一种提取金银花有效成分的方法、产品及应用与流程

1.本发明涉及药物活性成分提取技术领域，特别是涉及一种提取金银花有效成分的方法、产品及应用。


背景技术：

2.金银花为忍冬科植物忍冬(lonicera japonica thunb)的干燥花蕾或初开的花，其药用历史悠久，是清热解毒、凉散风热的良药，金银花作为药食两用的中药材，科学家对其研究越来越广泛和深入。金银花的有效活性成分主要是绿原酸、酚类以及黄酮类物质。目前提取金银花有效活性成分的方法普遍存在提取效率较低或者提取工艺复杂的缺陷。


技术实现要素：

3.为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供一种提取金银花有效成分的方法、产品及应用，利用简单的提取工艺对金银花有效成分进行高效提取。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明技术方案之一，一种提取金银花有效成分的方法，包括以下步骤：
6.步骤1，将金银花进行微波活化，得到活化金银花；
7.步骤2，将所述活化金银花进行真空冻干处理，得到冻干金银花；
8.步骤3，将所述冻干金银花置于甘油水溶液中进行浸提，对提取液进行离心，收集上层液体，对所述上层液体进行抽滤、浓缩得到所述金银花有效成分。
9.进一步地，步骤1中所述微波的功率为650～750w，时间为1～2min。
10.进一步地，步骤2中所述真空冻干处理的温度为-10～-50℃，时间为16-20小时。
11.进一步地，步骤3中金银花与所述甘油水溶液的质量比为1:10～50。
12.进一步地，步骤3中所述甘油水溶液中甘油的质量浓度为20％-60％。
13.当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为20％时，金银花有效成分中总黄酮含量最高，为8.1210mg cae/100g；
14.当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为60％时，金银花有效成分中总酚含量最高，为3.9360mg gae/100g；
15.当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为20％时，金银花有效成分的抗氧化性最强，为0.0064mg vc/mg；当金银花与甘油水溶液的质量比为1:50且甘油水溶液中甘油的质量浓度为40％时，金银花有效成分的抗氧化性最差，为0.0006mg vc/mg；
16.当金银花与甘油水溶液的质量比为1:50且甘油水溶液中甘油的质量浓度为60％时，金银花有效成分的dpph自由基清除率最高，为97％；当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为20％时，金银花有效成分的dpph自由基清除率最低，为6％；
17.进一步地，步骤3中所述浸提的时间不少于24小时。
18.进一步地，步骤3中所述浓缩具体为：50℃减压旋转蒸发浓缩至半小时内无液滴滴下。
19.本发明技术方案之二，利用上述提取金银花有效成分的方法制备得到的金银花有效成分，其总酚含量大于1.7180mggae/100g；总黄酮含量大于3.7689mgcae/100g；抗坏血酸含量大于0.0006mg vc/mg。
20.本发明技术方案之三，上述金银花有效成分在制备抗氧化产品中的应用，所述产品为药物、保健品或化妆品。
21.本发明技术方案之四，上述金银花有效成分在制备抑菌产品中的应用，所述产品为药物、保健品或化妆品。
22.本发明公开了以下技术效果：
23.(1)本发明在浸提前采用微波活化工艺对金银花中的有效成分进行活化，可以使其在后续浸提过程中更容易析出。
24.(2)本发明在浸提前对活化后的金银花进行真空冻干处理，能够在排出金银花中水分的同时，进一步促进有效成分在浸提过程中的析出。
25.(3)微波活化工艺与真空冻干处理相结合能够大幅度提升金银花有效成分的提取效率，提高金银花有效成分的抗氧化性和抑菌效果。
26.(4)本发明通过调节甘油浓度以及料液比，能够调节金银花有效成分中总酚和总黄酮的比例，进而调节其抗氧化性。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1为本发明绘制的没食子酸标准曲线；
29.图2为本发明绘制的芦丁标准曲线；
30.图3为本发明绘制的抗坏血酸标准曲线。
具体实施方式
31.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
32.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
33.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所
有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
34.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
35.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
