一种干细胞护肤产品的制作方法

1.本发明涉及生物美容技术领域，尤其涉及一种干细胞护肤产品。


背景技术：

2.随着生活水平的不断提高，人们对生活品质的要求也逐渐提高，对于延缓衰老保持青春的需求就显得尤为重要。皮肤作为人体最大的组织器官，覆盖于人体的外表，展示着人们的外表形象。化妆品的使用可以通过遮掩缺陷或是在皮肤表层起作用来达到改善肌肤问题的目的，但效果不显著，不能从根本上改善暗沉、衰老等皮肤问题。
3.研究表明，皮肤表皮细胞的自我更新、再生修复以及衰老退变是由来自毛囊或表皮基底层的成体干细胞——表皮干细胞的增殖分化所决定的。研究表明，干细胞能激活机体整体上处于休眠状态下的各种干细胞群，以替代更新原有的因衰老或病理性等因素所造成组织细胞的衰退和老化，达到组织器官功能的恢复，增强组织器官的活性和原有的抗耐受力，改善因衰老等因素所造成的细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间的信息传递，增强和加快各组织细胞的新老更替等作用。
4.传统的干细胞美容需要将干细胞注射进皮肤真皮层，对操作者的要求较高。现在研究发现，干细胞培养过程种所分泌的细胞因子更易被皮肤吸收。然而普通的生长因子寡肽类产品作用机理单一，且外泌体囊泡存在聚集、融合等缺陷影响功效，效果有待进一步加强。


