一种严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物递送系统及制备方法

1.本发明属于药物制剂领域，涉及天然多糖、氨基糖苷类抗生素、雾化吸入给药、药物载体及其制备方法和应用，具体涉及一种严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物递送系统及其制备方法。


背景技术：

2.由细菌造成的严重下呼吸道感染及耐药是亟待解决的细菌性感染难题之一。抗生素治疗仍然是临床上治疗下呼吸道感染主流方式，所以制定合理的治疗策略，通过合适的给药方式，合理使用抗生素实现下呼吸道细菌性感染的有效治疗是紧迫而艰巨的挑战。
3.2020年季健教授课题组在acs nano期刊14卷第5期第5686
‑
5699页发表了一篇关于纳米粒子酸响应的静电转变实现电荷反转和尺寸减小并以静脉注射方式治疗肺部感染的报道。然而，血液环境复杂可能会引起纳米粒子在血管内的吸附和团聚，且相对于吸入给药，静脉注射药物利用率较低。所以纳米粒子在血液运输中的稳定性及药物在肺部的利用效率均未可知。
4.诺华公司发明了一种tobi podhaler的吸入制剂，将妥布霉素物理包裹在1,2
‑
二硬脂酰
‑
sn
‑
甘油
‑3‑
磷酸胆碱(dspc)中以干粉形式吸入给药，公开号为cn112891327a的专利公开了一种瑞德西韦雾化吸入用液体制剂，公开号为cn111840569a的专利公开了一种ph响应性载药纳米粒子，以季铵盐改性果胶/聚己内酯接枝共聚物与药物的静电作用实现ph响应。但是由于肺部生理环境特殊，患者气管内存在粘稠厚重粘层和致密生物膜可以通过疏水和静电作用阻隔药物的递送，这些制剂可能无法实现向肺部的高效递送。另一方面，这些制剂一般以静电作用或者物理包覆形式负载药物，制剂不稳定且不能实现按需给药。
5.公开号为cn108478792a的专利公开了一种可渗透粘液的ph响应性高分子金纳米胶束及其制备方法，公开号为cn109589418a的专利也公开了一种具有ph响应性的席夫碱共聚物包覆的介孔二氧化硅载药纳米粒子及其制备方法，但实际上无机化合物二氧化硅及金纳米粒子并不适用于肺部给药的递送，无机化合物在肺部的降解和安全性尚未可知。
6.迄今为止，大多数纳米药物在治疗严重下呼吸感染时仍存在诸多问题，难以实现令人满意的治疗效果。生物安全性、纳米粒子的稳定性、黏液及生物膜渗透性、药物可控释放等问题阻碍了纳米载体在严重下呼吸道感染领域中的进一步发展和应用。因此，选择生物相容性优异、可生物降解性的原材料利用刺激响应性共价键将药物偶联到载体材料上实现可穿透黏液及生物膜、具有良好下呼吸道感染微环境响应性的吸入给药治疗策略将是纳米药物在严重下呼吸道感染治疗领域方面新的突破。这种治疗策略可以实现在肺部形成高的药物浓度，降低给药剂量，避免首过效应，大幅提高药物的利用率，减少氨基糖苷类抗生素的耳毒性肾毒性等毒副反应。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明提供了一种严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物递送系统的制备方法。本发明具体提供了如下的技术方案：
8.1、一种严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物递送系统的制备方法，制备步骤为：
9.1)制备醛化天然多糖；
10.2)将步骤1)的醛化天然多糖溶于碱性缓冲溶液中，然后加入不良溶剂中，搅拌至完全分散混匀，再同时加入氨基糖苷类抗生素与带氨基的亲水性peg，高速搅拌，在20
‑
80℃条件下反应0.5
‑
48h；所述的醛化天然多糖中的醛基与氨基糖苷类抗生素中的氨基的比例为3:1
‑
2:1，氨基糖苷类抗生素中的氨基与带氨基的亲水性peg的比例为12:1
‑
1:12。
11.3)将步骤2)反应产物反复离心、超声分散，直至将残余反应物洗净，冻干得到自适应型纳米药物。
