肠道菌群胶囊及其制备方法

1.本发明涉及粪菌移植技术领域，具体而言，涉及一种肠道菌群胶囊及其制备方法。


背景技术：

2.人体肠道的菌群数量多达100万亿个，被称为遗忘的器官。环境、饮食结构及抗生素的使用等因素都影响肠道菌群的状态。菌群多样性降低或菌群种类发生变化会影响机体的免疫调节及物质代谢，肠道菌群失调与多种疾病的发生相关。目前重建肠道菌群主要有3种途径：抗生素、益生菌和粪菌移植(fecal microbiota transplantation，fmt)。fmt是将经过筛选的健康供体的肠道菌群移植到受体，通过建立稳定的、复杂的微生物区系来恢复被破坏的肠道微生物群，以纠正失衡。调节肠道菌群以恢复平衡和多样化的微生物群，实现对免疫状态异常、血管活性物质数量与活性异常、炎症和能量代谢异常等的调节，可能具有治疗或预防肠道菌群失衡微生物相关疾病的作用优点。fmt作为重建肠道微生物区系的核心疗法，具有悠久的医学历史。其起源可以追溯到公元4世纪，我国中医医家葛洪利用粪便悬浮剂治疗食物中毒和严重的腹泻。2013年初，美国华盛顿大学surawic教授领衔的合作组专家将fmt写入临床指南，用于治疗复发性难辨梭状芽孢杆菌感染，开启了现代医学fmt临床应用的新篇章的治疗。2020年南京医科大学张发明教授提出了“洗涤肠道菌群移植”的新理念，将“标准化”提高到了重要位置。
3.在fmt的实际使用中，消化内镜下置管灌注菌液是最主要的移植途径，但部分疾病需要反复住院，反复置管，诸多不便，且费用高、患者依从性差，另外在部分专科医院和基层医院，尚未开展消化内镜项目，这都对fmt的普及和开展带来一定的困难和限制。此外，由于传统的人工粪便处理方法粗糙，使得提取后的肠道菌群种类的多样性大大减少，粪菌的活性也受到一定的影响，造成fmt的治疗效果不理想。基于上述考虑，亟待开发一种标准化的“肠道菌群胶囊”，一方面通过标准化制备，以达到质量的控制和临床疗效的保障，另一方面口服“胶囊”的移植方式大大拓宽了fmt的适用范围和人群，使该项技术未来能够在基层医院推广普及。


技术实现要素：

4.本发明解决了现有fmt技术受限于消化内镜置管的移植途径，难以普及和推广，患者依从性差，基层医院难以开展等问题；此外传统的肠道菌群提取方法，操作流程和标准不统一，粪菌质量难以保证的问题。
5.为解决上述两方面的问题，本发明提供一种肠道菌群胶囊的制备方法，包括如下步骤：
6.s10：制备粪菌液；
7.s20：简单离心粪菌液，去除上清液，保留悬浊液，在悬浊液中加入生理盐水，得到洗涤菌液；
8.s30：混合离心所述洗涤菌液至少一次，得到纯化菌液；
9.s40：将纯化菌液制成粉末装入胶囊中，得到肠道菌群胶囊。
10.上述制备方法通过将肠道菌群置于胶囊中，使得患者可以通过口服的方式将菌群移植于身体中，避免内镜移植的有创操作。步骤s10中，将经过筛选和检测的供体粪便制作成粪菌液，为保证粪便中菌群的质量和安全性，对于提供粪便的供体需要进行一定的身体检查，检查的项目包括：血常规、crp、尿常规、大便常规、隐血试验、微生物镜检、粪便培养试验、血生化全套、血沉、乙肝三系定性、甲丙戊肝、梅毒艾滋病初筛、torch全套、免疫球蛋白、补体c3c4、肠道菌群检测等，同时还要求供体在提供粪便前的6个月内排便规律成型。在步骤s20中，将离心后的粪菌液上层的清液去除、保留悬浊液，可以在保留多数粪菌群的同时将粪便中无用的废料去除。在步骤s30中，混合离心所述洗涤菌液至少一次，即对粪便进行重复的清洗，可以得到粪菌含量较高的纯化菌液。步骤s40中将纯化菌液制成粉末状，但没有降低其中粪菌的数量和多样性，所以将粪便制成胶囊之后依然可以保证fmt技术的治疗效果。