技术实现要素：

5.基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种干细胞护肤产品。
6.本发明提出的一种干细胞护肤产品，其原料包括：脂肪干细胞外泌体冻干粉和溶媒；其中，脂肪干细胞外泌体冻干粉由以下原料经冷冻干燥制成：壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物、冻干剂；溶媒包括熊果苷、透明质酸、人参总皂苷、黄芩提取物、甘油、丁二醇、去离子水。
7.优选地，壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物的制备如下：将脂肪干细胞常规培养，取传代培养至p3或p4代的脂肪干细胞，用去除外泌体的完全培养基培养，同时加入0.05
‑
0.2wt％的壳聚糖，培养48h后收集上清液，4℃下2000g离心15min，取上清液，再在4℃下3000g离心20min，取上清液，加入exoquick
‑
tc外泌体沉淀液，冷藏过夜，再在4℃下1500g离心30min，取沉淀，即得壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物；将其加入pbs重悬，得外泌体浓缩液，采用bca法测蛋白浓度。
8.上述脂肪干细胞常规培养，具体如下：采集并清洗脂肪组织，绞碎，加入ⅰ型胶原酶消化至糊状，过滤，加入完全培养基终止消化，以1200rpm离心6min，弃去上清液，保留下层的细胞沉淀；用完全培养基重悬接种培养，待细胞生长达到80
‑
90％融合时，传代培养。
9.优选地，壳聚糖m
w
＝40
‑
50kd。
10.优选地，完全培养基的组成为：dmem/f12+10％pbs+1％双抗。
11.优选地，所述冻干剂包括海藻糖和甘露醇；两者的质量百分比为20
‑
40：60
‑
80。
12.优选地，所述脂肪干细胞外泌体冻干粉的制备如下：将壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物重悬于pbs，得外泌体浓缩液，向其中加入冻干剂，然后用0.22μm滤膜过滤，分装后低温预冻24h，然后在超低温冷冻干燥机冷冻干燥24h，即得冻干粉。
13.优选地，冻干剂在外泌体浓缩液中的浓度为20
‑
30ng/ml。
14.优选地，所述溶媒包括以下质量百分比的原料：熊果苷1
‑
5％、透明质酸1
‑
3％、人参总皂苷0.2
‑
1％、黄芩提取物0.2
‑
1％、甘油5
‑
10％、丁二醇2
‑
4％，余量为去离子水。
15.优选地，所述黄芩提取物是将黄芩粉碎，加水提取得到的。
16.优选地，所述脂肪干细胞外泌体冻干粉和溶媒的质量体积比为20
‑
25：1。
17.有益效果：本发明提出了一种干细胞护肤产品，是在脂肪干细胞传代培养的过程中加入壳聚糖，壳聚糖的舒展分子链和卷曲分子链能够与外泌体囊泡结合，以小囊状结构包裹在外泌体囊泡外，改善囊泡的聚集、融合等缺陷，此外，壳聚糖分子还能通过疏水作用渗透进入膜内，增加其流动性，有效促进外泌体因子的释放和细胞增殖分化；该壳聚糖
‑
外泌体复合物更易渗透和被皮肤吸收，将其制成冻干粉后与溶媒配合使用，外泌体活性成分通过涂抹就可以突破角质层传递到内部皮肤组织，全方位的从表层肌肤到深层肌肤修护受损肌肤，刺激成纤维细胞增殖和胶原合成，减少皮肤基质降解；且采用海藻糖和甘露醇作为冻干保护剂，保护效果好，囊泡粒径变化小。
18.外泌体与熊果苷、透明质酸、人参总皂苷、黄芩提取物等配伍，能提高细胞再生能力，有效去除皱纹和暗沉肤色，充分滋润肌肤，促进血液循环；黄芩中的生物碱、挥发油、黄酮均有不同程度的抗氧化作用以及抑制酪氨酸酶活性的功效，采用其提取物，多个成分复配效果更好；并添加人参总皂苷配合，提高皮肤的新陈代谢，改善微循环，增强皮肤弹性，抑制黑色素生成。
19.本发明护肤产品通过修护、滋养、赋活三者协同作用，从根源上延缓皮肤衰老，改善暗黄、粗糙等肌肤问题，有淡斑提亮、淡化细纹、细化毛孔、修复增生疤痕、恢复皮肤弹性、减少色素沉着等效果。
具体实施方式
20.下述实施例中壳聚糖的m
w
＝40
‑
50kd；脂肪干细胞培养所采用的完全培养基的组成为：dmem/f12+10％pbs+1％双抗。
21.下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
22.实施例1
23.干细胞护肤产品的制备：
24.1、脂肪干细胞培养：采集并清洗脂肪组织，绞碎，加入ⅰ型胶原酶消化至糊状，过滤，加入完全培养基终止消化，以1000rpm离心10min，弃去上清液，保留下层的细胞沉淀；用完全培养基重悬接种培养，待细胞生长达到80
‑
90％融合时，传代培养；
25.2、壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物制备：脂肪干细胞培养至p4代时，当融合率达到85％时，用去除外泌体的完全培养基培养，同时加入0.1wt％的壳聚糖，培养48h后收集上清液，4℃下2000g离心15min，取上清液，再在4℃下3000g离心20min，取上清液，加入exoquick
‑
tc外泌体沉淀液，冷藏过夜，再在4℃下1500g离心30min，取沉淀，即得壳聚糖
‑
脂
肪干细胞外泌体复合物；
