一种含有组织蛋白复合物的生物3D打印墨水的制备方法与流程

一种含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水的制备方法
技术领域
1.本发明涉及医疗模型制造及应用领域，特别涉及一种含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水的制备方法。


背景技术：

2.3d生物打印技术是一种新兴的生物制造技术，它通过使用细胞和特定的生物墨水在最大程度上模拟体内组织或器官的微环境，进而制造3d功能性活组织。因此，3d生物打印技术可以被用于制造体外组织/疾病模型、药物开发和筛选应用，了解疾病发展和进步，以及为再生医学制造组织和器官等。
3.生物墨水是3d生物打印技术的关键部分，近些年来涌现出了许多具有良好力学性能、生物相容性和组织再生性的天然或合成材料，如：明胶、海藻酸钠、甲基丙烯酰明胶、多聚乳酸、壳聚糖、胶原、透明质酸等，许多研究者通过在这些合成和天然生物材料中装载各种生物活性因子来更好地模拟体内微环境。
4.然而，由于机体内丰富的生物活性因子种类繁多、分布各异且作用机制复杂，单纯添加一种或几种因子创造出的微环境与真实体内环境相去甚远，无法再现体内细胞及其外基质的复杂性。


技术实现要素：

5.为解决以上问题，本发明提供了一种含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水的制备方法；该制备方法包括以下步骤：
6.步骤s1组织预处理：取组织，去除非目的成分，使用2
‑
3倍组织体积的pbs溶液清洗，再将组织剪成小块，使用红细胞裂解液裂解，进行第一次离心，取上层，得预处理组织；
7.步骤s2组织蛋白复合物的提取：使用研磨器研磨预处理组织，取研磨液，进行第二次离心，研磨液分层后，取水溶液层，进行第三次离心，取上清液，以0.22μm过滤器过滤，即得组织蛋白复合物；
8.步骤s3制备含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水：取生物墨水与组织蛋白复合物以4:1
‑
9:1的比例混合均匀，制成含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水。
9.其中，非目的成分指的是毛发、筋膜、血管或脂肪等，脂质层为液态，水溶液层为液态，固体沉渣为固态。
10.进一步地，步骤s1的组织的供体包括猪、小鼠、大鼠、兔或人中的一种或多种，步骤s1的组织的类型包括皮肤、脂肪、肝脏、肾脏、心脏或软骨中的一种或多种。
11.进一步地，步骤s1的小块为0.1cm3‑
1cm3。
12.其中，小块的体积应根据组织类型决定，坚硬组织如软骨应剪成1
‑
2mm3的颗粒，疏松组织如脂肪剪成0.1
‑
1cm3的小块即可。
13.进一步地，步骤s2使用研磨器研磨预处理组织后还包括以下步骤，在研磨过程中每克组织加入1ml的pbs溶液。
14.进一步地，步骤s1第一次离心的条件为：在4℃条件下离心5min，离心速度为2000rpm；步骤s2第一次离心的条件为：在4℃条件下离心5
‑
15分钟，离心速度为4000
‑
5000rpm，步骤s2第二次离心的条件为：在4℃条件下离心20
‑
40分钟，离心速度为12000
‑
15000rpm。
15.进一步地，步骤s3的生物墨水由明胶、海藻酸钠、甲基丙烯酰明胶、多聚乳酸、壳聚糖、胶原、透明质酸中的一种或多种制备而成。
16.进一步地，生物墨水包括以下质量百分比的各组分：10％的明胶和1％的海藻酸钠。
17.本发明还提供了一种含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水，由以上制备方法制备而成。
18.本发明还提供了一种由以上含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水制备3d打印组织的方法，该方法为：取含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水，装入无菌打印筒中，冷凝后安装在生物三维打印机打印臂上，设置温度为4℃，打印平台温度调至0℃，打印喷嘴直径420μm，在直径60mm培养皿中行三维打印得打印产物，并将打印产物进行交联，即得3d打印组织。