12.进一步，步骤2)所述的碱性缓冲溶液与不良溶剂的体积比为2:1
‑
1:2。
13.进一步，步骤1)所述的天然多糖为含邻二羟基的天然多糖。
14.进一步，步骤2)所述的甲氧基聚乙二醇
‑
氨基。
15.进一步，所述的天然多糖为葡聚糖、淀粉、透明质酸、海藻酸钠、甘草多糖、黄原胶、纤维素、白及多糖、硫酸软骨素、肝素钠中的一种或者两种。
16.进一步，步骤1)所述醛化天然多糖的醛化度为10
‑
100％。
17.进一步，步骤2)所述的碱性缓冲液ph为7.4
‑
11。
18.进一步，步骤2)所述的不良溶剂为乙醇、甲醇、丙酮和乙醚中的一种或者两种。
19.进一步，步骤2)所述的氨基糖苷类抗生素为庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、链霉素、卡那霉素、依替米星、核糖霉素、奈替米星、小诺米星的一种或者两种。
20.2、根据上述制备方法制备得到的一种严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物递送系统。
21.根据上述制备方法得到的以醛化天然多糖作为纳米药物载体，氨基糖苷类抗生素通过席夫碱键与多糖偶联作为自适应抗菌组分，依靠mpeg
‑
nh2在纳米粒子表面形成亲水层的一种严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物系统应用于严重下呼吸道感染治疗。本发明构建严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物系统的原理是：在不良溶剂中，两种水溶性的化合物分子链蜷曲并相互靠近缠结，天然多糖醛化后所得醛化多糖上的醛基可以与氨基糖苷类抗生素上的氨基在碱性缓冲液中形成可酸响应性的席夫碱键，在磁子高速搅拌的条件下形成纳米粒子，所加入的带氨基的亲水性peg也可以通过席夫碱反应连接到纳米粒子上，并在纳米粒子的表面形成一层较为亲水的表面，增加纳米的稳定性防止纳米粒子发生团聚。通过这种方法最终得到一种通过共价键和非共价键两种方式载药的高药物载量的纳米药物。这种纳米药物可以实现根据下呼吸道感染情况进行按需给药，在感染严重的部位，细菌产生的乳酸等酸性物质刺激席夫碱键酸响应断裂释放抗生素，另一方面共价键断裂导致纳米粒子解散使材料中通过非共价键包裹的抗生素也被快速释放出来，这使得材料能够快速释放出所负载的全部抗生素，进行快速杀菌。而在细菌感染不是很严重时，材料只释放出通过非共价键负载抗生素部分进行杀菌，可以相对减少药物对于人体的耳毒性肾毒性，提高药物的利用率，减少耐药菌产生。
22.本发明的有益效果在于：
23.1、生物相容性好
24.该纳米药物原材料为天然多糖，生物相容性好，可以被溶菌酶或吞噬细胞等消化降解，相较于无机化合物不会造成载体材料累积残留。
25.2、自适应性能好
26.纳米药物表面带正电可以被吸引进入带负电的黏液层，表面的亲水层又可以帮助纳米粒子避开黏液层的疏水作用较为快速的穿过黏液层。纳米粒子通过共价键与非共价两种负载方式载药，所得纳米粒子具有高的药物载量，其内部的席夫碱键可以ph响应性断裂，这使得在穿透过程中基本无药物损失，而在到达感染部位后可根据不同感染程度按需给药，进行自适应杀菌。该种治疗策略可有效提高药物的利用率，减少用药剂量，减小氨基糖苷类的耳毒性、肾毒性，减少耐药菌的产生。
27.3、可实现通过雾化吸入进行肺部给药
28.纳米药物的表面存在由带氨基的亲水性peg形成的水化层使得其具有良好分散性，使其能有效穿透黏液，雾化性能好，纳米粒子能效地向深肺部递送，杀伤定植在黏液下层的细菌及生物膜。且其由共价键席夫碱键连接构成，相较于非共价作用形成的纳米粒子结构更加稳定，可以实现通过雾化吸入进行肺部给药，相较于口服或者静脉给药可以在肺部形成高药物浓度，避免首过效应，降低药物剂量，减小药物毒副作用，更适用于严重下呼吸道感染的治疗。
附图说明
29.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
