一种柔性导电促血管生成材料及其制备方法

1.本发明属于生物材料领域，尤其涉及一种柔性导电促血管生成材料及其制备方法。


背景技术：

2.压力性损伤，又称褥疮，是一种发病率非常高的慢性伤口，其原因包括骨突出部(如骶骨和臀部区域)的压力、剪切力或摩擦力以及血流受损。压疮的发生率因临床环境而异，特别是四肢瘫痪或脊髓损伤患者，以及髋部或股骨骨折老年患者的发生率较高(～60％)。对于住院患者，压疮导致住院时间延长、住院费用增加。在美国，压疮每年影响超过300万患者，每年花费约250亿美元。
3.压疮常用的治疗方法有减压、敷料、定期翻身等。然而，这些治疗手段耗费人工、费用昂贵。近年来，有报道称电刺激(es)治疗可加速压疮的愈合，具有无痛性和良好的安全性。既往研究证实es通过促进巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞等多种细胞的迁移或增殖来加速创面愈合。此外，es还能促进细胞外基质(extracellular matrix,ecm)的产生，促进多种细胞因子的分泌和血管结构的再生，具有抑菌杀菌作用。然而，传统的刚性电极材料(金属和碳基电极)与软生物组织之间的机械不匹配可能导致炎症或组织损伤，甚至在长期应用es时形成瘢痕组织。
4.感染的处理是慢性伤口管理的关键，常用的临床技术包括细致的清创、抗生素使用和局部抗菌治疗。然而，目前的技术对抗生物膜引起感染仍然是一个巨大的挑战。手术清创不能完全清除伤口上的细菌，大多数情况下生物膜会在3天内重新出现。长期使用抗生素可能会引起细菌的抗生素耐药性和其他不良副作用，包括胃肠道症状、皮疹、鹅口疮、线粒体功能损伤。因此，研究人员正在寻找可以取代传统抗生素的新型抗菌剂。
5.此外，缺乏新生血管是压疮难以愈合的另一个重要问题，尤其是糖尿病患者与老年患者。皮肤组织的血管化是由许多因素调节的，如微环境的湿度、生长因子和物理诱导剂。特别是，血管内皮生长因子(vegf)可显著促进新生血管的生长。vegf在创伤靶向方面缺乏，很容易被免疫系统清除。去铁胺(dfo)是一种常用的铁螯合剂。最近的研究发现，dfo可以增强细胞对低氧诱导因子1
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α(hif1
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α)的表达，从而增加vegf的表达并促进局部血管生成。然而，与生长因子类似，dfo对于伤口组织也缺乏靶向性，且代谢速度快，难以在伤口处聚集。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种柔性导电促血管生成材料及其制备方法，其目的在于：促进伤口处的血管再生，避免因口服、静脉注射等全身给药方式引起的毒副作用，以及人体组织对dfo的代谢。
7.为简化描述，本发明中对以下术语进行缩写简化：
8.es：电刺激；dfo：去铁胺；pani：聚苯胺；mbaa：n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺；aps：过硫
酸铵；temed：n,n,n'，n'
‑
四甲基乙二胺；pam：聚丙烯酰胺；hif1
‑
α：低氧诱导因子1
‑
α；vegf:血管内皮生长因子。
9.本发明采用的技术方案如下：
10.一种柔性导电促血管生成材料的制备方法，包括以下步骤：
11.步骤1：将丙烯酰胺和交联剂溶于去离子水中得到溶液，将热引发剂和促进剂加入到溶液中，在20℃
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60℃下反应3
‑
7h，得到pam水凝胶；
12.步骤2：将pam水凝胶浸泡在含有0.5
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2m酸和10
‑
40mm苯胺的溶液中1
‑
48h，然后加入0.1
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1m aps，反应2
‑
6h后，用清洗溶剂清洗，得到的pmn水凝胶并冻干；
13.步骤3：将冻干的pmn水凝胶在dfo溶液中浸泡24
‑
48h，得到装载dfo的pmn水凝胶。
14.优选的，步骤1中，所述交联剂为n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺，所述热引发剂为过硫酸铵，所述促进剂为n,n,n'，n'
‑
四甲基乙二胺。
15.优选的，步骤1中，所述丙烯酰胺、交联剂、热引发剂、促进剂、去离子水的质量份依次如下：0.5
‑
3份、0.5
‑
3份、0.05
‑
0.3份、0.05
‑
0.3份、93.4
‑
98.9份。
16.优选的，步骤1中，反应温度为40℃，反应时间为4h。
17.优选的，步骤2中的酸为盐酸、醋酸、草酸中的一种。
18.优选的，步骤2中，酸的浓度为1m，苯胺浓度为25mm，浸泡时间为24小时，aps浓度为0.5m，反应时间为4小时。
19.优选的，步骤2中，所述清洗溶剂为乙醇、甲醇、叔丁醇、丙酮中的一种。
