含有天山雪莲细胞培养物的组合物及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及化妆品领域，更具体的说涉及了一种含有天山雪莲细胞培养物的组合物及其制备方法和在化妆品中的应用。


背景技术：

2.从医学角度来说，炎症反应是人体组织对于各种损伤因子刺激所发生的以人体防御为主的基本反应。而导致皮肤炎症的原因主要包括以下几方面：1.外界环境刺激：皮肤的健康状况会受到外界环境等多方面因素影响。常见的有过冷或过热的环境，强烈风沙以及空气中的污染物、粉尘以及花粉等都会对皮肤的刺激。2.护肤品中的刺激成分：比如酒精、香精香料、防腐剂等成分，还有护肤品中的活性成分也是刺激成分的一部分。活性成分在化妆品中具有两面性，适度浓度的活性成分能帮助改善皮肤状况，浓度不适宜可能因为皮肤不耐受而导致皮肤炎症出现。3.皮肤出油：油脂分泌旺盛，导致皮脂腺导管易闭塞，易引起痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、马拉色菌等菌群的异常增殖，导致面部皮肤感染，易诱发闭口粉刺、痤疮等皮肤问题。4.紫外线刺激：紫外线短波uvb会直接导致皮肤角质形成细胞等细胞释放炎症因子，从而导致皮肤在短时间内出现泛红、发热。同时紫外线还能刺激黑素细胞活化，导致皮肤色素沉着。除此之外，紫外线还会加速皮肤衰老，影响皮肤正常代谢。
3.因为天然植物中某些成分具有抗炎、抗氧化等作用，它们对皮肤作用温和，刺激性小，安全性高，因此，天然植物成分在化妆品中的应用具有很广阔的前景。
4.雪莲：性味：苦、微苦、温；功能主治：清热解毒、祛风湿、消肿、止痛。用于头部创伤、妇科病、类风湿关节炎、中风、高山反应、外敷消肿(《新疆中草药》，新疆维吾尔自治区革命委员会卫生局，1976年著)。天山雪莲生于于天山山脉海拔4000米左右的高山草坡、悬崖陡壁之上、冰渍岩缝之中，由于雪莲生长在雪山附近特殊环境中，收到极强紫外线照射，本身具有吸收紫外线的能力。它是新疆特有的珍奇名贵中草药。天山雪莲是唯一列入《中国植物红皮书》的雪莲植物。天山雪莲细胞培养物，选取菊科植物天山雪莲离体组织，通过脱分化形成的愈伤组织作为继代种子，给予一定条件进行继代培养而获得的紫红色团块状颗粒。
5.五味子为木兰科植物五味子属北五味子(schisandrachinensis(turcz.)baill)的干燥成熟果实，是一种有名的传统中药，同时也在现代用药中发挥作用。现代医学研究表明，北五味子含有五味子乙素、三萜类、木脂素、多糖等多种功能成分，具有降血糖、抗氧化、保护肝脏等活性。专利cn200910069813.5公开了五味子提取物在制备防晒护肤品中的应用，证明了五味子提取物对紫外线有吸收的功效，可以减少因紫外线导致的炎症反应。
6.炎症反应是皮肤对外界刺激做出的应激性反应，炎症可能会加重皮肤色素沉淀，加速皮肤衰老等问题，因此开发一种安全性高，环境友好，抗炎显著且作用机理明确的植物抗炎提取物有广阔的应用市场。


技术实现要素：

7.本发明针对化妆品领域现有技术中抗炎作用原料作用安全性差，效果低等问题，
提供了一种含有天山雪莲细胞培养物的抗炎组合物及其制备方法和在化妆品领域的应用。本发明的抗炎组合物通过精选天山雪莲细胞培养物和五味子进行复配，可协同发挥增强抗炎及调控抗菌肽的作用、抗氧化作用和美白作用，从而将其应用于化妆品中，提高产品效果。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
9.一方面，本发明公开了一种抗炎组合物，所述的组合物包括以下中药原料：天山雪莲细胞培养物和五味子。
10.优选地，所述的天山雪莲细胞培养物、五味子提取物的质量比为1:3
‑
4:1，进一步优选地，质量比为1:1。
11.优选地，上述组合物还包括白藜芦醇。
12.优选地，按质量百分比计，上述白藜芦醇为0.1％
‑
0.3％。
13.其中，上述组合物中的天山雪莲细胞培养物、五味子和白藜芦醇是通过细胞实验对大量植物提取物进行筛选后，确定三者均有具有抑制炎症因子前列腺素e2(pge
‑
2)和调控抗菌肽ll
‑
37的作用。
