一种具有抗肿瘤活性的海洋原生动物游仆虫提取物浸膏的制作方法

1.本发明属于原生动物提取物技术领域，特别是涉及一种具有抗肿瘤活性的海洋原生动物游仆虫提取物浸膏。


背景技术：

2.恶性肿瘤是人类生命的潜在杀手。全世界恶性肿瘤的发病率和死亡率正逐渐上升，每年有600～700万人死于该病，占总数的12％，成为人类死亡的第二位原因。随着科学技术的发展，肿瘤化疗取得了一定的进展，在白血病、恶性淋巴瘤等患者的寿命明显延长，但对大多数实体瘤仍没有有效的治疗方法办法。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，又将肿瘤分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类。恶性肿瘤可分为癌和肉瘤，癌是指来源于上皮组织的恶性肿瘤。肉瘤是指间叶组织，包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨和软骨组织等，发生的恶性肿瘤，如由大肠黏膜上皮形成的恶性肿瘤称为大肠黏膜上皮癌，简称大肠癌。由皮肤上皮形成的称皮肤上皮癌，简称皮肤癌等等。所以，若医生说某某人患的是癌症，即表明患者长的是恶性肿瘤。传统的细胞毒类药物包括烷化剂类药物、抗代谢类药物、金属铂类药物、抗肿瘤激素类药物和抗肿瘤抗生素由于其使用价值在临床上占有的地位，不过具有治疗效率低，不良反应大及易产生耐药等缺点。从天然资源中筛选和开发新型抗肿瘤药物已成为寻找新型、高效、低毒的抗肿瘤药物的趋势。
3.海洋环境中有丰富的生物资源生成活性天然物，可以用来治疗人类疾病，尤其针对恶性肿瘤。在极端环境下生活的海洋生物，需适应与陆域生物不同的环境条件，从而产生具有种类多样性且复杂高的独特天然化学物质。迄今为止，已从海洋当中的真菌、细菌与微藻等海洋微生物，以及从大型藻类、海绵、珊瑚、软件动物和被囊动物等海洋大型生物中分离出超过36,000种化合物，每年皆以发现数百个新颖海洋天然化合物的速度成长。以海洋天然物为基础的药物已开始在治疗各类疾病中的临床实验中，而多个来自海洋化合物几类的抗癌药物已被批准使用。
4.原生生物是无细胞壁真核单细胞动物，虽然结构简单，但具有维持生命和延续后代所必需的一切功能，目前相关领域的研究集中在形态分类学、系统学、细胞发生学、病害学和生态学等几个方面。近年来研究者们在某些海洋原生动物中提取到了一些抗肿瘤活性物质，例如硅藻thalassiosira weissflogii中获得sulfavant a衍生物能够提高抗原专一性免疫保护并且延缓黑色素瘤的发生和发展。药学上可作为抗肿瘤药物的增效物。原生动物抗肿瘤活性成分的研究具有重要意义，因此我们提出了一种具有抗肿瘤活性的海洋原生动物游仆虫提取物浸膏。


