负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途

本发明属于生物，具体地，涉及一种负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途。

背景技术：

1、近年来，人们开发了多种抗癌药物，包括小分子化疗药物。然而，传统的化疗药物带来了严重的副作用，包括全身毒性和多药耐药性(mdr)等。基于核酸的治疗方法的出现提供了替代性抗癌治疗，这有助于改善小分子治疗药物的副作用。

2、因此，亟需提供一种稳定有效的核酸药物。

技术实现思路

1、本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种负载囊泡及其制备方法、试剂盒、药品和用途，该负载囊泡负载有反义dna，其进入到细胞内，能促进癌细胞凋亡，且具有稳定性高、可控释放反义dna等优点；并且，该制备方法具有操作简单等优点。

2、需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

3、反义寡核苷酸主要由15-25个核苷酸组成，包括反义dna和反义rna。反义dna的化学治疗机制提供了一种遗传水平层面的途径，通过合理设计高度序列特异性的核酸药物，能够靶向与信使rna(mrna)结合，从而通过空间阻断mrna翻译。但是，发明人发现，反义dna分子量大、带负电荷，在没有人工载体的情况下很难穿透细胞膜，并且，传统的反义dna在细胞内环境中容易被酶降解，使其抑制mrna翻译的作用大大降低。

4、有鉴于此，发明人通过大量试验发现，采用聚(丙)二醇(ppo)化学共轭和可还原的二硫化物键修饰反义dna，然后将其负载于囊泡层或纳米粒上，从而使反义dna能够顺利穿过细胞膜进入到细胞内，抑制mrna翻译，达到促进癌细胞凋亡的目的，并且，该负载囊泡含有反义dna，具有稳定性强和可控释放反义dna等优点。

5、因而，在本发明的一个方面，本发明提出了一种负载囊泡。根据本发明的实施例，所述负载囊泡包含：dna修饰的纳米粒；囊泡层，所述囊泡层包覆在所述dna修饰的纳米粒的外部；反义dna，所述反义dna负载于所述纳米粒和/或所述囊泡层上。

6、发明人通过大量试验发现，该负载囊泡中含有反义dna，以提高其靶向作用效果。具体地，负载囊泡进入细胞后，能够在胞内还原环境下解组装，释放反义dna，其靶向与mrna互补结合后，在rnase h酶的作用下，抑制mrna翻译，从而促进癌细胞凋亡；并且，该负载囊泡含有反义dna，具有稳定性强和可控释放反义dna等优点。

7、根据本发明的实施例，上述囊泡还进一步包括如下附加技术特征的至少之一：

8、根据本发明的实施例，所述囊泡层包括组装dna，所述组装dna的至少一部分与所述纳米粒上的修饰dna的至少一部分互补。由此，通过组装dna的至少一部分与所述纳米粒上的修饰dna的至少一部分互补，使组装dna和修饰dna互补结合，从而实现囊泡层和dna修饰的纳米粒组装成负载囊泡的框架。

9、根据本发明的实施例，所述组装dna为ppo-s-s-b-dna或者ppo-s-s-b-dna。由此，利用ppo-s-s-b-dna引入氧化还原响应性的二硫键，后期利用框架诱导自组装的策略得到具有响应性的负载囊泡。

10、根据本发明的实施例，所述纳米粒为金纳米粒，所述修饰dna为巯基dna。由此，巯基dna通过au-s键链接到纳米粒上，形成dna修饰的纳米粒。

11、根据本发明的实施例，所述金纳米粒的直径为10-15nm。

12、根据本发明的实施例，所述纳米粒为二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐保护的金纳米粒。由此，通过二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐(bspp)对纳米粒进行保护，使金纳米颗粒能够稳定存在，不容易聚沉。根据本发明的实施例，所述反义dna与所述组装dna的序列相同。发明人通过大量试验发现，当反义dna和组装dna的序列相同时，当负载囊泡进入到细胞中，组装dna上的dna序列被释放，其能够靶向与mrna互补结合，抑制mrna翻译，进一步促进癌细胞凋亡。