14.雪莲又称雪荷花，属于菊科凤毛菊属(saussurea)植物，雪莲花作为一种历史悠久的民族药，在很早之前就被西藏、新疆等地少数民族广泛的使用。雪莲能够在高山恶劣的自然条件下独立生存，与其所形成特殊的适应机制与活性成分密切相关。研究表明，雪莲的活性成份主要有多糖类、黄酮类、生物碱、甾醇及挥发油等，这些活性成分使其具有抗炎、抗辐射、清除自由基及抗菌、抗病毒等生物学功能。而经过uvb照射之后皮肤中会有过量的炎症因子激活等生理过程，因此，雪莲花的活性成分在抵御uvb照射带来的皮肤损伤中具有较大的作用。雪莲培养物与天然植株提取物活性成分含量对比，主要功能性活性物质高出数倍以上。总黄酮高出4倍，总蛋白高出将近2倍。与野生天山雪莲相比，雪莲培养物主要活性成分含量更高。
15.五味子为木兰科植物五味子属北五味子(schisandrachinensis(turcz.)baill)的干燥成熟果实，是一种有名的传统中药，同时也在现代用药中发挥作用。现代医学研究表明，北五味子含有五味子乙素、三萜类、木脂素、多糖等多种功能成分，具有降血糖、抗氧化、保护肝脏等活性。
16.白藜芦醇是一种植物多酚，又名芪三酚。近年来，由于广泛的生物活性而备受关注，已有大量的研究证实白藜芦醇具有抗氧化应激、抗炎、抗菌、调控脂肪沉积等功能。
17.另一方面，本发明还公开了一种上述组合物的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：
18.s1、将天山雪莲细胞培养物、五味子和1，3
‑
丁二醇混合后，热回流提取，精滤，收集滤液，得到提取液；
19.s2、将s1步骤得到的提取液加入白藜芦醇，即得到所述组合物。
20.优选地，步骤s1中所述1，3
‑
丁二醇溶液的体积百分数为10
‑
50％，优选为30％。
21.优选地，步骤s1中雪莲和五味子与1，3
‑
丁二醇的料液比为1:40
‑
60，优选为1：50。
22.又一方面，本发明提供了上述组合物在制备抗炎、美白、抗氧化和/或调控抗菌肽的产品中的应用。
23.又一方面，本发明提供了一种抗炎、美白、抗氧化和/或调控抗菌肽的产品，所述的
产品包括上述组合物。
24.优选地，所述的产品为化妆品。
25.优选地，所述的化妆品包括但不限于护肤用的膏、霜、乳液、精华、隔离霜、隔离乳、bb霜、粉底、洗发水、护发素或爽肤水。
26.又一方面，本发明提供了上述组合物在抗炎、美白、抗氧化和/或调控抗菌肽中的应用。
27.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
28.1.本发明公开的抗炎组合物的原料是天然药用植物成分，且都是经过多年临床验证的天然药用植物，生物安全性高，环境友好。
29.2.本发明通过细胞实验对大量天然药用植物提取物进行筛选后，确定了雪莲、五味子两种天然药用植物成分均有具有抑制炎症因子前列腺素e2(pge
‑
2)和调控抗菌肽ll
‑
37的作用，通过合理配比，可协同增强抗炎及调控抗菌肽、抗氧化和美白的作用，优于二者单独抗炎和调控抗菌肽、抗氧化和美白的效果。
30.3.本发明通过细胞实验对大量天然药用植物提取物进行筛选后，还确定了白藜芦醇具有抑制炎症因子前列腺素e2(pge
‑
2)和调控抗菌肽ll
‑
37的作用，将白藜芦醇与上述组合物进行合理复配，可进一步协同发挥抗炎及调控抗菌肽、抗氧化和美白的作用。
附图说明
31.图1为实施例1
‑
5，对比例1
‑
4对pge
‑
2分泌的影响。
32.图2为实施例1
‑
5，对比例1
‑
4对抗菌肽ll
‑
37的调控。
33.图3为实施例6
‑
10，对比例5
‑
8对pge
‑
2分泌的影响。
34.图4为实施例6
‑
10，对比例5
‑
8对抗菌肽ll
‑
37的调控。
具体实施方式
35.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
36.在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
37.当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。