26.3、脂肪干细胞外泌体冻干粉制备：将壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物重悬于pbs，得外泌体浓缩液，向其中加入由海藻糖和甘露醇按照30：70的质量比组成的冻干剂，控制冻干剂在外泌体浓缩液中的浓度为25ng/ml，然后用0.22μm滤膜过滤，分装后低温预冻24h，然后在超低温冷冻干燥机冷冻干燥24h，即得冻干粉；
27.4、溶媒制备：按照以下质量百分比：熊果苷3％、透明质酸1.5％、人参总皂苷0.5％、黄芩提取物0.5％、甘油8％、丁二醇3％，余量为去离子水，将各原料混合，得到溶媒。
28.使用时，将脂肪干细胞外泌体冻干粉和溶媒按照25mg：1ml的质量体积比混合。
29.实施例2
30.干细胞护肤产品的制备：
31.1、脂肪干细胞培养：采集并清洗脂肪组织，绞碎，加入ⅰ型胶原酶消化至糊状，过滤，加入完全培养基终止消化，以1000rpm离心10min，弃去上清液，保留下层的细胞沉淀；用完全培养基重悬接种培养，待细胞生长达到80
‑
90％融合时，传代培养；
32.2、壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物制备：脂肪干细胞培养至p4代时，当融合率达到85％时，用去除外泌体的完全培养基培养，同时加入0.05wt％的壳聚糖，培养48h后收集上清液，4℃下2000g离心15min，取上清液，再在4℃下3000g离心20min，取上清液，加入exoquick
‑
tc外泌体沉淀液，冷藏过夜，再在4℃下1500g离心30min，取沉淀，即得壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物；
33.3、脂肪干细胞外泌体冻干粉制备：将壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物重悬于pbs，得外泌体浓缩液，向其中加入由海藻糖和甘露醇按照20：80的质量比组成的冻干剂，控制冻干剂在外泌体浓缩液中的浓度为20ng/ml，然后用0.22μm滤膜过滤，分装后低温预冻24h，然后在超低温冷冻干燥机冷冻干燥24h，即得冻干粉；
34.4、溶媒制备：按照以下质量百分比：熊果苷1％、透明质酸1％、人参总皂苷0.2％、黄芩提取物0.2％、甘油10％、丁二醇2％，余量为去离子水，将各原料混合，得到溶媒。
35.使用时，将脂肪干细胞外泌体冻干粉和溶媒按照25mg：1ml的质量体积比混合。
36.实施例3
37.干细胞护肤产品的制备：
38.1、脂肪干细胞培养：采集并清洗脂肪组织，绞碎，加入ⅰ型胶原酶消化至糊状，过滤，加入完全培养基终止消化，以1000rpm离心10min，弃去上清液，保留下层的细胞沉淀；用完全培养基重悬接种培养，待细胞生长达到80
‑
90％融合时，传代培养；
39.2、壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物制备：脂肪干细胞培养至p4代时，当融合率达到85％时，用去除外泌体的完全培养基培养，同时加入0.2wt％的壳聚糖，培养48h后收集上清液，4℃下2000g离心15min，取上清液，再在4℃下3000g离心20min，取上清液，加入exoquick
‑
tc外泌体沉淀液，冷藏过夜，再在4℃下1500g离心30min，取沉淀，即得壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物；
40.3、脂肪干细胞外泌体冻干粉制备：将壳聚糖
‑
脂肪干细胞外泌体复合物重悬于pbs，得外泌体浓缩液，向其中加入由海藻糖和甘露醇按照40：60的质量比组成的冻干剂，控制冻干剂在外泌体浓缩液中的浓度为30ng/ml，然后用0.22μm滤膜过滤，分装后低温预冻24h，然后在超低温冷冻干燥机冷冻干燥24h，即得冻干粉；
41.4、溶媒制备：按照以下质量百分比：熊果苷5％、透明质酸3％、人参总皂苷1％、黄芩提取物1％、甘油5％、丁二醇4％，余量为去离子水，将各原料混合，得到溶媒。
42.使用时，将脂肪干细胞外泌体冻干粉和溶媒按照25mg：1ml的质量体积比混合。
43.对比例
44.与实施例1相比，区别仅在于步骤2中不添加0.1wt％的壳聚糖。
45.效果测试评价。
46.评价方法：选择受试者400人，其中女性300人，男性100人，年龄在35
‑
50岁，随机分成四组，每组100人，四组无显著性差异。每组分别使用实施例1
‑
3和对比例中制备的护肤产品，于每日早上和晚上，洁面后涂抹爽肤水后，再涂抹本发明实施例或对比例中的护肤产品，持续使用3个月。3个月后，于早晨洁面30min后，采用cbs
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1800皮肤分析系统，在温度25℃，湿度45％的室内测试受试者面部肌肤的水分、弹性、皱纹等指标，并计算相较于使用前的增幅，其中显著改善表示参数改变幅度达20％以上，一般改善表示参数改变幅度在10
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20％，无改善表示参数改变幅度在10％以下，统计各范围区间内人数。
47.测试结果如表1所示。
48.表1实施例1
‑
3和对比例中的护肤产品对皮肤改善的相关数据统计
[0049][0050]
从表1中可以看出，相较于对比例，本发明实施例中的护肤产品对皮肤改善的效果更加显著。
[0051]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。