11.在本发明的一个实例中，步骤s10中粪菌液的制备步骤如下：
12.s11：取确定重量的供体粪便；
13.s12：向供体粪便中加入生理盐水，得到稀释粪便；
14.s13：搅拌稀释粪便并过滤，得到粪菌液。
15.步骤s10是初步对粪便进行处理的过程，主要是将粪便中颗粒较大的杂质去除，将粪便制成溶液。其中，搅拌步骤可以将粪便打碎，减小粪便的粒径，搅拌的时间在3分钟最佳，过滤步骤采用多级过滤的方式层层筛选，依次经过直径1.5mm、1mm、0.5mm、0.15mm、0.1mm的滤网，采用多级过滤的方式可以高效的过滤粪便，减少过滤步骤的用时。经过多层过滤之后，得到相对纯净的粪菌液，便于后续步骤的进行，而且搅拌、过滤操作相对于热溶解不会影响粪菌的活性。
16.在本发明的一个实例中，在步骤s12中，每克供体粪便中需要加入至少3毫升的生理盐水。
17.为了便于搅拌、过滤操作的进行，在制作稀释粪便时，对于粪便和生理盐水的配比有一定的要求。常用的配比选择如下，在粪便重量小于100克时，加入650毫升生理盐水；在粪便重量大于等于100克、小于200克时，加入850毫升生理盐水；当粪便重量大于等于200克、小于300克时，加入900毫升生理盐水。
18.在本发明的一个实例中，对供体粪便进行除臭处理；和/或
19.对稀释粪便进行除臭处理；和/或
20.对粪菌液进行除臭处理。
21.在粪菌液的制备过程中，对粪便进行除臭处理，主要是考虑到粪菌液的制备在除菌柜中进行，空间相对密闭，在此过程中对粪便先进行除臭处理，可以减轻后续操作时操作员的负担。除臭处理将粪便中一些刺鼻难闻的气味去除，减轻了患者服药时的心理负担。
22.在本发明的一个实例中，步骤s20中，简单离心的转速为1800～2300转/分，离心的时间为2.8～3.2分钟。
23.离心步骤在离心机上进行，离心机将粪菌液分离成上下两层，将离心机转速设置成2000转/分、3分钟为最佳。上清液中的主要是密度、颗粒较小的材料，其中菌群的含量较小。悬浊液中菌群含量较大，主要用于制备肠道菌群胶囊。
24.在本发明的一个实例中，步骤s30中，混合离心是将至少两份洗涤菌液混合，在1800～2300转/分转速下离心2.8～3.2分钟，并将上层液体去除，保留下层液体。
25.随着混合离心的进行，上层液体被去除，整体液体的体积减小，再进行离心的效果比较差，因此将多份洗涤菌液混合，并进行多次离心，以达到浓缩、纯化菌群的效果。
26.在本发明的一个实例中，步骤s40中，肠道菌群胶囊的制备步骤包括：
27.s41：在-72～-88℃条件下，预冷处理胶囊制备设备2～3小时；
28.s42：向纯化菌液中加入活性保护剂，得到待用菌液；
29.s43：在无菌条件下，将待用菌液摊铺至制药盘中；
30.s44：将制药盘放入胶囊制备设备中，紧闭胶囊制备设备，进行真空干燥；
31.s45：在-63～-82℃条件下处理22～26小时后，得到菌液粉末；
32.s46：将菌液粉末置于胶囊壳中，得到肠道菌群胶囊；
33.其中，活性保护剂包括：甘油、可溶性淀粉、海藻糖、脱脂奶粉、甘氨酸。
34.在步骤s41中，对胶囊制备进行预冷处理，可以保证纯化菌液直接在-80℃条件下进行真空干燥，使粉化的菌液粉末质地均匀，不会出现结块的现象。在步骤s42中，向纯化菌液中加入活性保护剂，活性保护剂可以保护纯化菌液中的菌群在冷冻的过程中不被破坏。在活性保护剂中，使用海藻糖代替蔗糖，主要是考虑到海藻糖含有大量的维生素b2和不饱和脂肪酸，可以起到软化血管，降低血压等作用，使糖尿病患者也可以服用本发明的肠道菌群胶囊。同时，海藻糖还具有防止淀粉老化、防止蛋白质变性、抑制脂质氧化变质等功能，可以保护菌群的治疗活性。
