Sertraline在胶质母细胞瘤放射增敏中的应用

sertraline在胶质母细胞瘤放射增敏中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，涉及sertraline协同放射治疗在胶质母细胞瘤治疗中的新作用。


背景技术：

2.脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，其中胶质母细胞瘤(glioblastoma,gbm,who iv级)在脑胶质瘤中约占54％，具有易复发、侵袭能力强的特点，中位生存期只有12-15个月。由于gbm多呈恶性、浸润性生长，外科手术常常难以彻底切除。放射治疗在gbm的治疗中占有极其重要的地位，术后放疗可以有效杀伤残余肿瘤细胞从而延长患者的无进展生存期和总生存期。对于无法进行手术切除的gbm，也能釆取放疗的方法抑制肿瘤细胞生长，改善患者的临床症状和生活质量，且放疗对脑功能的损害也低于外科手术。然而，较其它类型脑胶质瘤患者，gbm患者的放疗效果往往不是很理想，且更易出现放疗抵抗和肿瘤复发。
3.大量文献研究显示，gbm放疗抵抗的发生可能与dna损伤修复、胶质瘤干细胞、自噬以及肿瘤微环境变化等有关，它是一个多因素多环节共同作用的复杂机制过程。而在提高gbm放疗敏感性的药物研发方面未有突破性进展。根据我们前期的中枢神经系统小分子化合物库的筛选，我们发现sertraline能够显著增强胶质母细胞瘤的放射治疗效果。
4.sertraline，舍曲林，其化学名称为：(1s-顺式)-4-(3，4-二氯苯基)-1，2，3，4-四氢-n-甲基-1-萘啶胺。分子式：c
17h18
cl3n，分子量：342.7，本品为白色薄膜衣片，片芯也为白色。sertraline由辉瑞公司研制的最新的选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitor,ssri)，是美国处方量最大的抗抑郁品牌药。sertraline用于治疗抑郁症的相关症状，包括伴随焦虑、有或无躁狂史的抑郁症，疗效满意后，继续服用舍曲林可有效地防止抑郁症的复发和再发。舍曲林也用于治疗强迫症，疗效满意后，继续服用舍曲林可有效地防止强迫症初始症状的复发。
5.但是，目前尚无sertraline协同放疗在胶质母细胞瘤治疗中的任何相关应用报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供sertraline在胶质母细胞瘤放射增敏中的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
8.本发明公开了sertraline在制备胶质母细胞瘤放疗增敏剂中的应用。
9.优选地，所述的放疗增敏剂为增强放射线对胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用的放疗增敏剂。
10.进一步优选地，所述的放疗增敏剂协同放射治疗能够增加胶质母细胞瘤细胞凋亡比例。
11.进一步优选地，所述的放疗增敏剂协同放射治疗能够缩小肿瘤体积。
12.优选地，所述的放疗增敏剂为抑制胶质瘤干细胞形成及自我更新的放疗增敏剂。
13.优选地，所述的放疗增敏剂协同放射治疗能够延长动物生存周期。
14.优选地，所述的放疗增敏剂为增强放疗对原位胶质母细胞瘤或者异种移植胶质母细胞瘤的治疗效果的放疗增敏剂。
15.优选地，sertraline在协同增强胶质母细胞瘤放疗效果时，动物给药量为15mg/kg。