13、根据本发明的实施例，所述反义dna和所述组装dna具有seq id no:1所示的核苷酸序列或者具有与其至少80％同源性的核苷酸序列。发明人通过大量试验发现，该反义dna序列能够阻止bcl-2mrna的翻译，从而促进乳腺癌细胞凋亡。其中，seq id no:1为tctcccagcgtgcgccat。

14、根据本发明的实施例，所述修饰dna具有如seq id no：2所示的核苷酸序列或者具有与其至少80％同源性的核苷酸序列。由此，该修饰dna的部分序列与组装dna的部分序列互补，从而将dna修饰的纳米金与组装dna互补结合形成框架。其中，seq id no:2为tttatggcgcacgctggg。

15、根据本发明的实施例，所述反义dna为ppo-s-s-b-dna或者ppo-s-s-dna。发明人通过试验发现，将ppo化学共轭和可还原的二硫化物键修饰反义dna，在提高反义dna稳定性的基础上，又能对反义dna进行可控释放。

16、根据本发明的实施例，所述负载囊泡的直径为30-50nm，由此，该负载囊泡含有反义dna，具有稳定性强和可控释放反义dna等优点，可进一步促进癌细胞凋亡。

17、在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备上述的负载囊泡的方法。根据本发明的实施例，所述方法包含：(1)将dna修饰的纳米粒和囊泡层进行组装，得到框架；(2)将反义dna与所述框架混合进行反应，以便所述反义dna负载于所述dna修饰的纳米粒或所述囊泡层上，制得负载囊泡。

18、根据本发明的实施例，先将dna修饰的纳米粒和囊泡层组装得到框架，然后加入反义dna，使反义dna在框架周围通过疏水作用力形成负载囊泡。该制备方法能够将反义dna有效地负载于框架上，且制备方法操作简单，制得的负载囊泡稳定性强。

19、根据本发明的实施例，步骤(2)中，所述反义dna与所述框架于25-40℃条件下反应30-60min。发明人通过大量试验发现，采用上述温度，能够使亲水的框架变为疏水的框架，在疏水基团的诱导下，可使反义dna在框架周围通过疏水作用力形成负载囊泡。

20、根据本发明的实施例，所述反义dna与所述框架的摩尔比600-700：1，优选为660-670:1。发明人通过试验发现，采用上述配比，能够充分使反义dna负载于框架上，从而提高负载囊泡的得率。

21、根据本发明的实施例，所述dna修饰的纳米粒的制备步骤包含：将巯基dna与金纳米粒加入至缓冲液中静置12-24h，然后加入nacl至终浓度为400-600mm，继续反应得到含有dna修饰的纳米粒的粗液。发明人通过试验发现，静置6-12h，能够使巯基dna与金纳米粒充分结合，形成au-s键；通过加入nacl至终浓度为400-600mm，可以屏蔽电荷，稳定链的结构，减小彼此之间的斥力，使dna更容易接到金颗粒上。发明人通过试验发现，若nacl的终浓度过低，会因为屏蔽不到位，导致dna链接到金颗粒上的数量变少；若nacl的终浓度过高，会因为离子强度过大引起聚沉。

22、根据本发明的实施例，所述巯基dna的摩尔量为所述金纳米粒摩尔量的150-300倍，优选为200倍。采用上述配比，能够使巯基dna和金纳米粒充分结合，提高原料的利用率。

23、根据本发明的实施例，所述缓冲液包含0.4-0.5×tbe和30-60mm nacl，所述缓冲液的ph值为8-9。由此，采用上述缓冲液，能够提高制备负载囊泡的效率。

24、根据本发明的实施例，于4-6h内逐步提升所述nacl浓度至400-600mm。发明人通过试验发现，若采用快速加入的方式，容易引起团聚；采用上述方式逐步加入nacl可防止瞬间离子强度过大而引起团聚。