20.一种柔性导电促血管生成材料，采用所述方法制备得到。
21.所述柔性导电促血管生成材料在制备柔性生物电子器件中的应用。
22.所述柔性导电促血管生成材料在制备柔性生物电子器件中的应用。
23.本发明通过苯胺在水凝胶中的原位聚合，构建一种导电抗菌水凝胶。聚苯胺是一种便宜的生物相容性聚合物，它具有共轭π键结构提供电导率。将聚苯胺水凝胶冷冻干燥以后，浸泡再dfo溶液中，利用水凝胶骨架的亲水性，将dfo溶液重新填充在导电水凝胶的骨架间隙中，完成dfo的负载。负载的dfo会在伤口处原位释放，促进细胞hif1
‑
α的表达，从而增加局部vegf的表达，促进血管生成。同时，因为水凝胶的导电性，可以使用外部电流对伤口进行刺激，进一步促进伤口愈合。
24.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
25.1、本发明采用pani与聚丙烯酰胺作为基体材料制备用于柔性生物电子器件的材料，该材料同时具有与人体组织类似的导电性、良好的生物相容性与抗菌性，可以用来制备柔性导电敷料等产品；
26.2、本发明采用原位聚合的方法，可以实现pani在水凝胶中的均匀分布，保证水凝胶均匀导电；
27.3、本发明通过冻干
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复吸水的方法在导电水凝胶中加入dfo，一方面可以最大限度地保持dfo的分子结构，避免其生物活性损失，另一方面，可以实现dfo在伤口处原位释放，促进伤口处的血管再生，避免因口服、静脉注射等全身给药方式引起的毒副作用，以及人体组织对dfo的代谢。
28.5、本发明采用的材料制备方法，都在水溶液中进行，无需使用有机溶剂，生产过程绿色环保，同时无有机溶剂残留，有利于扩大应用范围；
29.6、本发明原材料便宜，合成路径简单，能够快速且大量地制备导电材料，有利于新型柔性生物电子器件的量产及商业化应用。
附图说明
30.本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
31.图1是电刺激治疗示意图
32.图2为水凝胶的导电性测试结果；
33.图3为水凝胶的吸水率；
34.图4为dfo的释放曲线；
35.图5为水凝胶力学性能测试结果；
36.图6为细胞毒性结果；
37.图7为伤口修复结果。
具体实施方式
38.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实施例。基于本技术的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
39.下面结合图1
‑
7对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
40.实施例1
41.本发明较佳的实施例提供一种聚丙烯酰胺水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
42.将丙烯酰胺(0.18g)和交联剂(n,n
′‑
亚甲基双丙烯酰胺，mbaa,0.15wt％)溶于去离子水(10ml)中。将热引发剂(过硫酸铵，aps,0.018g)和促进剂(n,n,n'，n'
‑
四甲基乙二胺，temed,18μl)加入到溶液中。将溶液注入玻璃模具中，在40℃下反应4h，脱模后得到透明的pam水凝胶。
43.实施例2
44.本发明较佳的实施例提供一种聚苯胺
‑
聚丙烯酰胺的制备方法，具体步骤如下：
45.在实施例1的基础上，将透明的pam水凝胶浸泡在含有1m盐酸和25mm苯胺的溶液中24h，然后加入0.5m aps，反应4h后，用乙醇清洗，得到的pmn水凝胶。
46.实施例3
47.本发明较佳的实施例提供一种柔性导电促血管生成水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
48.在实施例2的基础上，将冻干的pmn水凝胶在dfo溶液(1mm)中浸泡48h，制备装载dfo的pmn水凝胶。
49.实验例1
50.测试上述实施例制得的材料的导电性能。
51.采用四探针法上述实施例中制备的柔性导电抗菌水凝胶的导电性，结果如下图2所示。聚苯胺的加入使水凝胶具有本征的三维导电骨架。聚丙烯酰胺水凝胶的电导率和电阻分别为0.68ms/cm和593kω左右。与pam水凝胶相比，聚苯胺的加入使电导率提高了107％，电阻降低了54％。pmn水凝胶的电导率与皮肤组织相似(0.26～2.2ms/cm)，表明其具有传递生物电信号、促进创面愈合的作用。
52.实验例2
53.测试上述实施例制得的材料的吸水率。
54.加入疏水聚苯胺基团后，pmn水凝胶的溶胀率仍高达其初始重量的11倍(图3)。pmn水凝胶的高溶胀率不仅可以清除创面渗出物，而且提供大量的游离位点吸附药物。
55.实验例3
56.测试实施例3制得的材料的dfo释放曲线。
57.根据水凝胶的溶胀行为，将冻干后的pmn水凝胶浸泡在1mm dfo溶液中，直至溶胀重量达到平衡，制备dfo负载水凝胶。在创面愈合过程中，正常的血运重建主要发生在伤后3～7天。因此，dfo在前三天的释放动态尤为重要。从图4可以看出，在6h有一次初始爆发(50％以上)，随后持续缓慢释放至96h(61.37％)。dfo的爆发性释放有利于创面愈合早期血管的修复。
