一种脱细胞真皮基质微粒的制备方法与流程

1.本发明涉及人体器官再生与组织工程技术领域，更具体的说是涉及一种脱细胞真皮基质微粒的制备方法。


背景技术：

2.因外伤、肿瘤切除或先天性畸形等导致的软组织缺损，以及面部微整形手术和乳房成形术等软组织填充在临床上十分常见。透明质酸、胶原等可注射填充剂被广泛用于软组织填充术中。而这些材料难以与周围组织融合，易被吸收。因此，通常需进行反复注射才能保持长期效果。而反复注射会导致栓塞、过敏以及其他不良反应，严重时甚至危及生命。因此，软组织缺损领域迫切需要用更安全、更高效的填充材料。
3.事实上，自体组织移植术是临床首选软组织填充手术，其中自体真皮组织是临床常用的填充组织。然而，移植的自体真皮组织不能大量获得，异体真皮组织会出现免疫排斥反应以及移植后的真皮组织会出现液化、钙化、坏死以及吸收等问题，严重制约着真皮组织在软组织填充中的临床应用。
4.目前，组织工程是重建人体组织和器官的最有前途的方法。旨在制造真皮组织的组织工程替代品是用于软组织填充的具有非常广阔前景的技术。脱细胞真皮基质去除了会引发免疫反应的细胞和抗原成分，其结构、组成和生物活性与天然细胞外基质相似而成为真皮组织工程支架的研究重点。临床上，粉末、海绵或水凝胶被认为是最合适的软组织填充物的形式，因为它可以植入人体注射(微创方法)和任意形状以适合软质的不规则形态组织缺损。
5.现有脱细胞微粒制备的大小参差不齐，易堵塞注射针头，微创注射相对困难。因此，如何提供一种可注射真皮脱细胞微粒用于软组织缺损注射填充是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种脱细胞真皮基质微粒的制备方法。该方法通过联合物理、化学和生物酶解的方法制备生物相容性好、免疫原性低、含有丰富活性成分(主要为细胞因子)的脱细胞真皮基质材料，然后进一步通过加工制备形成微粒化的脱细胞真皮基质。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种脱细胞真皮基质微粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.(1)去表皮：将猪皮经消毒、清洗后，使用氯化钠溶液除去表皮；
10.(2)去除真皮中细胞成分：去表皮后成分依次经氢氧化钠溶液浸泡(去除部分脂肪)、sds溶液浸泡(脱细胞处理进一步去除脂肪)、胰蛋白酶-edta溶液浸泡(进一步脱细胞处理)、清洗后，得到脱细胞真皮基质；
11.(3)制备脱细胞真皮基质微粒：将所述脱细胞真皮基质依次经研磨、均质、过筛后
得到脱细胞真皮基质微粒。
12.上述技术方案达到的技术效果：本发明制备的脱细胞真皮基质微粒洁净无杂质，含有脱细胞脂肪基质支架的主要活性成分，无免疫反应，能够较好的应用于软组织损伤填充。
13.进一步的，步骤(1)中所述消毒、清洗为用质量浓度0.1％的新洁尔灭溶液浸泡30～60min，之后用pbs溶液清洗1～2遍。
14.上述技术方案达到的技术效果：以新洁尔灭溶液对组织进行消毒清洗，可以有效防止微生物滋生。
15.进一步的，步骤(1)中所述使用氯化钠溶液除去表皮的具体操作为：使用质量浓度为1～3％的氯化钠溶液25～37℃浸泡48～72h，期间进行搅拌，搅拌速度为300～500rpm；之后使用ddh2o清洗2～3遍。
16.取得的有益效果：去除表皮，获得真皮组织。
17.进一步的，步骤(2)中所述氢氧化钠溶液浸泡为：使用质量浓度为0.5～1％的氢氧化钠溶液25～37℃浸泡12～24h，期间进行搅拌，搅拌速度为300～500rpm。
18.上述技术方案达到的技术效果：氢氧化钠溶液可以使细胞内外的渗透压失去平衡，进而促进细胞失水，使细胞迅速皱缩死亡。
19.进一步的，步骤(2)中所述sds溶液浸泡为：使用质量浓度为0.25～0.5％的sds溶液25～37℃浸泡40～48h，期间进行搅拌，搅拌速度为300～500rpm。
20.上述技术方案达到的技术效果：sds溶液作为一种去垢剂，，可以去除脂肪以及洗涤清除死亡的细胞。
21.进一步的，步骤(2)中所述胰蛋白酶-edta溶液浸泡为：使用胰蛋白酶-edta溶液在37℃下浸泡12～24h，期间进行搅拌，搅拌速度为300～500rpm。
22.上述技术方案达到的技术效果：一胰蛋白酶-edta溶液进行生物酶解，进一步消化去除残留细胞。
23.进一步的，所述步骤(3)的具体操作为：
24.(31)25～37℃研磨20～30min,研磨条件为：利用ika研磨机间断性研磨，研磨转速最大为28000rpm；
25.(32)使用液氮冷冻10min，机械碾碎后放入ika研磨机间断性均质，时间10min，并在均质过程中加入1～2次液氮；
26.(33)根据分样筛的孔径获得400μm以下大小的脱细胞真皮基质微粒。
27.上述技术方案达到的技术效果：获得的微粒黏性小，分散性好，易过筛。
28.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)脱细胞真皮基质脱细胞效果好，含有对细胞增殖、迁移和分化有重要作用的生长因子等脱细胞脂肪基质支架的主要活性成分。(2)脱细胞后的真皮基质支架去除了引起免疫反应的细胞成分，不会引起相关免疫反应。(3)脱细胞真皮基质微粒过筛、注射效果佳。(4)脱细胞真皮基质微粒能够较好的用于软组织缺损修复的注射填充。本发明方法同时可以应用到其他脱细胞材料微粒的制备，该方法简单易行，具有良好的医学应用价值。
附图说明
29.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
30.图1附图为本发明实施例其中脱细胞真皮基质(猪)前后对比图；其中a为皮肤组织，b为脱细胞真皮组织；
