治疗肠癌的组合物及在肠癌类器官中运用的试验方法与流程

1.本发明涉及一种治疗药物，尤其涉及一种治疗肠癌的组合物及在肠癌类器官中运用的试验方法。


背景技术：

2.结直肠癌是我国最常见的癌症之一，其早期症状不明显，易误诊(误诊率：30％)，所以多数确诊时已是中晚期，预后目前取决于早期诊断和及时手术治疗，普通药物干预精准度不高。
3.类器官技术是新兴的疾病模拟工具，其能较高的保留原始组织的遗传信息和生理特点，是一种比癌症细胞系模型或动物模型更可靠、更经济的研究模型。
4.结直肠癌类器官的构建技术正在完善，并已开始应用于研究结直肠癌发生发展过程、筛选抗肿瘤药物、个性化治疗肿瘤、构建pdx动物模型以及再生医学等方面。
5.氯喹是一种广泛用于治疗疟疾和类风湿性关节炎的抗疟疾和抗炎剂。随着对其越来越深入的研究，证实了氯喹对冠状病毒、流感病毒和埃博拉病毒等的抗病毒作用；对系统性红斑狼疮、类风湿关节炎等风湿疾病的治疗作用；以及对肿瘤细胞的抑制作用。
6.青蒿素目前主要被用于控制间日疟、恶性疟的症状，或治疗耐氯喹虫株引起的疟疾，也可用以治疗凶险型恶性疟，如脑型、黄疸型等；除治疗疟疾外，它还常被用来治疗系统性红斑狼疮与盘状红斑狼疮。近年来，国内外学者逐渐研究发现了青蒿素类药物的抗癌作用，其对胰腺癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、淋巴瘤、胶质瘤、乳腺癌及肺癌等肿瘤细胞具有显著的细胞毒作用，而对正常细胞代谢几乎没有影响。
7.目前，国内外对组合使用氯喹和青蒿素用于肠癌治疗的文献报道较少，且均采用细胞或小鼠模型确定组合物配比，由于上述两种模型与人体内的组织情况有较大差异，所得研究结果对临床的借鉴意义相对较小。