19.进一步地，交联包括化学交联和光交联，化学交联指的是使用25g/l氯化钙溶液交联10min，光交联指的是使用波长为405nm的紫外光或波长为632nm的激光或可见光交联1
‑
5min。
20.有益效果：本发明利用获得特定组织蛋白复合物结合不同材料，可以制备不同需求的生物3d打印墨水，如为满足创面治疗需要将皮肤或脂肪来源蛋白复合物与相关生物墨水结合，也可以是为满足骨再生需求将软骨来源蛋白复合物与相关生物墨水结合，根据不同需求选择不同组织与不同生物墨水进行排列组合，具备较高的生物相容性、生物再生性，满足生理或病理机制探索、组织工程修复需求，具备较好的临床应用前景。
附图说明
21.图1为实施例1制得的含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水和对照例1制得的普通生物墨水的外观图；
22.图2为对照例1的普通生物墨水和实施例1的含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水的力学性能图；
23.图3为对照例1和实施例1的3d打印组织的外观观察图；
24.图4(a)为创面模型造模方法流程图；
25.图4(b)为裸鼠创面模型造模成功的动物实验实例图；
26.图4(c)为第2天和第8天观察各组裸鼠的创面状态；
27.图4(d)为第6天对各组创面取材进行he染色分析结果图；
28.图4(e)为各组创面愈合率统计图。
具体实施方式
29.下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围；本发明中所使用的设备，如无特殊规定，均为
本领域内常用的设备；本发明中所使用的方法，如无特殊规定，均为本领域内常用的方法。
30.实施例1
31.本实施例提供了一种含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水的制备方法，具体包括以下步骤：
32.步骤s1组织预处理：取吸脂手术废弃的新鲜人脂肪组织，用pbs多次清洗至洗涤液呈透明无色，使用眼科剪去除筋膜组织，并将脂肪组织剪成约0.1cm3小块，取10ml上述小块状的脂肪组织，加入20ml红细胞裂解液，于冰上裂解15min，然后将裂解后的预处理组织倒入离心管，盖紧后放入离心机，在2000rpm、4℃条件下，离心5min，取上层脂肪组织，制得预处理组织；
33.步骤s2组织蛋白复合物的提取：将步骤s1制得的预处理组织放置于20ml研磨器中进行物理研磨，直至脂肪全部变为淡黄色乳糜状液体，将研磨液倒入离心管，盖紧后放入离心机，在4500rpm、4℃条件下，离心10min，可见研磨液分为三层，取中间的水溶液层，再次倒入离心管，盖紧后放入离心机，在15000rpm、4℃条件下，离心30min，取上清液，经0.22um过滤器过滤，即得组织蛋白复合物。
34.步骤s3制备含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水：在室温条件下，取无菌明胶
‑
海藻酸钠生物墨水，37℃预热后，无菌条件下与步骤s2制得的组织蛋白复合物混匀，制成含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水；
35.本实施例还提供了一种3d打印组织，该3d打印组织的由以下方法制备而成：
36.取该含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水5ml，装入无菌打印筒中，冷凝后安装在温度为4℃的生物三维打印机打印臂上，打印平台温度调至0℃，打印喷嘴直径420μm，在直径60mm培养皿中行三维打印，并用6ml浓度为25g/l的氯化钙溶液交联10min，即得3d打印组织；
37.其中，无菌明胶
‑
海藻酸钠生物墨水包括以下质量百分比的各组分：10％的明胶和1％的海藻酸钠。
38.对照例1
39.本对照施例提供了一种普通生物墨水的制备方法，具体包括以下步骤：
40.取无菌明胶
‑
海藻酸钠生物墨水5ml，装入无菌打印筒中，冷凝后安装在温度为4℃的生物三维打印机打印臂上，打印平台温度调至0℃，打印喷嘴直径420μm，在直径60mm培养皿中行三维打印，并用6ml浓度为25g/l的氯化钙溶液交联10min，即得3d打印组织；
