1.本发明属于生物组织工程材料技术领域。更具体地，涉及一种含有细胞膜片的生物活性骨粉及其制备方法。
背景技术：
2.临床上，因年龄增长、外伤、炎症等导致的牙齿缺损常常给患者的生活带来诸多不便。此时，口腔义齿修复尤为重要，而口腔义齿的修复尤其是种植义齿需要以充足的牙槽骨骨量为前提。但是这些患者通常伴有牙槽骨缺损，所以牙槽骨的缺损重建已经成为口腔修复的研究重点。目前牙槽骨增量技术有：引导骨组织再生技术、骨移植术、骨组织工程等。其中，采用引导骨组织再生术修复大范围骨缺损效果欠佳；自体骨移植是骨移植术的金标准，但是该方法存在自体骨来源有限、额外增加手术创伤和供骨区受损易出现并发症等缺点；而异体或异种骨移植材料存在免疫排斥及传播疾病的可能；人工骨可以满足对移植骨量的需求，但是其仍存在机械强度不足、骨传导、骨诱导及骨结合能力较弱，生物降解性较差等缺点，亟需解决。
3.为了解决上述问题，中国专利申请cn108992708a公开了一种表面改性骨粉，该骨粉用天然牛松质骨仅前处理后，煅烧粉碎获得羟基磷灰石多孔颗粒，在颗粒表面吸附透明质酸钠、硫酸软骨素等医用大分子进行改性制得，具有较好的生物相容性、有利于骨细胞的快速粘附、增殖及新骨的形成，缩短缺损骨的修复时间。但是该表面改性骨粉原料来源为牛松质骨，为异体或异种骨移植材料，存在免疫排斥及传播疾病的隐患，并且在实际应用中发现，该表面改性骨粉表面改性后虽然能利于骨细胞的粘附，但是骨细胞的再生能力仍然有限，修复时间仍无法满足患者的需求。
技术实现要素：
4.本发明要解决的技术问题是克服现有自体骨来源有限，异体骨存在安全隐患，人工骨的骨细胞再生能力有限的缺陷和不足，提供一种提高骨再生能力的含有细胞膜片的生物活性骨粉。
5.本发明的目的是提供一种含有细胞膜片的生物活性骨粉。
6.本发明另一目的是提供所述含有细胞膜片的生物活性骨粉的制备方法。
7.本发明另一目的是提供生物活性骨粉在制备骨修复材料中的应用。
8.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
9.一种含有细胞膜片的生物活性骨粉，所述生物活性骨粉为将β-tcp粉经3d打印后，烧结、定型，再复合细胞膜片制成。
10.骨粉等支架材料是构建骨组织工程的最基本骨架。现如今采用3d打印技术制作的支架尤为常见。3d打印是快速成型技术的一种，是根据“分层制造、逐层叠加”原理，快速制作三维实体的一种增材制造技术，目前常用的骨组织工程3d打印技术包括：立体光固化成型、低温快速成型、自动注浆技术、熔融沉积成型等。其中，自动注浆技术可以以β-tcp粉末
为原料，模拟骨小梁结构以及颌骨复杂解剖结构制作出个性化支架材料。通过控制相互连接的孔隙的形状、大小和分布，此技术制作出的骨粉将会比市面上使用的骨粉更规则，孔隙率及孔隙大小更可控。
11.优选地，所述β-tcp粉经3d打印后所得骨粉的直径为1～3mm。
12.优选地，所述β-tcp粉经3d打印后所得骨粉的孔隙大小为300～500μm。
13.优选地，所述β-tcp粉经3d打印后所得骨粉的孔隙率为40～55％。
14.进一步地，所述细胞膜片由人脐带间充质干细胞经成骨诱导和成膜诱导后得到。
15.组织工程骨如骨粉的另外两个要素是细胞和生长因子。在构建组织工程骨时，通常采用具有向成骨方向分化的间充质干细胞接种至支架上修复骨缺损。在将支架材料应用于骨组织重建之前，必须先用蛋白水解酶(如胰蛋白酶或分散酶)处理细胞，这些蛋白酶会降解细胞外基质(ecm)分子和细胞表面蛋白，从而导致细胞损伤、减弱细胞活动。本发明中的细胞膜片是一层厚约80～150μm的细胞膜，它的特点在于细胞接种并长满后用特殊的诱导液诱导其大量分泌细胞外基质形成膜，并且不用蛋白酶消化即可直接得到该细胞膜。它包含完整的ecm和细胞表面蛋白，例如生长因子受体，离子通道和细胞间连接蛋白，并且没有破坏细胞与细胞间的联系，增强了细胞的强度。细胞膜片技术既包括了细胞又包括了生长因子，可以显著促进骨再生。
16.更进一步地，所述成骨诱导的步骤为：将人脐带间充质干细胞接种于成骨诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上。
17.优选地，所述成骨诱导培养基包括地塞米松、β-甘油磷酸、l-抗坏血酸和增殖培养基；更优选地，所述成骨诱导培养基包括地塞米松、5～20mmβ-甘油磷酸、40～60μg/ml l-抗坏血酸和余量增殖培养基。
18.进一步地，所述成膜诱导的步骤为：将成骨诱导所得人脐带间充质干细胞接种于成膜诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上。
19.优选地，所述成膜诱导培养基包括l-抗坏血酸和增殖培养基；更优选地，所述成膜诱导培养基包括40～60μg/ml l-抗坏血酸和余量增殖培养基。