16.进一步优选地，sertraline协同放疗2gy连续作用时间为8天。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.本发明公开了化合物sertraline在增强胶质母细胞瘤放疗敏感性中的应用。在原位胶质母细胞瘤模型和病人来源的异种移植胶质母细胞瘤(pdx)模型中，sertraline(15mg/kg)协同放疗(2gy)连续治疗8天，小动物成像的实验结果表明小鼠的肿瘤体积显著缩小；tunel染色发现联合治疗组凋亡细胞比例增加，ki67阳性细胞数目减少，胶质瘤干细胞标志物cd133表达降低；生存曲线分析发现，联合治疗组的小鼠生存时间显著延长。因此，本发明公开的动物实验结果表明sertraline能够有效增强胶质母细胞瘤的放射治疗效果，显著延长小鼠生存时间，充分支持了sertraline在胶质母细胞瘤放疗增敏中的应用。
附图说明
19.图1为能够增强胶质母细胞瘤放疗敏感性的小分子化合物的筛选；其中，(a)为中枢神经系统小分子化合物的筛选模式图；(b)为小分子化合物筛选的结果，有5种化合物thioridazine,clompramine,fingolimod,sertraline,vilazodone对放疗有增敏作用；(c)为thioridazine,clompramine,fingolimod,sertraline,vilazodone在放射之后胶质母细胞瘤的凋亡情况；
20.图2为sertraline协同放疗在增强原位胶质母细胞瘤治疗效果中的作用；其中，(a)为sertraline协同放疗在原位胶质母细胞瘤小鼠模型中的治疗策略；(b)为小动物活体成像检测原位胶质母细胞瘤小鼠模型中的肿瘤体积；(c)为小鼠肿瘤体积的统计分析；(d)为原位脑组织的he染色；(e)为各组小鼠的生存时间统计分析；
21.图3为肿瘤组织的tunel染色、ki67染色和cd133染色的结果图；
22.图4为sertraline协同放疗在病人来源的异种移植胶质母细胞瘤(pdx)中的治疗作用图；其中，(a)为各组小鼠肿瘤体积的增长曲线；(b)为各组小鼠肿瘤体积的统计分析图；(c)为肿瘤组织的he染色、ki67染色和cd133染色。
具体实施方式
23.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
24.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用
的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
25.下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
26.本发明所使用的化合物sertraline，分子式c
17h18
cl3n，分子量：342.7，呈白色或类白色的粉末样试剂，结构式如下：
[0027][0028]
实施例1增强胶质母细胞瘤放疗敏感性的小分子化合物的筛选
[0029]
1、实验材料
[0030]
小分子化合物库(中枢神经系统小分子化合物库购于targetmol公司)，ln229细胞，dmem培养基(含有青霉素100u/ml，链霉素0.1mg/ml，10％胎牛血清)，caspase-3/7apoptosis assay试剂盒(购自于上海生工)。
[0031]
2、实验方法
[0032]
2.1细胞活力检测
[0033]
a.在超净工作台内处理处于对数生长期ln229细胞，胰蛋白酶常规消化细胞，3min后用含10％胎牛血清的dmem进行中和，用无菌pbs洗涤三遍，最后离心收集细胞沉淀；
[0034]
b.用1ml新鲜培养基重悬细胞沉淀，使用细胞计数仪对细胞进行计数；
[0035]
c.取适量上述细胞悬液接种于96孔板中、使细胞数目约为每孔5000个，并加入培养基至0.2ml/孔，做“+”字形轻轻晃动96孔板，使细胞分布均匀；
[0036]
d.将96孔板置于37℃、5％co2培养箱中进行培养；
[0037]
e.待细胞贴壁且形态正常之后，加入小分子化合物，每种化合物均为10μm，随后用2gy的x射线处理细胞6次(444.4cgy/min)，随后放入孵箱培养3天；
[0038]
f.弃置培养基，并用预冷无菌pbs轻轻洗涤各孔，弃置pbs，向各个孔中加入0.1ml新鲜培养基并向每孔中加入10μl的工作液后将96孔板置于孵箱中继续培养；