技术实现要素：

5.针对现有的制备肿瘤药物成本较高，原料不易获取以及抗肿瘤活性较低，同时抗肿瘤抗生素具有治疗效率低，不良反应大及易产生耐药等缺点本发明提供一种具有抗肿瘤活性的海洋原生动物游仆虫提取物浸膏，为寻找新型、高效、低毒的抗肿瘤药物提供了资
源。
6.为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：
7.本发明为一种具有抗肿瘤活性的海洋原生动物游仆虫提取物浸膏，包括海洋游仆虫浸膏的制备方法，所述海洋游仆虫浸膏的制备方法包括：从环境中分离纯化游仆虫种群、游仆虫的扩大培养和浸膏制备，所述从环境中分离纯化游仆虫种群的步骤为：
8.步骤一：从海水中采集原生动物群落，然后在显微镜下吸取一只游仆虫；
9.步骤二：用麦粒培养液扩大培养，获得游仆虫的单一种群。
10.进一步地，所述游仆虫的扩大培养包括以下步骤：
11.步骤一：接种游仆虫的单一种群入液体培养基，在25℃低速摇床培养2个月，扩大培养达到5l规模；
12.步骤二：将所得的样品进行离心，并收集虫体，离心时的转速为3000转每分钟，离心时间为10分钟。
13.进一步地，所述浸膏制备包括以下步骤：
14.步骤一：用甲醇进行萃取，反复萃取3次，萃取的方法是将甲醇加入离心后去除水样的沉积物中，采用高速弥散机将沉积物打成匀浆，离心时的转速为12000转每分钟，离心时间为10分钟；
15.步骤二：取上清甲醇样，采用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，然后用甲醇复溶至5ml，并在4℃的环境下保存备用。
16.进一步地，所述肿瘤为人宫颈癌、人肺癌和人肝癌。
17.本发明具有以下有益效果：
18.1、本发明的海洋游仆虫浸膏，浸膏对宫颈癌hela细胞、非小细胞肺癌a549细胞和肝癌hepg2细胞具有较强的抑制作用，表现出较强的体外抗肿瘤活性和广谱抗肿瘤的特点，抗肿瘤活性高，能用于制备抗肿瘤药物，并且来源自海洋原生动物，可通过扩大培养持续获得原料，具有环境友好性，应用成本低。
19.2、本发明的海洋游仆虫浸膏能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，可用于开发治疗宫颈癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞的药物，其开发和应用前景十分广阔。
20.当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为本发明的整体连接框图。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它
实施例，都属于本发明保护的范围。
24.请参阅图1所示，本发明为一种具有抗肿瘤活性的海洋原生动物游仆虫提取物浸膏，包括海洋游仆虫浸膏的制备方法，海洋游仆虫浸膏的制备方法包括：从环境中分离纯化游仆虫种群、游仆虫的扩大培养和浸膏制备，从环境中分离纯化游仆虫种群的步骤为：
25.步骤一：从海水中采集原生动物群落，然后在显微镜下吸取一只游仆虫；
26.步骤二：用麦粒培养液扩大培养，获得游仆虫的单一种群，采用麦粒培养液可以扩大培养持续获得原料。
27.游仆虫的扩大培养包括以下步骤：
28.步骤一：接种游仆虫的单一种群入液体培养基，在25℃低速摇床培养2个月，扩大培养达到5l规模，采用液体培养基可以扩大游仆虫的培养；
29.步骤二：将所得的样品进行离心，并收集虫体，离心时的转速为3000转每分钟，离心时间为10分钟。
30.浸膏制备包括以下步骤：
31.步骤一：用甲醇进行萃取，反复萃取3次，萃取的方法是将甲醇加入离心后去除水样的沉积物中，采用高速弥散机将沉积物打成匀浆，离心时的转速为12000转每分钟，离心时间为10分钟；
32.步骤二：取上清甲醇样，采用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，然后用甲醇复溶至5ml，并在4℃的环境下保存备用，制备完成的海洋游仆虫浸膏能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，可用于开发治疗宫颈癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞的药物，抗肿瘤活性高，且源自海洋原生动物，便于获得原料，生产成本较低。
33.肿瘤为人宫颈癌、人肺癌和人肝癌，海洋游仆虫浸膏，浸膏对宫颈癌hela细胞、非小细胞肺癌a549细胞和肝癌hepg2细胞具有较强的抑制作用，表现出较强的体外抗肿瘤活性和广谱抗肿瘤的特点，抗肿瘤活性高，能用于制备抗肿瘤药物，并且来源自海洋原生动物，可通过扩大培养持续获得原料，具有环境友好性，应用成本低，海洋游仆虫浸膏能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，可用于开发治疗宫颈癌细胞、肺癌细胞和肝癌细胞的药物，其开发和应用前景十分广阔，海洋游仆虫浸膏有效地抑制了上述肿瘤细胞的增殖，其抑制细胞增殖的活性较高，便于对肿瘤进行治疗。
34.实施例一：mtt法测定海洋游仆虫浸膏抗肿瘤活性
35.本实施例采用体外细胞毒实验，检测测离体培养的的人肿瘤细胞中加入海洋游仆虫浸膏后的存活率，来测定海洋游仆虫浸膏的抗肿瘤活性。
36.选取的细胞株有：人宫颈癌hela细胞、人非小细胞肺癌a549细胞和人肝癌hepg2细胞。采用mtt法来测定定每种肿瘤细胞的存活率(或死亡率)为50％时的半抑制浓度ic
50
(以上细胞均可以购自atcc)，海洋游仆虫浸膏对上述肿瘤细胞的最低抑菌浓度ic
50
如表1所示：
37.表1海洋游仆虫浸膏的的抗肿瘤细胞半抑制浓度ic
50
结果表病原菌
[0038][0039]
从表1可以看出，本发明的海洋游仆虫浸膏有效地抑制了上述肿瘤细胞的增殖，其抑制细胞增殖的活性较高，能用于制备抗肿瘤药物，开发和应用前景十分广阔，实验证明，本发明的海洋游仆虫浸膏能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，可作为抗肿瘤药物进行开发，实施例验证了本发明的海洋游仆虫浸膏能有效抑制多种肿瘤细胞的增殖，具体包括宫颈癌hela细胞、非小细胞肺癌a549细胞和肝癌hepg2细胞，采用mtt法来测定每种肿瘤细胞的存活率(或死亡率)为50％时的半抑制浓度ic
50
，结果如表1所示，半抑制浓度均在2.67
‑
3.87μg/ml之间，本发明的海洋游仆虫浸膏有效地抑制了上述肿瘤细胞的增殖，其抑制细胞增殖的活性较高，同时试剂或仪器，均为可以通过市购获得的常规产品，使用较为方便。
[0040]
本实施例的一个具体应用为：首先从海水中采集原生动物群落，然后在显微镜下吸取一只游仆虫，并用麦粒培养液扩大培养，获得游仆虫的单一种群，然后接种游仆虫的单一种群入液体培养基，在25℃低速摇床培养2个月，扩大培养达到5l规模，将所得的样品进行离心，并收集虫体，离心时的转速为3000转每分钟，离心时间为10分钟，然后用甲醇进行萃取，反复萃取3次，萃取的方法是将甲醇加入离心后去除水样的沉积物中，采用高速弥散机将沉积物打成匀浆，离心时的转速为12000转每分钟，离心时间为10分钟，取上清甲醇样，采用旋转蒸发仪浓缩成浸膏，然后用甲醇复溶至5ml，并在4℃的环境下保存备用，完成游仆虫提取物浸膏的制备，通过游仆虫提取物浸膏对宫颈癌hela细胞、非小细胞肺癌a549细胞和肝癌hepg2细胞具有较强的抑制作用，抗肿瘤活性高，能用于制备抗肿瘤药物，并且来源自海洋原生动物，可通过扩大培养持续获得原料，具有环境友好性，应用成本低。
[0041]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
[0042]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。