25、根据本发明的实施例，将所述含有dna修饰的纳米粒的粗液依次经过第一离心、第一复溶后得到所述dna修饰的纳米粒。由此，将含有dna修饰的纳米粒的粗液进行第一离心、第一复溶后可得到纯度较高的dna修饰的纳米粒。

26、根据本发明的实施例，所述第一离心于8000-12000rpm条件下离心25-35min。由此，能够使dna修饰的纳米粒沉淀，从而去除含有杂质的上清液。

27、根据本发明的实施例，所述第一离心重复2次以上，优选为2次。由此，可进一步去除杂质。

28、根据本发明的实施例，将所述第一离心后得到的沉淀于第一复溶液内进行所述第一复溶。由此，能够得到纯度较高的dna修饰的纳米粒溶液。

29、根据本发明的实施例，所述第一复溶液包含0.4-0.5×tbe和30-60mm nacl，所述第一复溶液的ph值为8-9。由此，能够使dna修饰的纳米粒在第一复溶液中稳定储存。

30、根据本发明的实施例，步骤(1)中，将所述dna修饰的纳米粒与组装dna混合，于3-5℃条件下静置12-24h，得到含有框架的粗液。发明人通过大量试验发现，采用上述条件，能够使修饰dna与组装dna充分互补，从而形成框架。

31、根据本发明的实施例，将所述含有框架的粗液依次经过第二离心、第二复溶后，得到框架。由此，将含有框架的粗液进行第二离心、第二复溶后可得到纯度较高的框架。

32、根据本发明的实施例，所述第二离心于8000-12000rpm条件下离心25-35min。由此，能够使框架充分沉淀，从而去除杂质。

33、根据本发明的实施例，所述第二离心重复2次以上，优选为3次。由此，可尽量去除框架中未结合的组装dna。

34、根据本发明的实施例，将所述第二离心后得到的沉淀于第二复溶液内进行所述第二复溶。由此，能够得到纯度较高的框架溶液。

35、根据本发明的实施例，所述第二复溶液包含0.4-0.5×tbe和30-60mm nacl，所述第二复溶液的ph值为8-9。由此，能够使框架在第二复溶液中稳定储存。

36、根据本发明的实施例，所述组装dna的摩尔量为所述dna修饰的纳米粒摩尔量的800-900倍；优选为850-870倍。发明人通过试验发现，采用上述配比，能够提高制得的框架的得率。

37、在本发明的又一方面，本发明提出了一种试剂盒或药品。根据本发明的实施例，所述试剂盒或药品包含上述的负载囊泡或上述方法制备的负载囊泡。

38、根据本发明的实施例，采用含有上述负载囊泡的试剂盒或药品，在与细胞共孵育之后，会被细胞内的还原性谷胱甘肽(gsh)还原，负载囊泡开始解组装，释放反义dna，与mrna互补后，抑制mrna反义，从而达到促进癌细胞凋亡的目的。在该实验中，所用谷胱甘肽为细胞内10mm的浓度，这也为该负载囊泡在癌细胞内作用提供了依据。

39、根据本发明的实施例，所述负载囊泡的终浓度为0.5-4nm(加入搭配细胞溶液的终浓度)，优选为2-3nm。发明人通过大量试验发现，当负载囊泡浓度为0.5-3nm时，癌细胞的存活率下降到80％以下；当负载囊泡浓度为2-3nm时，癌细胞的存活率下降到60％以下。

40、在本发明的又一方面，本发明提出了一种上述的负载囊泡或上述方法制备的负载囊泡或上述的试剂盒或药品在制备促进癌细胞凋亡的产品中的用途。根据本发明的实施例，负载囊泡在与细胞共孵育之后，会被细胞内的还原性谷胱甘肽(gsh)还原，负载囊泡开始解组装，释放反义dna，与mrna互补后，抑制mrna反义，从而达到促进癌细胞凋亡的目的。

41、根据本发明的实施例，所述癌细胞包含乳腺癌细胞、肺腺癌细胞、人脑胶质瘤细胞、人前列腺细胞、人宫颈癌细胞。由此，本发明的反义dna适用于上述癌细胞。

42、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。