阿拉伯半乳聚糖在制备治疗肝损伤药物中的应用

1.本发明涉及药剂制备领域，具体涉及阿拉伯半乳聚糖在制备治疗肝损伤药物中的应用。


背景技术：

2.阿拉伯半乳聚糖是从植物细胞壁中获得的一种活性多糖，由阿拉伯糖与半乳糖两种多糖组成，具有高度支链且较长结构的中性多糖。在早些年间，阿拉伯半乳聚糖在食品中已有广泛应用，它在化学工业中也扮演了重要的角色。例如在食品工业中常作为增稠剂、稳定剂、乳化剂、甜味剂等，在化学工业中则常充当增容剂、上光剂、粘结剂等。在食品中也可用作调味料的基料、乳化香精、布丁和调味酱等，可以改善口味，也可在面包、香肠和面条中使用，可作为阿拉伯胶的替代品。
3.作为人体最大的代谢器官——肝脏，承担了许多人体运转的功能。肝脏不仅有合成脂溶性的维生素的功能，还可以合成凝血因子。肝脏可以把体内的毒性物质转化为无毒或毒性较低的物质，然后将其排出体内，起到了净化人体的作用。在机体内肝脏还具有去氧化、储存肝糖原等的作用，体内蛋白质的合成也由肝脏负责。
4.近年来数据表明，肝病已经成为我国发病率最高的慢性疾病之一，并且很难治愈，严重威胁身体健康。联合用药或用药不当都有可能导致急性药物性肝损伤。肝脏作为机体重要的器官之一，负责机体的代谢，并且肝脏在维生素、脂类、糖的代谢方面也起着非常重要的作用。肝脏的功能并不限于此，在分泌、排泄、生物转化等方面的它也起着重要的作用。一旦肝脏功能被损伤了，那么代谢也一定会受到影响，一旦其他功能也受到影响，可能会引发疾病甚至危及生命。肝脏主要负责药物的代谢，药物以及代谢产物可通过直接作用或者免疫机制造成肝脏的损害和病变，apap在治疗中通常被用作传统的镇痛和非甾体退热药物，其过量可引起严重的肝损伤，这是由药物代谢产生的反应中间体，如n-乙酰-对苯并醌亚胺(napq i)，而napq i由cyp2e1和cyp3a4同工酶等细胞色素p450酶系统代谢，当apap诱导的急性肝损伤发生的时侯，tnf-α和il-1β等细胞因子也会被释放出来。