20.优选地，所述增殖培养基由89％高糖dmem、10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素组成。
21.另外的，本发明还提供了所述生物活性骨粉的制备方法，包括以下步骤：
22.s1、将β-tcp粉加入水中制成悬浮液，再加入成型辅料进行分散、乳化和凝聚，形成打印浆料，3d打印后进行烧结定型，得到球形骨粉；
23.s2、将人脐带间充质干细胞进行成骨诱导和成膜诱导，得到细胞膜片；
24.s3、将步骤s1所得球形骨粉完全包裹于步骤s2所得细胞膜片中，即得。
25.进一步地，步骤s1中，所述烧结的温度为1000～1200℃。
26.另外的，本发明还提供了所述生物活性骨粉在制备骨修复材料中的应用。
27.本发明具有以下有益效果：
28.本发明一种含有细胞膜片的生物活性骨粉，为将人脐带间充质干细胞经成骨诱导和成膜诱导后所得细胞膜片包裹住β-tcp粉经3d打印的球形骨粉所得，在骨粉表面修饰上了细胞外基质，含有丰富的细胞生长因子，使骨粉具有生物活性，可以显著提高骨再生能力，促进骨修复，显著缩短骨修复时间，提高构建组织工程骨的效率，非常适用于牙槽骨缺
损等骨修复领域中。
具体实施方式
29.以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
30.临床级hucmscs细胞由华南生物医药研究院裴雪涛教授团队提供，在无血清人间充质干细胞培养基(stemrd，美国)中扩增，置于37℃、5％co2培养箱中培养，0.05％胰酶(gibco,美国)消化传代，6～8代用于后续实验。
31.增殖培养基：89％高糖dmem(gibco，美国)、10％胎牛血清(gibco，澳大利亚)及1％青霉素-链霉素(gibco，美国)。
32.成骨诱导培养基：50～110nm地塞米松、5～20mmβ-甘油磷酸、40～60μg/ml l-抗坏血酸和余量增殖培养基。
33.成膜诱导培养基：40～60μg/ml l-抗坏血酸和余量增殖培养基。
34.除非特别说明，以下实施例所用其它试剂和材料均为市购。
35.实施例1一种含有细胞膜片的生物活性骨粉
36.所述含有细胞膜片的生物活性骨粉由以下方法制备得到：
37.s1、将β-tcp粉加入水中制成悬浮液，再加入适量纤维素和聚乙烯亚胺(pei)，进行分散、乳化和凝聚，形成打印浆料，使用生物3d打印机(regenovo,china)打印，直径为2mm，孔径350～400μm，孔隙率为40～55％，然后在室温下干燥24h，400℃加热1h去除有机物，在1100℃烧结1h定型，得到球形骨粉；
38.s2、将人脐带间充质干细胞hucmscs接种于成骨诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上，再将成骨诱导所得人脐带间充质干细胞接种于成膜诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上，得细胞膜片；
39.s3、将步骤s1所得球形骨粉完全包裹于步骤s2所得细胞膜片中，即得。
40.实施例2一种含有细胞膜片的生物活性骨粉
41.所述含有细胞膜片的生物活性骨粉由以下方法制备得到：
42.s1、将β-tcp粉加入水中制成悬浮液，再加入适量纤维素和聚乙烯亚胺(pei)，进行分散、乳化和凝聚，形成打印浆料，使用生物3d打印机(regenovo,china)打印，直径为1mm，孔径400～500μm，孔隙率为40～50％，然后在室温下干燥24h，400℃加热1h去除有机物，在1200℃烧结1h定型，得到球形骨粉；
43.s2、将人脐带间充质干细胞hucmscs接种于成骨诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上，再将成骨诱导所得人脐带间充质干细胞接种于成膜诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上，得细胞膜片；
44.s3、将步骤s1所得球形骨粉完全包裹于步骤s2所得细胞膜片中，即得。
45.实施例3一种含有细胞膜片的生物活性骨粉
46.所述含有细胞膜片的生物活性骨粉由以下方法制备得到：
47.s1、将β-tcp粉加入水中制成悬浮液，再加入适量纤维素和聚乙烯亚胺(pei)，进行分散、乳化和凝聚，形成打印浆料，使用生物3d打印机(regenovo,china)打印，直径为3mm，孔径300～400μm，孔隙率为50～55％，然后在室温下干燥24h，400℃加热1h去除
有机物，在1000℃烧结1h定型，得到球形骨粉；