30.图1为其中一种纳米药物合成工艺流程图。
31.图2为纳米药物tem照片结果图。
32.图3为纳米药物的x射线光电子能谱(xps)n 1s分峰结果图。
33.图4为纳米药物渗透人工模拟肺部黏液示意图。
34.图5为纳米药物抗菌结果图。
35.图6为纳米药物动物体内肺部治疗实验h&e染色结果图。
具体实施方式
36.下面结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。图1为其中一种纳米药物合成工艺流程图，先将可溶性淀粉用热水完全溶解，用高碘酸钠醛化得到醛化可溶性淀粉。将醛化淀粉溶于碳酸钠缓冲溶液中，完全溶解后将溶液加入到乙醇中搅拌至分散均匀，再在混合溶液中同时加入妥布霉素和甲氧基聚乙二醇
‑
氨基(mpeg
‑
nh2)，通过席夫碱反应形成纳米粒子。
37.实施例1
38.1、醛化可溶性淀粉的合成
39.5g可溶性淀粉溶于50ml去离子水中，加入3.3g高碘酸钠，使用1m的h2so4调节ph＝3左右，40℃避光反应4h，反应完成之后将其转移到3500d的透析袋中透析3天，冻干，得到的醛化淀粉的醛化度为：50％。
40.2、纳米粒子的合成
41.25mg醛化淀粉溶于ph＝8的5.6ml碳酸钠缓冲溶液中，溶解完全后加入到11ml的无水乙醇中，搅拌30min后同时加入6.15mg妥布霉素和36.9mg mpeg
‑
nh2(mw＝5000g mol
‑1)，室温下反应2h。反应完成后12000rpm离心除去上清液，再加离子水超声清洗后离心，重复三遍，冻干,所得材料命名为stp21。
42.3、纳米粒子的肺部黏液渗透行为
43.首先配制人工黏液(cf
‑
am),配方如下：500mg dna，250mg黏蛋白，0.295mg dpta，1ml rpmi 1640氨基酸溶液，250μl蛋黄乳液，250mg nacl，110mg kcl加到50ml无核酸酶的水中混合，用1m naoh调其ph至中性。将2ml样品瓶下层放置400μl琼脂糖凝胶，上层放置600μl cf
‑
am，最上层放置经过考马斯亮蓝染色的纳米粒子分散液50μl，记录蓝色纳米粒子层渗透过人工黏液层的时间。
44.4、抗菌性能
45.将样品首先在96孔板中进行梯度稀释为2
‑
2048μg/ml，每孔70μl每组三个平行样品。在每孔中加入70μl 2
×
105cfu/ml金黄色葡萄球菌悬浮液，放置在摇床中培养12h。用酶标仪读取od值。
46.5、动物体内肺部感染治疗实验
47.采用8周龄20g左右的balb/c雌性小鼠分为四组进行实验。采用滴鼻法对以下四组分别进行接种。健康对照组：接种20μl灭菌pbs，不治疗组：接种20μl 1
×
10
10
cfu/ml的金黄色葡萄球菌，保证小鼠的接种浓度为2
×
108cfu/mouse，接种完成后将老鼠垂直放置5min，保证菌能充分通过气管进入肺里，后续这组不进行治疗。stp21组：接种2
×
108cfu/mouse金黄色葡萄球菌，雾化stp21治疗。药物剂量为30mg/kg。用家用雾化器进行雾化给药，根据小鼠的体重用定时器控制雾化给药时间，雾化治疗每天一次，共两次。取出小鼠的肺，右肺用组织固定液固定后进行h&e染色表征，观察组织中的炎症情况。
48.实施例2
49.1、醛化可溶性淀粉的合成
50.5g可溶性淀粉溶于50ml去离子水中，加入3.3g高碘酸钠，使用1m的h2so4调节ph＝3左右，40℃反应4h，反应完成之后将其转移到3500d的透析袋中透析3天，冻干。得到的醛化淀粉的醛化度为：50％。
51.2、纳米粒子的合成
52.25mg醛化淀粉溶于ph＝8的5.6ml碳酸钠缓冲溶液中，溶解完全后加入到11ml的无水乙醇中，搅拌30min后同时加入3.075mg妥布霉素和36.9mgmpeg
‑
nh2(mw＝2000g mol
‑1)，室温下反应2h。反应完成后12000rpm离心除去上清液，再加离子水超声清洗后离心，重复三遍，冻干，所得材料命名为stp41。