技术实现要素：

5.发明人以小鼠为试验对象，以阿拉伯半乳聚糖作为干预物，通过建立apap致小鼠肝损伤模型，发现：阿拉伯半乳聚糖可逆转gsh耗竭和cyp2e1过表达，降低mda和4-hne的表达。可见，对于apap所导致的小鼠急性肝损伤，阿拉伯半乳聚糖具有保护作用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：阿拉伯半乳聚糖在制备治疗肝损伤药物中的应用，所述的阿拉伯半乳聚糖可逆转gsh耗竭和cyp2e1过表达，降低mda和4-hne的表达，抑制氧化应激和炎症反应，并且具有改善小鼠肝脏损伤的功效。
6.本发明发现阿拉伯半乳聚糖能够改善小鼠肝脏的损伤，对apap诱导的小鼠急性肝损伤是有保护作用，对机体的免疫能力有提高的作用，并且在抗肝损伤的方面有很显著的
效果，能够增强机体抵抗和预防肝脏细胞损伤的程度，为肝脏损伤治疗药物的制备提供了一个新的方向。
附图说明
7.图 1 为ag对apap所致肝损伤小鼠炎症和内毒素所起到的抑制作用；图中：(a)为tnf-α水平；(b)为l-1β水平；(c)为内毒素水平。数据表示为平均
±
sd(n=每组8)。 *p《0.05，*p《0.01vs。ck；#p《0.05，#p《0.01对apap组。
8.图2 为对于apap所致肝损伤小鼠肝细胞坏死ag有减少的功能；图中：(a)为肝组织苏木精-伊红染色（200
×
，400
×
）,箭头表示肝组织h&e染色中肝细胞凋亡空化；(b)为不同组肝组织坏死评分无损坏，1=0-10%，2=11%-25%，3=26%-45%，4=46%-75%，5=75%。所有数据均表示为平均值
±
s.d.，n=8； *p《0.05，*p《0.01vs。ck；#p《0.05，#p《0.01对apap组。
9.图3为 ag调控细胞凋亡的分析；图中：(a)肝脏组织用tunel（200
×
，400
×
）和hoechst33258（200
×
，400
×
）染色；在tune l（400
×
）中，箭头表示凋亡细胞；(b)图像分析仪检测hoechst33,258；(c)tunel阳性细胞的百分比。（d）是蛋白免疫印记图；（e）是蛋白免疫自己图中相关蛋白含量图。
10.图4为ag有保护肝脏免受紧急伤害的功能；图中：(a)血清alt和(b)ast水平；(c)肝gsh和(d)mda水平。
具体实施方式
11.为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
12.实验资料1实验动物实验用的40只为20-25g的小鼠，在学校的药理实验室喂养，室内温度基本保持在大约为24℃，相对湿度60％左右，所有小鼠在正式实验前至少一周适应环境，让其自由饮食及饮水，每天为小白鼠换气通风，所有实验程序严格按照吉林农业科技学院实验动物伦理委员会颁发的《实验动物管理条例》。
13.实验方法2.1 apap致肝损伤小鼠的模型制备2.1.1 动物分组小鼠分为4组：1.正常对照组，2.模型组，3.apap/ag(250/150mg/kg)组，4.apap/ag处理组（250/300mg/kg）2.1.2 给药方法建模成功后，第3组和第4组小鼠用ag（每天150，300mg/kg）预处理6天。第七天，第2组，第3组和第4组小鼠均在ag预处理1h后注射单剂量apap(250mg/kg)，24小时后杀死所有小白鼠，取血液和肝脏进行检测。
14.2.2 血清中炎症因子的测定
用颈椎脱位解剖，进行眼球取血收集血液，3000rpm离心10分钟，从上清液分离出血清，保存在
−
80℃，接下来检测小鼠血清中tnf-α和il-1
ß
的含量，测定od值并计算含量，按照说明书步骤进行操作。
15.2.3 肝脏指数的测定在实验过程中每天下午2点按时对小鼠进行灌胃，灌胃前对小鼠进行称重并记录小鼠体重的变化。试验结束处死小鼠后，快速剖腹取出肝脏与脾脏，上面的积血用冰生理盐水擦拭干净后称重并记录，计算出脾脏与肝脏指数。
16.按如下公式计算每 g体重的脏器 mg 数作为脏器指数。
17.肝脏指数＝肝脏重量（mg）/体重（g）
×
100%脾脏指数＝脾脏重量（mg）/体重（g）
×
100%2.4 生物化学标记法根据试剂盒方案，将小鼠肝脏组织重新悬浮在磷酸盐缓冲液（pbs)中，在室温下以3000r/min离心10min。收集上清液，然后继续实验，并在3000r/min室温离心10min后获得血清。
18.2.5 h&e、tunel和hoechst33，258染色为了验证包括肝细胞坏死、细胞凋亡和中心静脉充血的肝组织变化，新鲜的肝脏样品要在10%甲醛中浸泡24小时以上。然后将肝脏组织包埋在石蜡中，并且制成切片。接下来用光学显微镜对5个μm厚度切片进行h&e染色，用tunel凋亡检测试剂盒进行tunel染色。用hoechst33，258溶液分别用10μg/ml染色。用image-pro加6.0软件通过量化碎片和浓缩染色来评估肝脏凋亡的程度。
19.2.6 cyp2e1和4-hne免疫荧光染色为了进一步研究ag对apap诱导的肝脏氧化应激损伤是否具有调节功能，在apap诱导的24小时后，采用免疫荧光技术检测肝脏组织中cyp2e1和4-hne的蛋白表达。具体地，石蜡切片(5μm)用一系列二甲苯和乙醇水溶液固定，用于脱蜡和补液。在柠檬酸缓冲液(0.01m，ph6.0)中恢复抗原10分钟后，用pbs洗涤切片，用1%牛血清白蛋白(bsa)孵育10分钟。将阻断的血清敲除，在4℃下与含有cyp2e1（1：200）和4-hne（1：200）的一次抗体溶液孵育。在使用pbs洗涤切片3次之后，将其在37℃暴露于dylight488标记的二次抗体中30分钟。
20.结果3.1 ag对apap致肝损伤小鼠血清中炎症因子的影响为了验证apap诱导的肝脏毒性与炎症反应的相关性，我们测定了血清中tnf-α、内毒素和il-1β的水平。如图 1所示，a、b和c与正常对照组相比，apap诱导小鼠血清中tnf-α、il-1β和内毒素水平升高(p《0.01)。但是，在ag处理的小鼠中，tnf-α、il-1β和内毒素水平分别显著降低(p《0.05或p《0.01)。