[0039]
g.3h后，使用多功能酶标仪检测各孔在450nm处的吸光度值，记录实验结果，并用graphpad prism 7.0绘制细胞生长曲线。
[0040]
2.2 caspase 3/7细胞凋亡检测实验
[0041]
准备细胞
[0042]
a.贴壁细胞：对于96孔板，每孔接种90μl 20,000个细胞；对384孔板，每孔接种20μl 5,000个细胞；过夜培养备用；
[0043]
b.悬浮细胞：离心收集细胞，并重悬细胞，对于用多聚d-赖氨酸包被过的96孔板，每孔接种90μl 20,000个细胞；对用多聚d-赖氨384孔板，每孔接种20μl 5,000个细胞；
800rpm，2min，离心，备用；
[0044]
准备caspase 3/7检测缓冲液：
[0045]
a.使用前该试剂盒需要在室温解冻。
[0046]
b.caspase 3/7检测缓冲液的制备：将50μl of caspase 3/7substrate(组分a)加入10ml of assay buffer(组分b)，混匀；
[0047]
检测方法：
[0048]
a.样品处理组：对于96孔板中，待检药物用pbs或配制所需缓冲液配制成10x待检药物溶液，每孔加入10μl待检测药物；对于384孔板中，待检药物用pbs或配制所需缓冲液配制成5x待检药物溶液，每孔加入5μl待检测药物；空白对照组(不含细胞的培养基)：加入相应体积的药物配制所需缓冲液；
[0049]
b.在37℃，5％co2，培养箱中孵育细胞板达所需时间诱导细胞凋亡。
[0050]
c.对于96孔板，每孔加入100μlcaspase 3/7检测缓冲液；对于384孔板，每孔加入25μl caspase 3/7检测缓冲液；
[0051]
d.加入caspase 3/7检测缓冲液后，避光室温孵育至少1小时；
[0052]
e.800rpm，2min，离心细胞板，悬浮细胞一定要离心；
[0053]
f.检测ex/em＝490/525nm处的荧光强度。
[0054]
3、实验结果
[0055]
结果参见图1，如图1中(a)展示的是中枢神经系统小分子化合物的筛选模式图，本实验筛选了103种中枢神经系统小分子化合物对胶质母细胞瘤细胞的放疗增敏作用。如图1中(b)和(c)所示，发现其中5种化合物(thioridazine,clompramine,fingolimod,sertraline,vilazodone)对胶质母细胞瘤细胞具有一定的放疗增敏作用，进一步的caspase-3/7apoptosis assay证实，sertraline具有最显著的放疗增敏效果。
[0056]
实施例2 sertraline协同放疗对胶质母细胞瘤小鼠的治疗效果
[0057]
1、实验材料
[0058]
gbm组织样品均是在病人及家属知情同意的情况下取自空军军医大学第一附属医院(西京医院)。裸鼠购于北京vital river实验动物有限公司，并在空军军医大学实验动物中心的spf级动物房进行饲养。
[0059]
2、实验方法
[0060]
2.1 pdx模型的构建
[0061]
原发性gbm样本(患者未接受过放化疗)直接由手术室中获取并做初步处理：手术样本离体后立即置于无菌托盘中，无菌手术刀切开肿瘤组织，分别取2-3份肿瘤及癌旁组织放入存有组织保存液的15ml离心管中，并做好相应的标记。将15ml离心管放入4℃冰盒，从取样到运送至实验室进行pdx模型构建时间不得超过1.5h，运送全程应放置在冰水混合物中，以保存组织活性；
[0062]
将肿瘤组织及组织保存液直接倒入新的10cm的细胞培养皿中，用灭菌的眼科镊将肿瘤组织转移至含有青霉素/链霉素的pbs中进行清洗，同时用无菌的眼科剪将坏死的肿瘤组织、瘤周和瘤内的脂肪组织及纤维组织剔除，尽量留取具有肿瘤活性组织块；
[0063]
立即用无菌器械把肿瘤分割成大小约3mm
×
3mm
×
3mm的组织块，组织块在matrigel基质胶中浸润包被后用眼科镊装入套管针鞘；