53.3、抗菌性能
54.将样品首先在96孔板中进行梯度稀释为2
‑
2048μg/ml，每孔70μl每组三个平行样品。在每孔中加入70μl 2
×
105cfu/ml金黄色葡萄球菌悬浮液，放置在摇床中培养12h。用酶标仪读取od值。
55.实施例3
56.1、醛化海藻酸钠的合成
57.2g海藻酸钠溶于100ml去离子水中，加入1.1g高碘酸钠，40℃避光反应4h，用过量乙二醇终止反应，反应完成之后将其转移到3500d的透析袋中透析3天，冻干。得到的醛化淀粉的醛化度为：60％。
58.2、纳米粒子的合成
59.25.5mg醛化海藻酸钠溶于ph＝8的5.6ml碳酸钠缓冲溶液中，溶解完全后加入到11ml的无水乙醇中，搅拌30min后同时加入6.15mg妥布霉素和36.9mg mpeg
‑
nh2(mw＝3000g mol
‑1)，室温下反应2h。反应完成后12000rpm离心除去上清液，再加离子水超声清洗后离心，重复三遍，冻干，所的材料命名为atp21。
60.3、纳米粒子的肺部黏液渗透行为
61.首先配制人工黏液(cf
‑
am),配方如下：500mg dna，250mg黏蛋白，0.295mg dpta，1ml rpmi 1640氨基酸溶液，250μl蛋黄乳液，250mg nacl，110mg kcl加到50ml无核酸酶的水中混合，用1m naoh调其ph至中性。将2ml样品瓶下层放置400μl琼脂糖凝胶，上层放置600μl cf
‑
am，最上层放置经过考马斯亮蓝染色的纳米粒子分散液50μl，记录蓝色纳米粒子层渗透过人工黏液层的时间。
62.4、抗菌性能
63.将样品首先在96孔板中进行梯度稀释为2
‑
2048μg/ml，每孔70μl每组三个平行样品。在每孔中加入70μl 2
×
105cfu/ml金黄色葡萄球菌悬浮液，放置在摇床中培养12h。用酶标仪读取od值。
64.5、动物体内肺部感染治疗实验
65.采用8周龄20g左右的balb/c雌性小鼠分为四组进行实验。采用滴鼻法对以下四组分别进行接种。健康对照组：接种20μl灭菌pbs，不治疗组：接种20μl 1
×
10
10
cfu/ml的金黄色葡萄球菌，保证小鼠的接种浓度为2
×
108cfu/mouse，接种完成后将老鼠垂直放置5min，保证菌能充分通过气管进入肺里，后续这组不进行治疗。atp21组：接种2
×
108cfu/mouse金黄色葡萄球菌，雾化atp21治疗。药物剂量为30mg/kg。用家用雾化器进行雾化给药，根据小鼠的体重用定时器控制雾化给药时间，雾化治疗每天一次，共两次。取出小鼠的肺，右肺用组织固定液固定后进行h&e染色表征，观察组织中的炎症情况。
66.实施例4
67.1、醛化可溶性淀粉的合成
68.5g可溶性淀粉溶于50ml去离子水中，加入3.3g高碘酸钠，使用1m的h2so4调节ph＝3左右，40℃反应4h，反应完成之后将其转移到3500d的透析袋中透析3天，冻干。得到的醛化淀粉的醛化度为：50％。
69.2、纳米粒子的合成
70.25mg醛化淀粉溶于ph＝8的5.6ml碳酸钠缓冲溶液中，溶解完全后加入到11ml的无水乙醇中，搅拌30min后同时加入12.3mg妥布霉素和36.9mg mpeg
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nh2(mw＝5000g mol
‑1)，室温下反应2h。反应完成后12000rpm离心除去上清液，再加离子水超声清洗后离心，重复三遍，冻干，所得材料命名为stp12。
71.实施例5
72.1、醛化可溶性淀粉的合成
73.5g可溶性淀粉溶于50ml去离子水中，加入3.3g高碘酸钠，使用1m的h2so4调节ph＝3
左右，40℃反应4h，反应完成之后将其转移到3500d的透析袋中透析3天，冻干。得到的醛化淀粉的醛化度为：30％。
74.2、纳米粒子的合成