21.用westernblot分析nf-κb信号通路相关蛋白在肝组织中磷酸化形式的表达和非磷酸化形式的表达，用此来评价肝保护相关信号分子。肝组织中的tlr4，gpr78，p-ikkα/β，p-nf-κb和p-iκbα的表达水平因为apap的诱导全部都普遍升高，然而所有的蛋白质数据在ag预处理后全部呈现下降的趋势(150和300mg/kg)。因此，这表明了ag可以有效地抑制nf-κb信号通路的激活与表达，并对这些蛋白的表达水平有明显的下调功能(p《0.051或p《0.011)。
22.3.2 ag对apap致肝损伤小鼠肝脏指数的影响空白组小白鼠的体重一直呈增加趋势，生长状况良好，身体健康情绪稳定。空白组与模型组比较，在第七天给药之后，模型组小白鼠的体重呈现明显的降低趋势。这个结果说明了apap对小白鼠造成了肝损伤，apap导致了小白鼠的体重下降。而脾脏和肝脏指数远远高于正常组和ag组(p《0.05)，这表明了ag对小鼠肝脏和脾脏具有积极的影响。并且血清中的alt和ast数据都可以证实这一现象，所有的这些数据都被用来确定apap诱导和ag预处理组小鼠的肝脏损伤程度。
[0023] 表1阿拉伯半乳聚糖对肝损伤小鼠体重的影响和器官指数的影响。 (n=8，平均
±
s.d) (n=8，平均
±
s.d) (*p《0.05，*p《0.01 正常组；#p《0.05，#p《0.01apa p组)3.3 ag对apap致肝损伤小鼠肝细胞坏死的测定如图2所展现的，在apap诱导的肝损伤组的整个显微镜的视野中，肝细胞空化非常突出。将其与正常的对照组相比较，我们可以在正常对照组中查看到肝脏组织中清晰的肝叶和完整的肝细胞，而不会显示组织病理学的变化。经ag预处理(300mg/kg)高剂量组肝组织的显微结构和对照组基本相同，但是肝细胞线却不够清晰，低剂量ag预处理组肝细胞稍微有一些空洞(150mg/ml)，基本处于正常状态。在图b中，组织病理学变化的坏死评分也被清楚地展现了出来，它所呈现出的剂量依赖性的方式（150或300毫克/千克/天，1周）表明了，ag预处理可以降低apap诱导的肝脏病理变化的可能性(p《0.011)。
[0024]
3.4 ag对apap致肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响根据研究数据表明，apap组几乎全部的肝细胞都表现为核分裂和凝血（图3），但是通过使用ag预处理预防，在ag(150mg/kg)预处理组中发现了很小一部分的肝细胞核碎裂，并且有小部分肝细胞缩合，但是在ag(300mg/kg)预处理组中却呈现出肝细胞轮廓是正常的，均匀荧光强度也是规则的(p《0.01)。并且采取了tunel染色法研究肝组织肝细胞核的凋亡程度，结果表明，对照组几乎没有发现存在阳性细胞表达，但apap组却拥有着数量更多的tune l阳性细胞表达，ag预处理成功地逆转了这一现象，并且剂量依赖性也出现了。(p《0.01)以研究出ag预处理对肝细胞凋亡所起到的影响为目的，采取了使用westernblot来检测相关的蛋白，如抗凋亡因子bcl-2和促凋亡因子bax。在被apap诱导之后，明显地变低了。(p《0.051或p《0.011)，但是akt和p-pi3k的表达却在ag预处理组(150和300mg/kg)中明显地增加了。接下来在一次apap注射之后(250mg/m l)，肝脏组织中bcl-2的表达显著降低，bax的表达显著增加，
但通过ag预处理，apap诱导的肝细胞凋亡程度可在150mg/kg和300mg/kg(p《0.051或p《0.011)之间降低。
[0025]
3.5 ag对apap致肝损伤小鼠肝组织变化的影响ag有保护肝脏的功能，和使其免受紧急伤害的功能，我们采取了免疫荧光法的方法评估了不同组的组织切片中cyp2e1的表达水平和4hne(green)的表达水平，在400
×
拍摄具有代表意义的免疫荧光图像。
[0026]
通过研究e、f肝组织的荧光切片，f-g，e-h，在单独使用apap的情况下，损伤会很高。在apap+ag联合使用的情况下，肝损伤的程度会呈现出逐渐下降的趋势，所以我们得出结论，apap+ag对肝损伤起很一定的的保护作用。
[0027]
通过与对照组做比较，我们发现apap诱导组中的肝脏gsh水平呈现出了很明显的降低趋势(p《0.052)，但是ag预处理组的gsh水平却明显升高了（图4）。两组都具有缓解的作用，这两组数据都表明了ag可以有效地抑制由apap所引起的氧化应激损伤(p《0.051)。为了进一步apap诱导的肝脏氧化应激损伤是否能够被ag所调节，在apap所诱导的24小时之后，我们采取了免疫荧光技术，以此来检测肝脏组织中cyp2e的表达和检测4-hne的表达，在图中更直观地显示了更强的cyp2e1荧光强度和4-hne荧光强度。但被ag预处理七天之后（150mg/kg和300mg/kg），这些现象全部得到了缓解，同时，我们通过对图中数据1g和h(p《0.011)的进一步分析研究，进一步验证了同样的情况。
[0028]
通过研究实验结果，我们发现，正常组的小鼠血清中 ast、alp 和alt 活性以及 tbil含量明显低于模型组，这个研究成果表明造模成功。ag高剂量组显著降低小鼠血清 alp、 alt、tbil、水平和 ast 含量。其中，将ag的高剂量组血清 alt、ast、alp 和 tbil 含量与模型血清 alt、ast、alp 和 tbil 含量组进行比较，可以发现两者具有非常明显的差异 ( p 《 0.05)。由此我们可以得出结论，apap所致的肝损伤至少可以被ag通过抑制氧化应激部分预防。
[0029]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。