31.图2附图为本发明实施例1制备的可注射脱细胞微粒溶液。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.本发明实施例所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；实施例中未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。
34.实施例1
35.一种脱细胞真皮基质微粒的制备方法，包括如下步骤：
36.(1)去表皮：
37.(11)取健康白色家猪新鲜猪皮，剃毛清洗并修剪成5cm*5cm*0.5mm的断层皮片，用质量浓度0.1％的新洁尔灭溶液浸泡消毒30min，之后用pbs溶液清洗；
38.(12)使用质量浓度为3％的氯化钠溶液25℃浸泡48h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
39.(13)使用ddh2o清洗3遍。
40.(2)去除真皮中细胞成分：
41.(21)将步骤(1)制备而成的去表皮后成分使用质量浓度为1％的氢氧化钠溶液25℃浸泡12h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
42.(22)使用质量浓度为0.25％的sds溶液25℃浸泡40h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
43.(23)使用胰蛋白酶-edta(0.25％-0.02％)溶液在37℃下浸泡12h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
44.(24)用ddh2o清洗3遍，得到脱细胞真皮基质。
45.(3)制备脱细胞真皮基质微粒：
46.(31)25℃研磨30min,研磨条件为：利用ika研磨机间断性研磨，最大转速为28000rpm；
47.(32)使用液氮冷冻10min，机械碾碎后放入ika研磨机间断性均质，均质时间10min，并在均质过程中加入2次液氮；
48.(33)根据分样筛的孔径获得400μm以下大小的脱细胞真皮基质微粒。
49.实施例2
50.一种脱细胞真皮基质微粒的制备方法，包括如下步骤：
51.(1)去表皮：
52.(11)取健康白色家猪新鲜猪皮，剃毛清洗并修剪成5cm*5cm*0.5mm的断层皮片，用质量浓度0.1％的新洁尔灭溶液浸泡消毒30min，之后用pbs溶液清洗；
53.(12)使用质量浓度为3％的氯化钠溶液25℃浸泡72h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
54.(13)使用ddh2o清洗3遍。
55.(2)去除真皮中细胞成分：
56.(21)将步骤(1)制备而成的去表皮后成分使用质量浓度为1％的氢氧化钠溶液25℃浸泡12h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
57.(22)使用质量浓度为0.25％的sds溶液25℃浸泡40h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
58.(23)使用胰蛋白酶-edta(0.25％-0.02％)溶液在37℃下浸泡12h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
59.(24)用ddh2o清洗3遍，得到脱细胞真皮基质。
60.(3)制备脱细胞真皮基质微粒：
61.(31)25℃研磨30min,研磨条件为：利用ika研磨机间断性研磨，最大转速为28000rpm；
62.(32)使用液氮冷冻10min，机械碾碎后放入ika研磨机间断性均质，均质时间10min，并在均质过程中加入2次液氮；
63.(33)根据分样筛的孔径获得400μm以下大小的脱细胞真皮基质微粒实施例3
64.一种脱细胞真皮基质微粒的制备方法，包括如下步骤：
65.(1)去表皮：
66.(11)取健康白色家猪新鲜猪皮，剃毛清洗并修剪成5cm*5cm*0.5mm的断层皮片，用质量浓度0.1％的新洁尔灭溶液浸泡消毒30min，之后用pbs溶液清洗；
67.(12)使用质量浓度为3％的氯化钠溶液25℃浸泡48h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
68.(13)使用ddh2o清洗3遍。
69.(2)去除真皮中细胞成分：
70.(21)将步骤(1)制备而成的去表皮后成分使用质量浓度为1％的氢氧化钠溶液25℃浸泡12h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
71.(22)使用质量浓度为0.25％的sds溶液25℃浸泡40h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
72.(23)使用胰蛋白酶-edta(0.25％-0.02％)溶液在37℃下浸泡12h，期间进行搅拌，搅拌速度为300rpm；
73.(24)用ddh2o清洗3遍，得到脱细胞真皮基质。
74.(3)制备脱细胞真皮基质微粒：
75.(31)25℃研磨30min,研磨条件为：利用ika研磨机间断性研磨，最大转速为28000rpm；
76.(32)使用液氮冷冻10min，机械碾碎后放入ika研磨机间断性均质，均质时间10min，并在均质过程中加入2次液氮；
77.(33)根据分样筛的孔径获得400μm以下大小的脱细胞真皮基质微粒
78.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
79.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。