.34g/kg。
[0242]
(4)吲哚美辛胶囊：吲哚美辛胶囊在成人临床用量为75mg/70kg/d，本项目 按照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到小鼠约为9.73mg/kg。
[0243]
动物筛选与分组
[0244]
选用观察后合格的小鼠，根据体重、性别均衡随机分为空白对照组、模型 对照组、中药感冒药二号的低、中、高剂量组、阳性对照组(连花清瘟颗粒)、 阳性对照组(吲哚美辛胶囊)、cgsn
‑
01对照组，每组12只小鼠，雌雄各半。
[0245]
试验方法与观测指标
[0246]
选用观察后合格的小鼠，根据体重、性别均衡随机分为空白对照组、模型 对照组、中药感冒药二号的低、中、高剂量组、阳性对照组(连花清瘟颗粒)、 阳性对照组(吲哚美辛胶囊)、cgsn
‑
01对照组，每组12只小鼠，雌雄各半。 分组后各试验组动物均进行灌胃给药，1次/天，连续给药2天，灌胃体积为20ml /kg。空白对照组和模型对照组小鼠给予等体积溶媒灌胃。试验前一天小鼠少量 进食，第二天试验当天，给药约2h后，除空白对照组外，各试验组小鼠均腹腔 注射0.9％的冰醋酸致痛，注射容积0.1ml/10g，空白对照组小鼠注射等体积生理 盐水。记录注射冰醋酸后20min内各组小鼠初次出现扭体反应的时间(潜伏期) 及扭体次数。以腹部内凹，躯干和后肢因刺激而伸长1次定义为1次扭体反应。 根据各组试验动
物的扭体次数，计算抑制率，分析灌胃给药各浓度的受试物在 小鼠醋酸致疼痛模型中的镇痛作用。
[0247]
(1)动物扭体潜伏期 记录注射冰醋酸后20min内小鼠初次出现扭体反应的时间(潜伏期)
[0248]
(2)动物扭体次数 记录注射冰醋酸后20min内小鼠初次出现扭体后的总计扭体次数
[0249]
(3)抑制率
[0250]
根据各组试验动物的扭体次数，计算抑制率，分析灌胃给药各浓度的受试 物在小鼠醋酸扭体疼痛模型中的镇痛作用：
[0251]
抑制率(％)＝(对照组平均扭体次数
‑
给药组平均扭体次数)/对照组平均扭体次 数
×
100％
[0252]
实验结果见表25。
[0253]
表25不同组别药物的镇痛效果
[0254][0255][0256]
注：与模型对照组相比，"*"表示p<0.05，"**"表示p<0.01。
[0257]
由表25可知，本发明制备的中药感冒药二号三种给药计量下均具有显著的 镇痛效果，统计学上三个计量不具有显著差异。中药感冒药二号三种给药计量 下的镇痛药效均优于连花清瘟颗粒，与阳性药吲哚美辛无显著差异。
[0258]
应用例9
[0259]
本发明实施例9制备的中药提取物(中药感冒药二号)与市场上感冒药物 对绵羊红细胞对小鼠迟发型过敏的影响对比。
[0260]
试验目的
[0261]
小鼠尾静脉注射绵羊红细胞悬液进行致敏，给予受试物中药感冒药二号， 观察中药感冒药二号对小鼠迟发型过敏反应的影响。为受试物中药感冒药二号 调节免疫功能，治
疗感冒及流行性感冒的药物研究提供临床前实验数据。
[0262]
试验方案
[0263]
受试物剂量设计和给药方案见表26
[0264]
表26：试验组别、剂量设计一览表
[0265][0266]
剂量设计理由
[0267]
参考《药理实验方法学》、《中药药理研究方法学》(第三版)及委托方 提供的与受试物相关的信息和相关文献资料，设计本专题试验的药物剂量和浓 度：
[0268]
(1)中药感冒药二号临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量17.772g， 体重按70kg计算，根据体重
‑
体表面积转换折算小鼠剂量为2.31g/kg。本研究解 热试验中药感冒药二号的剂量为临床剂量等效剂量的1/4、1/2、1倍，即0.58、 1.16、2.31g/kg。
[0269]
2)cgsn
‑
01临床用法与用量：口服。成人拟定日服用量20.22g，体重按70kg计算，根据体重
‑
体表面积转换折算小鼠剂量为2.63g/kg。本研究解热试验 cgsn
‑
01冻干粉作为提取工艺对照组，剂量设置为临床剂量的等效剂量，即2.63 g/kg。
[0270]
(3)连花清瘟颗粒：连花清瘟颗粒在成人临床用量为18g/70kg，本项目 按照临床等效剂量进行给药换算，按体表面积比转换折算到小鼠约为2.34g/kg。
[0271]
(4)开瑞坦片：成人用量为10mg/70kg/d，本项目按照临床等效剂量进行 给药换算，按体表面积比转换折算到小鼠约为1.3mg/kg。
[0272]
动物筛选与分组
[0273]
选用观察后合格的小鼠，根据体重、性别均衡随机分为溶剂对照组、模型 对照组、中药感冒药二号的低、中、高剂量组、阳性对照组(连花清瘟颗粒)、 阳性对照组(开瑞坦)、cgsn
‑
01对照组，每组14只小鼠，雌雄各半。
[0274]
试验方法与观测指标
[0275]
选用观察后合格的小鼠，根据体重、性别均衡随机分为空白对照组、模型 对照组、中药感冒药二号低、中、高剂量组，每组14只小鼠，雌雄各半。分组 后各试验组动物均进行灌胃给药，1次/天，受试物连续给药10天，灌胃体积为 20ml/kg。于给药第5天，模型对照及各给药组小鼠以10％(v/v)的生理盐 水绵羊血红细胞悬液腹腔注射0.2ml进行致敏(每只老鼠约注射4*108个 srbc)，空白对照组小鼠给予等体积生理盐水注射。第9天，给药完成后
在小 鼠左侧脚掌注射绵羊红细胞悬液0.1ml，在小鼠右侧脚掌注射生理盐水0.1ml。 注射12小时后(第10天)，各组按照分组进行灌胃给药，给药2小时后测量 两侧脚掌容积的差值。
[0276]
两侧脚掌容积差值
[0277]
给药第9天，给药完成后在小鼠左侧脚掌注射绵羊红细胞悬液0.1ml，在小 鼠右侧脚掌注射生理盐水0.1ml。注射12小时后(给药第10天)，按照分组给 药，给药2小时后测量两侧脚掌容积的差值。
[0278]
实验结果见表27。
[0279]
表27不同组别药物对迟发性过敏反应的影响结果
[0280]
[0281][0282]
由表27可知，本发明制备的感冒药二号能显著抑制小鼠左侧脚掌注射绵羊 红细胞悬液引发的迟发型过敏反应，对免疫系统功能过敏性应激具有调节作用。
[0283]
综上所述，本发明提供的抗流感中药组合物或中药提取物在不含麻黄的条 件下依然对流行性感冒具有很好的治疗效果，达到快速降温的目的，而且本发 明制备的中药提取物具有明显的抑菌、消炎、退热、镇痛和抑制迟发性过敏的 功效。
[0284]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何 熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰， 因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。