技术实现要素：

8.针对现有技术中存在的上述不足，本发明提供了一种治疗肠癌的组合物及在肠癌类器官中运用的试验方法，在短期内，有效的确定氯喹与青蒿素的组合物对结直肠癌的作用效果；使用结直肠癌类器官模型确定组合物的最佳比例，为临床提供更适用于人体的药物配比参考。
9.为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
10.一种治疗肠癌的组合物，组合物配比(μm)：氯喹：青蒿素＝2:(40
‑
60)。
11.组合物在肠癌类器官中运用的试验方法，该方法包括如下步骤：
12.1)选择10代以内且状态稳定的结肠癌类器官进行药物敏感性试验；
13.2)培养22
‑
24h后换为含药培养基，并每隔3天换液1次；
14.3)配制各组所需药物：
15.阴性对照组：完全培养基
16.单独用药组：
17.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)
18.青蒿素(100μm、50μm、25μm)
19.混合用药组：
20.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)+青蒿素(100μm)
21.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)+青蒿素(50μm)
22.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)+青蒿素(25μm)
23.阳性对照组：bortezomib(10μm)；
24.4)形态学记录：在给药第0、6天时，拍照记录阴性对照组和实验组各浓度的类器官形态；
25.5)细胞活性检测：给药第6天时，将384孔细胞培养板放于22
‑
25℃的室温平衡30min，celltiter
‑
glo3d检测试剂22℃水浴30min后，每孔加入与培养基等量的celltiter
‑
glo3d检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光值；计算相对存活率，使用prism软件做出相对存活率热图，并分析单独用药组与混合用药组各浓度相对存活率的显著性差异，得出氯喹与青蒿素的最佳配比。
26.与现有技术相比，本发明具有如下优点：
27.1、结直肠癌类器官对药物的敏感性更接近于人体内结直肠癌组织对药物的敏感性，所得药敏结果对临床更具参考性，也更精准化。
28.2、组合物较单药对癌症类器官的杀伤力显著性增强。
29.3、组合物所用氯喹和青蒿素的剂量低于单独用药剂量，降低了高剂量单独用药产生副作用的可能性。
附图说明
30.图1是全外显子检测的实验结果图；
31.图1说明：结肠癌类器官在肿瘤易感基因、已知驱动基因、高频突变基因方面各个基因的结果图与结肠癌组织的结果图基本一致，表明结肠癌类器官与原始组织的遗传信息相似度极高。
32.图2是免疫组化检验的实验结果图；
33.图2说明：结肠癌类器官内特定蛋白标记物(深色颗粒)的分布和含量与结肠癌组织内的基本一致，表明结肠癌类器官与原始组织的组织特性高度相似。
34.图3是形态学记录的实验结果图；
35.图3说明：图中为实验组各组与阴性对照组给药第0天和第6天时的形态学观察图汇总；各组各浓度作用的肠癌类器官均有不同程度的生长，但均不及阴性对照得生长状态。
36.图4是实验各组肠癌类器官相对存活率热图；
37.图4说明：每列表示肠癌类器官在相同浓度氯喹、不同浓度青蒿素的作用下的相对存活率，每行表示肠癌类器官在相同浓度青蒿素、不同浓度的氯喹每个实验小组中作用下的相对存活率；且相对存活率越高，颜色越深。
38.图5是联合使用100μm青蒿素肠癌类器官相对存活率显著性差异图；
39.图6是联合使用50μm青蒿素肠癌类器官相对存活率显著性差异图；
40.图7是联合使用25μm青蒿素肠癌类器官相对存活率显著性差异图；
41.图8是联合用药肠癌类器官相对存活率显著性差异图；
42.图5
‑
图8说明：横坐标为体系内氯喹浓度，纵坐标为肠癌类器官相对存活率。图中“—”的起点与终点所指对象为显著性差异比较对象；其中，“*”表示p＜0.05，“**”表示p＜0.01，“***”表示p＜0.001，“****”表示p＜0.0001。
具体实施方式
43.下面结合附图和具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述。
44.一种治疗肠癌的组合物，组合物配比(μm)：氯喹：青蒿素＝2:(40
‑
60)。
45.实施例一：结直肠癌类器官质量控制
46.将培养至第3代的结肠癌类器官及原始肿瘤组织送至第三方检验机构进行全外显子检测和免疫组化检验，确定结肠癌类器官与原始肿瘤组织的基因型及表型是否一致。
47.结果如下：全外显子检测，如图1所示，结肠癌类器官与原始肿瘤组织的遗传信息具有高度相似性。免疫组化检验，如图2所示，结肠癌类器官保留了原始肿瘤组织的表型多样性，可以真实反映原始肿瘤特性。
48.实施例二：氯喹
‑
青蒿素组合物在肠癌类器官中运用的试验方法
49.1)选择10代以内且状态稳定的结肠癌类器官进行药物敏感性试验。
50.2)设置阴性对照组、实验组和阳性对照组。
51.3)培养22
‑
24h后换为含药培养基，并每隔3天换液1次。
52.4)配制各组所需药物：
53.阴性对照组：完全培养基
54.单独用药组：
55.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)
56.青蒿素(100μm、50μm、25μm)
57.混合用药组：
58.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)+青蒿素(100μm)
59.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)+青蒿素(50μm)
60.氯喹(15μm、10μm、5μm、2μm、1.25μm、0.625μm)+青蒿素(25μm)
61.阳性对照组：bortezomib(10μm)。
62.5)形态学记录：在给药第0、6天时，拍照记录阴性对照组和实验组各浓度的类器官形态。
63.6)细胞活性检测：给药第6天时，将384孔细胞培养板放于22
‑
25℃的室温平衡30min，celltiter
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glo3d检测试剂22℃水浴30min后，每孔加入与培养基等量的celltiter
‑
glo3d检测试剂，在微孔震荡仪上震荡5min，充分混匀，室温放置25min后，使用酶标仪检测发光值；计算相对存活率，使用prism软件做出相对存活率热图，并分析单独用药组与混合用药组各浓度相对存活率的显著性差异，得出氯喹与青蒿素的最佳配比。
64.本实施例的实验结果如下：
65.形态学记录，如图3所示。
66.细胞活性检测，相对存活率如图4所示。
67.图5为联合使用100μm青蒿素肠癌类器官相对存活率显著性差异图，图6为联合使用50μm青蒿素肠癌类器官相对存活率显著性差异图；图7为联合使用25μm青蒿素肠癌类器官相对存活率显著性差异图；图8为联合用药肠癌类器官相对存活率显著性差异图。
68.结合形态学记录结果和相对存活率热图可以直观的看出：实验组类器官的生长状态随氯喹浓度的减小而趋于正常，且混合用药组类器官的生长状态还随着青蒿素浓度的降低而趋于正常。
69.从实验组相对存活率显著性差异图可以分析得到：以0.625μm
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2μm的氯喹混合50μm/100μm的青蒿素用药，癌症类器官的相对存活率明显低于单独用药；其中，1.25μm氯喹混合100μm青蒿素的作用的类器官相对存活率最低。
70.结合以上实验结果，可以确定氯喹与青蒿素的组合物较单药对结直肠癌类器官的杀伤力显著性增强；且1.25μm氯喹混合100μm青蒿素时对结直肠癌类器官的杀伤力最大，但由于100μm青蒿素的细胞用药浓度换算至实际应用于人体时过大，所以舍弃混合100μm青蒿素的方案，选择2μm氯喹联合40
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60μm青蒿素的比例作为氯喹与青蒿素组合物的最佳浓度配比。
71.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。