35.本发明提供一种肠道菌群胶囊，通过上述肠道菌群胶囊的制备方法制备得到。
36.通过上述制备方法制备得到的肠道菌群胶囊，菌群种类丰富、活性较高，取用方便，降低了患者的治疗负担，而且治疗效果明显。
附图说明
37.图1为本发明实施例中粪便处理仪器的结构示意图。
38.附图标记：
39.100-粪便处理仪器；110-第一动力泵；120-集粪瓶；130-供水槽；140-过滤器；150-缓冲瓶；160-第二动力泵；170-分装装置。
具体实施方式
40.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
41.实施例一：
42.参见图1，启动粪便处理仪器100，称量80克粪便，放入集粪瓶120。按下“除臭”键，启动除臭装置。按下“注水”键，第一动力泵110将供水槽130中的生理盐水压入集粪瓶120，注入生理盐水650毫升。按下“搅拌”键，集粪瓶120上端的搅拌装置开始搅拌，将粪便和生理盐水混合。按下“过滤”键，稀释后的粪便经过管道进入过滤器140，过滤器140共设置有5个过滤瓶，每个过滤瓶中依次设置有直径1.5mm、1mm、0.5mm、0.15mm、0.1mm的滤网。经过过滤后的粪菌液暂时收集在缓冲瓶150。按下“分装”键，第二动力泵160启动，将缓冲瓶150中的
粪菌液压入分装装置170，分装装置170内包括12个收集瓶，每个收集瓶的大小相同，粪菌液依次将收集瓶装满。将收集瓶取出，密封保存待用。粪菌液收集完毕后，将粪便处理仪器100关闭，并将一次性耗材全部取出放入医疗垃圾桶，用75％酒精擦拭操作表面，并用紫外灯灭菌30分钟。
43.将多个收集瓶置入离心机中进行离心，设置转速2000转/分、时间3分钟。将离心完成的收集瓶从离心机取出，去除上清液，向收集瓶中加入少量的生理盐水，将2～3瓶的收集瓶中的悬浊液混合成一瓶，再次离心，抽取上清液，重复2～3次，完成洗涤、浓缩、纯化菌群的过程，获得纯化菌液。
44.取10毫升左右的纯化菌液与35毫升的生理盐水混合，摇匀后可通过tet途径置入患者的肠道，直接应用于临床。
45.若需要将纯化菌液制作成胶囊，则先将纯化菌液置于-80℃超低温冰箱待用。
46.肠道菌群胶囊的制备，先将胶囊制备设备启动，-80℃预冷处理2小时，纯化菌液中加入活性保护剂，其中活性保护剂中含有甘油、可溶性淀粉、海藻糖、脱脂奶粉、甘氨酸，可以保护粪菌不被冻伤，保持粪菌的活性。然后在生物安全柜中，将待用菌液快速摊铺至制药盘中，尽量保持摊铺面均匀。将制药盘放入胶囊制备装置，关闭好设备，在-80℃条件下真空干燥处理24小时。将粉末化的菌液粉末从装置中取出，置于工作台，使用工具盘将菌液粉末填充至胶囊壳中，装袋置于4℃保存。
47.实施例二：
48.参见图1，启动粪便处理仪器100，称量150克粪便，放入集粪瓶120。按下“除臭”键，启动除臭装置。按下“注水”键，第一动力泵110将供水槽130中的生理盐水压入集粪瓶120，注入生理盐水850毫升。按下“搅拌”键，集粪瓶120上端的搅拌装置开始搅拌，将粪便和生理盐水混合。按下“过滤”键，稀释后的粪便经过管道进入过滤器140，过滤器140共设置有5个过滤瓶，每个过滤瓶中依次设置有直径1.5mm、1mm、0.5mm、0.15mm、0.1mm的滤网。经过过滤后的粪菌液暂时收集在缓冲瓶150。按下“分装”键，第二动力泵160启动，将缓冲瓶150中的粪菌液压入分装装置170，分装装置170内包括12个收集瓶，每个收集瓶的大小相同，粪菌液依次将收集瓶装满。将收集瓶取出，密封保存待用。粪菌液收集完毕后，将粪便处理仪器100关闭，并将一次性耗材全部取出放入医疗垃圾桶，用75％酒精擦拭操作表面，并用紫外灯灭菌30分钟。