58.实验例4
59.测试上述实施例制得的材料的力学性能。
60.pmn水凝胶具有良好的弹性、延展性和韧性，有利于组织再生过程中血管生成和神经束修复。如图5所示，pmn水凝胶在高强度(80％)压缩下表现出良好的弹性，没有明显的损伤和塑性变形。pmn水凝胶的抗压强度为4.59kpa。水凝胶能够承受60％的压缩应变而不断裂，并在去除压缩载荷后迅速恢复到原始形状。此外，在60％应变下进行100次循环压缩恢复试验后，水凝胶的压缩应力
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应变曲线与第1次循环相近，压缩强度仅衰减18％。pmn水凝胶的拉伸应变为205％，优于目前报道的大多数水凝胶创面敷料(通常低于100％)。在循环拉伸试验中(应变为150％时)，第一个循环后应力略有下降。在第五个循环中，当拉伸应变达到120％左右时，pmn水凝胶发生断裂。pmn水凝胶具有良好的回弹性，可承受60％以上的压缩变形和高应变，可满足水凝胶敷料在实际应用中的要求。
61.实验例5
62.测试实施例3制得的材料的细胞毒性。
63.我们选择l929细胞和huvecs作为模型细胞，评估水凝胶和dfo的细胞毒性，因为内皮细胞和成纤维细胞与创面愈合过程密切相关。如图6a所示，水凝胶提取物对l929细胞和huvecs均无细胞毒性。图6b显示dfo在0～50μm浓度范围内对l929细胞无细胞毒性。当dfo浓度大于25μm时，huvecs细胞存活率约为对照组的80％。
64.实验例5
65.测试实施例3制得的材料对慢性伤口愈合的促进作用。
66.在每只大鼠上背上创建四个全层皮肤切除伤口。在control(对照)组中，伤口没有覆盖敷料，而在dfo组中，使用本发明制备的导电促血管生成材料治疗伤口。对于es组，使用常规的电极对伤口进行电刺激，而不使用水凝胶材料。在dfo+es组，通过覆盖伤口的导电促血管生成材料施加电刺激治疗伤口。
67.i/r损伤是血液再灌注对缺血组织所引起的细胞损伤。在缺血组织中，由于缺乏营养和氧气，其代谢降低。由于氧自由基的突然增加，随后的血液再灌注会导致严重的组织损伤，包括严重的炎症和内皮细胞功能受损。此外，由于临床应用的es治疗通常是电流或带电粒子的单向流动，可能会造成电化学效应和化学烧伤。因此，本研究选取电极极性周期性反转的双向电流刺激(交流，100μa,6000hz)对压疮进行刺激。
68.经过3个i/r周期后，虽然观察到轻微的皮肤凹陷，但肉眼未见明显的皮肤溃疡。组织病理学上，与正常皮肤组织相比，3次i/r循环导致表皮、真皮及部分下皮层坏死，致密炎症细胞浸润。在i/r循环3天后，出现了较厚焦痂的pu。此后，压疮的尺寸逐渐减小，直至压疮完全愈合。从图7可以看出，dfo+es处理显著缓解了压疮的形成。dfo、es和dfo+es处理的压疮创面面积分别比对照组减少27％、32％和41％。dfo+es组创面愈合速度明显快于对照组。其中，dfo+es组在第21天创面愈合率为94％，显著高于其他各组(对照组57％；dfo组75％；es组73％)。这些结果表明，负载dfo的pmn水凝胶能够抑制压疮的形成，并能有效促进创面愈合，而这种抑制作用在dfo与es的协同作用下变得更加明显。
69.通过组织学分析进一步评估利用dfo负载的导电pmn水凝胶传输电刺激对压疮治疗的有效性。在第21天，dfo+es组在压疮中心可以看到表皮。然而，尽管dfo和es组的压疮实现了再上皮化和肉芽组织形成，真皮仍处于修复过程中，炎症反应较轻。对照组压疮愈合延迟，上皮不完整，真皮疏松分布不均匀且存在大量炎性中性粒细胞。
70.胶原沉积与排列是评价创面修复程度的关键指标。第21天不同治疗策略后压疮的masson染色图像显示，dfo+es组压疮完全封闭。dfo+es组胶原沉积明显增加，且dfo+es组内胶原沉积与周围天然组织排列方向一致。而dfo和es组胶原分布紊乱，胶原密度低于dfo+es组。在对照组中，几乎没有观察到间质胶原，但存在未成熟的细胞团块。这些结果表明，导电dfo负载pmn水凝胶可以通过纠正胶原沉积的异常状态来加速压疮的愈合。
71.免疫组化染色检测血管内皮因子(cd31)的表达，可以评价压疮的血管生成情况。结果显示，dfo+es处理可促进创面修复过程中微血管的形成。第21天，dfo+es组新生儿血液指标(cd31)表达水平显著高于对照组，说明制备的负载dfo的pmn水凝胶可促进pu愈合过程中的血管生成。此外，巨噬细胞的表面标记物cd68被选用来评估pu[56]中的炎症反应。dfo+es组压疮处的炎症反应几乎被抑制。对照组cd68阳性单核/巨噬细胞浸润较强。慢性创面炎症反应的延长将严重阻碍创面的愈合。
[0072]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
[0073]
以上所述实施例仅表达了本技术的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本技术保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。