36.本发明所用原材料如无特殊说明均自购买途径得到。
37.本发明实施例所用金银花为金银花干花，购自假日吉尔康大药房。
38.实施例1
39.步骤1，准确称取10g金银花，清洗干净后，置于微波炉中于700w功率条件下微波1.5min，得到活化金银花；
40.步骤2，将步骤1得到的活化金银花于-20℃真空冻干18小时，得到冻干金银花；
41.步骤3，将步骤2得到的冻干金银花粉碎，过100目筛，加入锥形瓶中，分别加入100g质量浓度为20％的甘油水溶液，搅拌均匀后，浸提24h；将提取液转移至离心杯中，4000r/min，常温离心10min，收集上层液体，将上层液体转入真空抽滤机进行抽滤，收集滤液；将滤液置于梨形瓶中，50℃减压旋转蒸发浓缩至半小时内无液滴滴下，收集浓缩液(即金银花有效成分)于样品瓶中标记为jy12。
42.实施例2
43.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液的质量浓度为40％。得到的金银花有效成分标记为jy14。
44.实施例3
45.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液的质量浓度为60％。得到的金银花有效成分标记为jy16。
46.实施例4
47.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液添加量为200g。
48.得到的金银花有效成分标记为jy22。
49.实施例5
50.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液添加量为200g，质量浓度为40％。得到的金银花有效成分标记为jy24。
51.实施例6
52.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液添加量为200g，质量浓度为60％。得到的金银花有效成分标记为jy26。
53.实施例7
54.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液添加量为500g。得到的金银花有效成分标记为jy52。
55.实施例8
56.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液添加量为500g，质量浓度为40％。得到的金银花有效成分标记为jy54。
57.实施例9
58.与实施例1相同，区别仅在于，步骤三中甘油水溶液添加量为500g，质量浓度为60％。得到的金银花有效成分标记为jy56。
59.对比例1
60.与实施例1相同，区别仅在于，省略步骤1中微波活化处理的步骤。得到的金银花有效成分标记为jyd1。
61.对比例2
62.与实施例1相同，区别仅在于，省略步骤2中真空冻干的步骤。得到的金银花有效成分标记为jyd2。
63.对比例3
64.与实施例1相同，区别仅在于，省略步骤1中微波活化处理以及步骤2中真空冻干的步骤。得到的金银花有效成分标记为jyd3。
65.对实施例1-9以及对比例1-3制备的金银花有效成分中的总酚含量进行测定，具体如下：
66.对照品没食子酸配成0.1mg/ml的标准溶液，准确量取上述标准液0.00ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.00ml和1.20ml，分别置于10.0ml具塞试管中，加入1.00ml的福林酚显色剂，混匀，再加入5.0ml浓度为1mol/l碳酸钠溶液，用蒸馏水定容至刻度，混合均匀，在室温、避光条件下放置1h，测定760nm处的吸光度值，以没食子酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制没食子酸标准曲线，如图1所示。
67.分别准确移取1.00ml待测样品(金银花有效成分)至10.0ml试管中，按上述方法测定吸光度值，根据吸光度值在没食子酸标准曲线中得出相应的值，金银花有效成分中的总酚含量以没食子酸的相对量表示(mg gae/100g)。结果如表1所示。
68.表1
[0069][0070]
由表1能够看出，当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为60％时，金银花有效成分中总酚含量最高，为3.936mg gae/100g；省略微波活化的步骤或者真空冻干的步骤，均会降低提取得到的金银花有效成分中的总酚含量。
[0071]
对实施例1-9以及对比例1-3制备的金银花有效成分中的总黄酮含量进行测定，具体如下：
[0072]
对照品芦丁用甲醇配成0.1mg/ml的标准溶液，精准吸取标准溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，分别置于10ml刻度试管中，加入0.3ml质量浓度5％的亚硝酸钠，摇匀后静置6min，再加入0.3ml 10％硝酸铝，摇匀后静置6min，加入4ml 4％氢氧化钠溶液，蒸馏水定容，摇匀后静置15min，在510nm处分别测量吸光值，以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制芦丁标准曲线，如图2所示。
[0073]