75.41.7mg醛化淀粉溶于ph＝8的5.6ml碳酸钠缓冲溶液中，溶解完全后加入到11ml的无水乙醇中，搅拌30min后加入6.15mg妥布霉素，室温下反应2h。反应完成后12000rpm离心除去上清液，再加离子水超声清洗后离心，重复三遍，冻干，得到st21。
76.3、纳米粒子的肺部黏液渗透行为
77.首先配制人工黏液(cf
‑
am),配方如下：500mg dna，250mg黏蛋白，0.295mg dpta，1ml rpmi 1640氨基酸溶液，250μl蛋黄乳液，250mg nacl，110mg kcl加到50ml无核酸酶的水中混合，用1m naoh调其ph至中性。将2ml样品瓶下层放置400μl琼脂糖凝胶，上层放置600μl cf
‑
am，最上层放置经过考马斯亮蓝染色的纳米粒子分散液50μl，记录蓝色纳米粒子层渗透过人工黏液层的时间。
78.图2为纳米药物表面形态特征示意图，从图中可以看出实施例1、实施例2及实施例3纳米粒子分散性良好，实施例4及实施例5纳米粒子分散性差，实施例4的氨基糖苷类抗生素中的氨基与带氨基的亲水mpeg
‑
nh2的摩尔比例为1:2(不在本发明请求保护的3:1
‑
2:1的范围内)，说明氨基糖苷类抗生素中的氨基与带氨基的亲水mpeg
‑
nh2的摩尔比例会影响纳米粒子的分散性，抗生素上氨基的量过多，会占据mpeg
‑
nh2上氨基的位点，导致反应上mpeg
‑
nh2的量减少，这导致纳米粒子表面无法形成亲水层，实施例5没有添加mpeg
‑
nh2，也无法形成亲水层，因此会导致纳米粒子之间相互交联发生团聚，团聚导致纳米粒子分散性差，无法有效穿透黏液，雾化性能差，纳米粒子无法有效地向深肺部递送，无法杀伤定植在黏液下层的细菌及生物膜。
79.图3为纳米药物的x射线光电子能谱(xps)n 1s分峰结果图，从图中可以看出实施例1、实施例2、实施例3、实施例4及实施例5均在399.8ev附近出现席夫碱键峰位置，这说明均通过席夫碱键成功负载抗生素，实施例1和实施例3峰面积最大，所负载的抗生素量最多，实施例2峰面积相对较小，负载抗生素的量较少，这是由于实施例2所加的抗生素的摩尔量少，实施例2中醛化天然多糖中的醛基与氨基糖苷类抗生素中的氨基的摩尔比为4:1(不在本发明请求保护的3:1
‑
2:1范围内)，因此导致反应上的抗生素的量也大大减少，说明醛化天然多糖中的醛基与氨基糖苷类抗生素中的氨基的摩尔比例会影响抗生素的负载量。
80.图4为纳米药物渗透人工模拟肺部黏液示意图，从图中可以看出实施例1和实施例3具有较好的黏液渗透性能，而实施例5的黏液渗透性相对较差，这是由于实施例1和实施例3表面均具有mpeg
‑
nh2所形成的亲水层，这有利于纳米粒子顺利渗透黏液层，而实施例5只加了抗生素，没有加mpeg
‑
nh2，所以表面不存在亲水层，导致纳米粒子渗透黏液效果相对较差，纳米粒子向肺部感染处的递送效率低，对于定植在黏液下层的细菌及生物膜杀伤效果差。
81.图5为纳米药物抗菌结果图，从图中可以看出实施例1和实施例3相较于实施例2对于金黄色葡萄球菌具有较好的抗菌性，这是因为实施例1和实施例3所加入的抗生素的比例更多，具有更多的药物负载量。
82.图6为纳米药物动物体内肺部治疗实验h&e染色结果图，从图中可以看出相较于不治疗组，实施例1和实施例3两组的肺泡结构较为完整，炎症情况大幅减轻，肺部状况接近健
康对照组，具有良好的治疗效果，这是由于实施例1和实施例3纳米粒子均具有良好的分散性和黏液渗透性，这使得纳米粒子在雾化之后能顺利穿透黏液到达感染部位进行杀菌，产生良好的下呼吸道感染治疗效果。
83.综上所述，实施例1和实施例3两组纳米粒子综合性能最好，均具有良好的分散性，较高的药物负载量，良好的黏液渗透性能，优异的抗菌性能和良好的动物体内肺部感染治疗效果。实施例2虽分散效果较好，但药物负载量低抗菌效果差，实施例4和实施例5分散性差，渗透效果差。因此实施例2、实施例4和实施例5均不可作为严重下呼吸道感染微环境自适应型纳米药物使用。
84.最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。