48.s2、将人脐带间充质干细胞hucmscs接种于成骨诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上，再将成骨诱导所得人脐带间充质干细胞接种于成膜诱导培养基中，接种量为(3～6)
×
104个，培养诱导7天以上，得细胞膜片；s3、将步骤s1所得球形骨粉完全包裹于步骤s2所得细胞膜片中，即得。
49.试验例生物活性骨粉性质测定
50.1、扫描电镜
51.将实施例所得生物活骨粉用2.5％戊二醛(leagene,china)固定12h，pbs漂洗、梯度酒精脱水、干燥、喷金，扫描电镜(hitachi,japan)观察并拍照。
52.结果显示，支架上的细胞呈椭圆形，形态完整，且从细胞上伸出很多伪足，说明细胞与材料之间的作用较强，黏附较为紧密。
53.2、活死染色
54.细胞膜片包裹在骨粉上3d，用活细胞/死细胞染色试剂盒(bestbio,china)进行染色，过程为取1ml试剂c加9ml无菌去离子水稀释，混匀即成1x染色缓冲液，每10ml 1x染色缓冲液中加入10ul染色液a和3～10ul染色液b，充分混匀，即成染色工作液。4℃避光孵育15-30mins，激光共聚焦(leica,germany)下，使用488nm波长激发，拍照。
55.结果显示，有大量细胞黏附在该骨粉上，细胞铺展形态较好，同时并未观察到死细胞，说明该骨粉具有良好的细胞相容性和细胞搭载能力。
56.3、采用生物活性骨粉行新西兰大白兔上颌窦提升术
57.选择12只6周周龄新西兰大白兔，体重2.5～3.5kg，共制备24个上颌窦提升模型，随机分为4组，包括空白组、空白骨粉组、成骨诱导膜片组和成膜诱导膜片组。本实验已获南方医院实验动物伦理委员会批准。将细胞膜片包裹到β-tcp骨粉上，体外培养1d。采用戊巴比妥钠(sigma-aldrich,usa)，按0.5mg/kg静脉输液麻醉后，手术区消毒，铺巾。用0.5ml1％利多卡因混合肾上腺素(1：100000)皮下局部麻醉兔的鼻背部，于鼻背部正中作一长2.5cm竖直切口，切开皮肤、皮下组织及筋膜，钝性分离鼻骨骨膜。在距鼻骨中缝侧方0.4～0.5cm，距鼻额缝1.0cm处左右两边分别用环形钻作直径5mm的骨窗，期间需用冷的生理盐水不断冲洗截骨处，防止骨坏死。暴露上颌窦粘膜，此时上颌窦粘膜随兔的呼吸节律起伏，表明没有穿孔。然后小心地将上颌窦粘膜提起，形成植入生物活性骨粉腔隙，按分组植入生物活性骨粉，紧密缝合粘骨膜、皮肤，消毒切口，单笼饲养，自由进食。术后连续3d肌肉注射青霉素80万u。术后4周异氟烷(yipin,china)吸入麻醉下断颈处死，暴露鼻骨，沿骨缝剪开，再沿矢状缝左右分开，4％多聚甲醛固定。
58.micro ct检测
59.修剪样本，使用micro ct机(bruker,belgium)扫描，扫描参数为1mm铝滤片、分辨率2000
×
1332、像素大小9μm、电压80kv、电流100μa，再将扫描后数据导入nrecon 1.0软件中重建，利用dataviewer软件选择感性区，并保存冠状面图片，在ctan1.13软件中选取支架作为感兴区域，分别设定新生骨和支架的阈值，分析新生骨量、骨小梁数目和骨小梁厚度，感性区域图像通过ctvol2.0重建。由于空白组缺损区中间无新生骨，周边新生骨是由原鼻骨长入，因此新生骨量、骨小梁数目和骨小梁厚度默认为0。
60.he染色
61.edta脱钙后，将标本流水冲洗过夜，梯度脱水，横向正中切开，正立后石蜡包埋，层厚4μm切片，自动染色机(sakura,japan)行he染色，观察成骨情况。
62.马森染色
63.使用马森染色套装(servicebio,china)。具体操作为石蜡切片脱蜡至水；重铬酸钾染色，自来水洗；铁苏木素染色3mins，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗；丽春红酸性品红染色5～10mins，自来水漂洗；磷钼酸浸染1～3mins；苯胺蓝染液染3-6mins；用1％冰醋酸分化；无水乙醇脱水；透明封片。镜检。+++
64.统计学分析
65.所有实验均重复最少3次，使用graphpad prism 6.0e进行统计学分析，多组间均数两两比较采用one-way anova中tukey’s multiple comparisons test进行分析，多个时间点组间均数比较采用two-way anova中sidak’s multiple comparisons test进行分析。p《0.05，认为差异有统计学意义。
66.结果显示，该生物活性骨粉具有良好的成骨性能，种植于体内后可在短时间内成骨，并达到理想的骨修复效果，非常适用于牙槽骨缺损等骨修复领域中。
67.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。