49.将多个收集瓶置入离心机中进行离心，设置转速1800转/分、时间3.2分钟。将离心完成的收集瓶从离心机取出，去除上清液，向收集瓶中加入少量的生理盐水，将2～3瓶的收集瓶中的悬浊液混合成一瓶，再次离心，抽取上清液，重复2～3次，完成洗涤、浓缩、纯化菌群的过程，获得纯化菌液。
50.取12毫升左右的纯化菌液与35毫升的生理盐水混合，摇匀后可通过tnt途径置入患者的肠道，直接应用于临床。
51.若需要将纯化菌液制作成胶囊，则先将纯化菌液置于-80℃超低温冰箱待用。
52.肠道菌群胶囊的制备，先将胶囊制备设备启动，-80℃预冷处理2.3小时，纯化菌液中加入活性保护剂，其中活性保护剂中含有甘油、可溶性淀粉、海藻糖、脱脂奶粉、甘氨酸，可以保护粪菌不被冻伤，保持粪菌的活性。然后在生物安全柜中，将待用菌液快速摊铺至制药盘中，尽量保持摊铺面均匀。将制药盘放入胶囊制备装置，关闭好设备，在-63℃条件下真
空干燥处理26小时。将粉末化的菌液粉末从装置中取出，置于工作台，使用工具盘将菌液粉末填充至胶囊壳中，装袋置于4℃保存。
53.实施例三：
54.参见图1，启动粪便处理仪器100，称量180克粪便，放入集粪瓶120。按下“除臭”键，启动除臭装置。按下“注水”键，第一动力泵110将供水槽130中的生理盐水压入集粪瓶120，注入生理盐水850毫升。按下“搅拌”键，集粪瓶120上端的搅拌装置开始搅拌，将粪便和生理盐水混合。按下“过滤”键，稀释后的粪便经过管道进入过滤器140，过滤器140共设置有5个过滤瓶，每个过滤瓶中依次设置有直径1.5mm、1mm、0.5mm、0.15mm、0.1mm的滤网。经过过滤后的粪菌液暂时收集在缓冲瓶150。按下“分装”键，第二动力泵160启动，将缓冲瓶150中的粪菌液压入分装装置170，分装装置170内包括12个收集瓶，每个收集瓶的大小相同，粪菌液依次将收集瓶装满。将收集瓶取出，密封保存待用。粪菌液收集完毕后，将粪便处理仪器100关闭，并将一次性耗材全部取出放入医疗垃圾桶，用75％酒精擦拭操作表面，并用紫外灯灭菌30分钟。
55.将多个收集瓶置入离心机中进行离心，设置转速2300转/分、时间2.8分钟。将离心完成的收集瓶从离心机取出，去除上清液，向收集瓶中加入少量的生理盐水，将2～3瓶的收集瓶中的悬浊液混合成一瓶，再次离心，抽取上清液，重复2～3次，完成洗涤、浓缩、纯化菌群的过程，获得纯化菌液。
56.取14毫升左右的纯化菌液与35毫升的生理盐水混合，摇匀后可通过tnt途径置入患者的肠道，直接应用于临床。
57.若需要将纯化菌液制作成胶囊，则先将纯化菌液置于-80℃超低温冰箱待用。
58.肠道菌群胶囊的制备，先将胶囊制备设备启动，-80℃预冷处理3小时，纯化菌液中加入活性保护剂，其中活性保护剂中含有甘油、可溶性淀粉、海藻糖、脱脂奶粉、甘氨酸，可以保护粪菌不被冻伤，保持粪菌的活性。然后在生物安全柜中，将待用菌液快速摊铺至制药盘中，尽量保持摊铺面均匀。将制药盘放入胶囊制备装置，关闭好设备，在-75℃条件下真空干燥处理24.5小时。将粉末化的菌液粉末从装置中取出，置于工作台，使用工具盘将菌液粉末填充至胶囊壳中，装袋置于4℃保存。
59.实施例四：
60.参见图1，启动粪便处理仪器100，称量200克粪便，放入集粪瓶120。按下“除臭”键，启动除臭装置。按下“注水”键，第一动力泵110将供水槽130中的生理盐水压入集粪瓶120，注入生理盐水900毫升。按下“搅拌”键，集粪瓶120上端的搅拌装置开始搅拌，将粪便和生理盐水混合。按下“过滤”键，稀释后的粪便经过管道进入过滤器140，过滤器140共设置有5个过滤瓶，每个过滤瓶中依次设置有直径1.5mm、1mm、0.5mm、0.15mm、0.1mm的滤网。经过过滤后的粪菌液暂时收集在缓冲瓶150。按下“分装”键，第二动力泵160启动，将缓冲瓶150中的粪菌液压入分装装置170，分装装置170内包括12个收集瓶，每个收集瓶的大小相同，粪菌液依次将收集瓶装满。将收集瓶取出，密封保存待用。粪菌液收集完毕后，将粪便处理仪器100关闭，并将一次性耗材全部取出放入医疗垃圾桶，用75％酒精擦拭操作表面，并用紫外灯灭菌30分钟。