41.其中，无菌明胶
‑
海藻酸钠生物墨水包括以下质量百分比的各组分：10％的明胶和1％的海藻酸钠。
42.试验例1 3d打印墨水的外观观察
43.分别取实施例1制得的含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水和对照例1制得的普通生物墨水，肉眼观察其外观形态，试验结果见图1。
44.由图1可知，实施例1比对照例1所得生物墨水稍显浑浊。
45.试验例2力学性能检测
46.分别取实施例1制得的含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水和对照例1制得的普通生物墨水，在配备40mm平行板(间隙宽度＝1毫米)的tadhr
‑
3流变仪(aresg2)上进行生物墨水的流变测试，在整个测量过程中，通过板式传感器系统将温度保持在10℃，动态频率
扫描(频率范围在0.1和10hz之间)以5％的应变进行，其中测量了储能模量(g')和损耗模量(g")；每种生物墨水检测三次，结果如图2所示。
47.对照例1的普通生物墨水和实施例1的含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水的储能模量和损耗模量如图2所示，10℃条件下，根据储能模量与损耗模量交点处横坐标计算得出，两种生物墨水由液态向固态的转变(即凝固)的时间点分别为74.38
±
0.58s和76.59
±
0.35s，实施例1的3d打印墨水的凝固时间稍长于对照例1的普通生物墨水。
48.试验例3 3d打印组织的外观观察
49.分别取实施例和对照例1制得的3d打印组织，肉眼观察其外观，试验结果如图3所示。
50.由图3可知，实施例1的可打印性与对照例1没有明显差异，证明实施例1的含有组织蛋白复合物的生物3d打印墨水的可打印性良好，打印组织的保真度较高。
51.试验例4创面治疗实验
52.试验方法如下：
53.运用裸鼠背部皮肤做全层创面模型，如图4(a)所示：创面给予不同治疗措施后，上覆无菌纱布，并使用弹力绷带固定；换药时每2天打开包扎，观察创面并拍照，更换无菌纱布后再次使用弹力绷带固定；组织获取时打开包扎，使用眼科剪将距创面边缘0.5cm范围内全层皮肤组织剪下，并及时使用多聚甲醛溶液浸泡固定；实验前在每只裸鼠背部用眼科剪造一个直径1cm的圆形皮肤全层创面，动物实验实例图见图4(b)，将造模成功的模型鼠分为空白组、组织蛋白复合物组、实验组和对照组，组织蛋白复合物组、实施组和对照组分别将实施例1的组织蛋白复合物(100μg/ml溶液)、实施例1制得的3d打印组织和对照例1制得的3d打印组织敷贴在裸鼠背部创面上，观察各组的创面治疗作用；空白组不做治疗；分别在第2天和第8天观察各组裸鼠的创面状态，试验结果见图4(c)，在第6天分别对各组创面取材进行he染色分析，试验结果见图4(d)，对各时间点(第10天、第14天)创面愈合率进行数据统计，创面愈合率计算方法如下：在同样视野及放大倍数下拍摄创面照片，利用数据处理软件测量创面面积，不同时间点创面面积与创面初始面积的差值与初始创面面积的比值即为愈合率；实验结果见图4(e)。
54.试验结果如下：
55.由图4(c)可知，第2天时，空白组创面可见大量淡黄色渗出物覆盖创面；组织蛋白复合物组创面湿润，未见明显渗出；对照组和实验组创面可见打印组织已降解，创面清洁，无明显渗出；第8天时，空白组创面残余较大，干燥结痂，组织蛋白复合物组创面呈鲜红色，但上皮化不足，对照组残余创面面积小，创面基底呈淡粉色；实验组残余创面面积明显小于前三组，创面基底呈鲜红色。
56.由图4(d)可知，空白组创面明显收缩，表面有痂，痂下有一定程度血管化和炎性细胞浸润，组织蛋白复合物组创面轻度收缩，创基可见较多新生血管和炎性浸润，对照组创面无明显收缩，但创基血管化不足，实验组创面无明显收缩，创基血管化程度适中。
57.由图4(e)可知，第10天时，实验组创面完全愈合，明显高于三组(p<0.05)；第14天时，空白组创面未愈合，其余三组完全愈合；总之，实验组愈合速度和效果明显好于对照组和组织蛋白复合物组。
58.最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照
较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。