[0064]
裸鼠腹腔注射戊巴比妥钠溶液，麻醉剂量为60mg/kg，随后，用70％酒精消毒小鼠右侧背部皮肤，轻轻牵拉穿刺位置的皮肤，将套管针穿刺入裸鼠皮下，缓慢推动针芯将组织块注入皮下，拔出套管针，用酒精消毒穿刺部位，每个小鼠接种左右2处；
[0065]
每三天观察一下接种部位并按照v＝1/2
×
长
×
宽2计算肿瘤体积，待肿瘤直径达1cm时，可进行组织传代，颈椎脱臼法处死小鼠，剥离肿瘤组织，采用前面的方法进行传代。
[0066]
2.2原位胶质母细胞瘤裸鼠模型的构建
[0067]
通过重组慢病毒将荧光素酶基因整合到ln229细胞的基因组dna上，构建成稳定表达荧光素酶的细胞株，随后向细胞中加入底物(d-荧光素钾盐)通过小动物成像仪检测是否构建成功。消化并计数建立动物模型所需的gbm细胞，将其用10μl生理盐水制备成单细胞悬液；实验开始前，对裸鼠进行称重，按照重量计算出使用5％水合氯醛的剂量(0.07ml/g)，待裸鼠麻醉后，将其放入脑立体定向仪上准备手术；
[0068]
使用酒精棉签消毒裸鼠头部，然后使用眼科剪将小鼠头部中线切开，暴露颅骨后进行定位(bregma点向前0.5mm，向右2mm)，随后使用注射器头针在定位出钻孔，钻孔时不宜用力过大，避免穿破脑膜，引起颅内出血导致小鼠死亡；
[0069]
钻孔完成后，将针头插入钻孔，深度为2.5mm，然后向颅内注入细胞，注射速度为1.5ul/min，不可超过2ul/min；
[0070]
注射完成后，针头留置颅内10min，过早的拔出针头，可能会导致细胞沿注射路径溢出，造成实验数据不准确；
[0071]
拔出针头后，使用酒精棉签对钻孔进行消毒处理，然后再使用无菌缝合线对小鼠头皮进行缝合，缝合完成后放在保温箱内等待小鼠苏醒。
[0072]
2.3活体小动物成像
[0073]
用dpbs(w/o mg2+、ca2+)配置d-luciferin工作液(15mg/ml)，0.2μm滤膜无菌过滤；将各实验组裸鼠称重，按照10μl/g的剂量给各组小鼠腹腔注射d-luciferin工作液；随后，将各组小鼠放入含有异氟烷的麻醉诱导盒内，十分钟后从诱导盒取出动物，将其头/鼻放置于麻醉面罩里固定，并且检查动物是否处于完全麻醉状态；设置小动物成像仪的曝光时间为2s，观察并拍照保存，使用living images软件来确定光子的积分通量。
[0074]
3、实验结果
[0075]
结果参见图2，治疗策略如图2中(a)所示，在构建好的原位胶质母细胞瘤模型中，使用sertraline(15mg/kg)协同放疗(2gy)序贯治疗8天。小动物活体成像检测原位胶质母细胞瘤小鼠模型中的肿瘤体积如(b)所示，小动物成像的实验结果表明小鼠的肿瘤体积显著缩小；(c)所示的he染色结果也显示肿瘤组织在联合治疗组中体积减小，侵袭能力降低。如(d)所示的进一步的生存期统计分析发现，sertraline协同放疗序贯治疗组的小鼠的生存期显著延长。
[0076]
肿瘤组织的tunel染色结果参见图3，从图中可以看出，sertraline协同放疗组的凋亡细胞数目增多，而增殖标志物ki67表达降低。cd133是胶质瘤干细胞的权威标志物，放疗可以诱导cd133表达升高，为患者复发埋下“种子”，而sertraline能够显著的降低cd133阳性胶质瘤干细胞的数目。
[0077]
参见图4，本实验从西京医院收集了病人的新鲜组织，构建了异种移植胶质母细胞瘤(pdx)模型，使用sertraline(15mg/kg)协同放疗(2gy)序贯治疗8天的治疗策略，通过测
量小鼠肿瘤体积发现，sertraline协同放疗能够显著减少肿瘤体积(图中(a)和(b)所示)，与在原位胶质母细胞瘤模型中的结果相同，sertraline能够降低ki67阳性细胞数目和干细胞标志物cd133的表达(图中(c)所示)。
[0078]
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。