61.将多个收集瓶置入离心机中进行离心，设置转速1900转/分、时间3分钟。将离心完成的收集瓶从离心机取出，去除上清液，向收集瓶中加入少量的生理盐水，将2～3瓶的收集
瓶中的悬浊液混合成一瓶，再次离心，抽取上清液，重复2～3次，完成洗涤、浓缩、纯化菌群的过程，获得纯化菌液。
62.取15毫升左右的纯化菌液与35毫升的生理盐水混合，摇匀后可通过tnt途径置入患者的肠道，直接应用于临床。
63.若需要将纯化菌液制作成胶囊，则先将纯化菌液置于-80℃超低温冰箱待用。
64.肠道菌群胶囊的制备，先将胶囊制备设备启动，-80℃预冷处理2小时，纯化菌液中加入活性保护剂，其中活性保护剂中含有甘油、可溶性淀粉、海藻糖、脱脂奶粉、甘氨酸，可以保护粪菌不被冻伤，保持粪菌的活性。然后在生物安全柜中，将待用菌液快速摊铺至制药盘中，尽量保持摊铺面均匀。将制药盘放入胶囊制备装置，关闭好设备，在-80℃条件下真空干燥处理24小时。将粉末化的菌液粉末从装置中取出，置于工作台，使用工具盘将菌液粉末填充至胶囊壳中，装袋置于4℃保存。
65.实施例五：
66.参见图1，启动粪便处理仪器100，称量300克粪便，放入集粪瓶120。按下“除臭”键，启动除臭装置。按下“注水”键，第一动力泵110将供水槽130中的生理盐水压入集粪瓶120，注入生理盐水900毫升。按下“搅拌”键，集粪瓶120上端的搅拌装置开始搅拌，将粪便和生理盐水混合。按下“过滤”键，稀释后的粪便经过管道进入过滤器140，过滤器140共设置有5个过滤瓶，每个过滤瓶中依次设置有直径1.5mm、1mm、0.5mm、0.15mm、0.1mm的滤网。经过过滤后的粪菌液暂时收集在缓冲瓶150。按下“分装”键，第二动力泵160启动，将缓冲瓶150中的粪菌液压入分装装置170，分装装置170内包括12个收集瓶，每个收集瓶的大小相同，粪菌液依次将收集瓶装满。将收集瓶取出，密封保存待用。粪菌液收集完毕后，将粪便处理仪器100关闭，并将一次性耗材全部取出放入医疗垃圾桶，用75％酒精擦拭操作表面，并用紫外灯灭菌30分钟。
67.将多个收集瓶置入离心机中进行离心，设置转速2200转/分、时间3分钟。将离心完成的收集瓶从离心机取出，去除上清液，向收集瓶中加入少量的生理盐水，将2～3瓶的收集瓶中的悬浊液混合成一瓶，再次离心，抽取上清液，重复2～3次，完成洗涤、浓缩、纯化菌群的过程，获得纯化菌液。
68.取10毫升左右的纯化菌液与35毫升的生理盐水混合，摇匀后可通过tnt途径置入患者的肠道，直接应用于临床。
69.若需要将纯化菌液制作成胶囊，则先将纯化菌液置于-80℃超低温冰箱待用。
70.肠道菌群胶囊的制备，先将胶囊制备设备启动，-80℃预冷处理2小时，纯化菌液中加入活性保护剂，其中活性保护剂中含有甘油、可溶性淀粉、海藻糖、脱脂奶粉、甘氨酸，可以保护粪菌不被冻伤，保持粪菌的活性。然后在生物安全柜中，将待用菌液快速摊铺至制药盘中，尽量保持摊铺面均匀。将制药盘放入胶囊制备装置，关闭好设备，在-80℃条件下真空干燥处理24小时。将粉末化的菌液粉末从装置中取出，置于工作台，使用工具盘将菌液粉末填充至胶囊壳中，装袋置于4℃保存。
71.虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。