分别准确移取1.0ml金银花有效成分，置于10ml刻度试管中，按上述方法测定吸光度值。根据吸光度值在芦丁标准曲线中得出相应的值，金银花有效成分中总黄酮含量以芦
丁的相对含量表示(mg cae/100g)。结果如表2所示。
[0074]
表2
[0075][0076]
由表2能够看出，当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为20％时，金银花有效成分中总黄酮含量最高，为8.1210mg cae/100g；省略微波活化的步骤或者真空冻干的步骤，均会降低提取得到的金银花有效成分中的总黄酮含量。
[0077]
对实施例1-9以及对比例1-3制备的金银花有效成分的抗氧化性进行测定，具体如下：
[0078]
取0.1ml不同浓度的抗坏血酸标准溶液0％、1％、2％、3％、4％、5％分别置于具塞试管中，分别加入5ml混合溶液(内含0.6mol/l硫酸、28mmol/l磷酸钠、4mmol/l钼酸铵)，加塞，95℃水浴加热90min，取出流水冷却至室温，测定695nm波长处吸光度值，绘制抗坏血酸标准曲线，如图3所示。
[0079]
分别准确移取0.1ml金银花有效成分于10ml试管中，按上述方法测定吸光度值，在抗坏血酸标准曲线上查得1mg金银花有效成分相当于多少vc的量，即：x mg vc/mg样品。结果如表3所示。
[0080]
表3
[0081][0082]
由表3能够看出，当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为20％时，金银花有效成分的抗氧化性最强，为0.0064mg vc/mg；当金银花与甘油水溶液的质量比为1:50且甘油水溶液中甘油的质量浓度为40％时，金银花有效成分的抗氧化性最差，为0.0006mg vc/mg；省略微波活化的步骤或者真空冻干的步骤，均会降低提取得到的金银花有效成分的抗氧化性。
[0083]
对实施例1-9以及对比例1-3制备的金银花有效成分的dpph自由基清除率进行测定，具体如下：
[0084]
取0.1ml甘油提取物(金银花有效成分)分别加入3.9ml 1
×
10-4
mol/l的dpph溶液，摇匀。从加入dpph溶液开始计时，室温下避光放置90min后，测定517nm波长处吸光度，记为a1。另取0.1ml蒸馏水代替提取物进行上述操作，吸光度记为a0。按下式计算清除率：
[0085][0086]
结果如表4所示：
[0087]
表4
[0088][0089]
由表4能够看出，当金银花与甘油水溶液的质量比为1:50且甘油水溶液中甘油的质量浓度为60％时，金银花有效成分的dpph自由基清除率最高，为97％；当金银花与甘油水溶液的质量比为1:10且甘油水溶液中甘油的质量浓度为20％时，金银花有效成分的dpph自由基清除率最低，为6％；省略微波活化的步骤或者真空冻干的步骤，均会降低提取得到的金银花有效成分的dpph自由基清除率。
[0090]
对实施例1-9以及对比例1-3制备的金银花有效成分的抑菌效果进行测定，具体如下：
[0091]
于超净工作台中从菌种平板中分别用接种环将大肠杆菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和黑曲霉挑取一环划线在固体培养基平板上，做好标记，于37℃生化培养箱中倒置培养14-16h(黑曲霉培养3-4天)。
[0092]
从上述活化的大肠杆菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌平板上挑取两环菌落接种到50ml液体培养基中，标记，置于37℃恒温培养箱中，转速180r/min震荡培养14h-16h。直至其在分光光度计620nm波长下吸光度达到0.8，停止培养。
[0093]
将活化好的黑曲霉平板用无菌水清洗，收集菌液，用注射器吸取菌液并用针头过滤器过滤菌液，取适量滤液滴于血球计数板上并置于光学显微镜下数菌液孢子数。
[0094]
每毫升细胞数＝每小格细胞平均数
×4×
106×
稀释倍数
[0095]
以孢子数10
5-107的菌液作为种子液。
[0096]
滤纸用打孔器打成0.6cm直径的圆片，装在培养皿中密封灭菌。无菌条件下，用无菌镊子把滤纸圆片放入样品溶液中浸泡30-60分钟，备用。
[0097]
在无菌操作下，在每300ml已灭菌的并冷却至55-60℃的培养基中加入1ml种子菌液，充分摇匀后，倒入无菌的培养皿中，待培养基冷却凝固后，将浸泡样品的滤纸片放在凝固好的测试菌平板中，每个样品做两个平行。静置20分钟后平放37℃恒温培养箱中培养16-18h后，测量抑菌圈大小，用cm表示。用同样的处理方式测试黑曲霉的抑菌效果。结果如表5所示。
[0098]
表5
[0099][0100]
由表5能够看出，本发明制备的金银花有效成分对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌和黑曲霉均具有一定的抑制作用，具有广谱抑菌作用，其中对金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉的抑制作用较强。
[0101]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。