38.值得说明的是，本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定，部分原料和检测试剂盒来源如表1所示。
39.表1
40.原料厂家货号五味子北京同仁堂无
天山雪莲细胞培养物安赛博无白藜芦醇biotopped501
‑
36
‑
09pge
‑
2elisa试剂盒biotechwelleh0424ll
‑
37elisa试剂盒cusabiob04030098粉防己提取物浙江湖州佳美生物化学制品有限公司20210722l
‑
酪氨酸北京百灵威科技有限公司185061蘑菇酪氨酸酶jsenb9002
‑
10
‑
2维生素c北京百灵威科技有限公司231406
41.基础实施例
42.一种抗炎和/或美白组合物，包括以下原料：天山雪莲细胞培养物和五味子；
43.优选地，上述组合物中所述的天山雪莲细胞培养物、五味子的质量比为1:3
‑
4:1，进一步优选地，质量比为1:1。
44.本发明还公开了一种上述抗炎组合物的制备方法，包括以下步骤：
45.s1、将天山雪莲细胞培养物、五味子和1，3
‑
丁二醇混合后，热回流提取，精滤，收集滤液，得到提取液；
46.s2、将s1步骤得到的提取液加入白藜芦醇，即得到所述组合物。
47.实施例1
‑
5一种抗炎组合物及其制备方法
48.实施例1
‑
5中所述的抗炎组合物原料及用量如表2所示
49.表2
[0050] 实施例1实施例2实施例3实施例4实施例5天山雪莲细胞培养物/g2.5567.58五味子/g7.5542.52
[0051]
制备方法为：包括以下步骤：
[0052]
s1、称取天山雪莲细胞培养物和五味子，按照料液比雪莲五味子：30％1，3
‑
丁二醇＝1:50，加入30％1，3
‑
丁二醇；
[0053]
s2、100℃热回流2.5h，冷却后用0.45μm滤板抽滤；
[0054]
s3、复配0.2％白藜芦醇，即得到上述组合物。
[0055]
对比例1
[0056]
本对比例与实施例2的不同在于：所述抗炎组合物的原料包括10g天山雪莲细胞培养物，不包括五味子。
[0057]
对比例2
[0058]
本对比例与实施例2的不同在于：所述抗炎组合物的原料包括10g五味子，不包括天山雪莲细胞培养物。
[0059]
对比例3
[0060]
本对比例与实施例1的不同在于：所述抗炎的组合物的原料包括2g天山雪莲细胞培养物，8g五味子。
[0061]
对比例4
[0062]
本对比例与实施例3的不同在于：所述抗炎组合物的原料包括8.75g天山雪莲细胞培养物，1.25g五味子。
[0063]
效果评价
[0064]
1.检测组合物对pge
‑
2分泌的影响及调控抗菌肽ll
‑
37的能力。
[0065]
(1)检测方法：
[0066]
s1、将实施例1
‑
5和对比例1
‑
4分别过滤膜后，分别用mem培养基配制为5％、2.5％、1％、0.5％浓度的样品；
[0067]
s2、接种：按6
×
105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％co2)中孵育过夜；
[0068]
s3、uvb辐照：待6孔板中细胞铺板率达到80％～90％时，弃掉培养液，并在每孔加入1ml pbs溶液，清洗细胞，重复清洗2次。再加适量的pbs覆盖细胞，进行uvb辐射，辐射剂量为100mj/cm2；
[0069]
s4、给药：实验设置空白组、uvb组、样品组，空白组无uvb照射，接入2ml培养基；uvb组进行uvb照射后，接入2ml培养基；药物组进行uvb照射后，接入2ml不同浓度样品培养基，37℃，5％co2培养箱继续培养24h；
[0070]
s5、收集上清液：培养24h后，收集细胞培养上清液于ep管中，置于
‑
80℃冰箱冷冻保存；
[0071]
s6、pge
‑
2含量检测：根据pge
‑
2elisa试剂盒操作说明书对细胞样品进行检测；
[0072]
s7、ll
‑
37含量检测：根据ll
‑
37elisa试剂盒操作说明书对细胞样品进行检测；
[0073]
s8、结果统计分析：测试结果采用graphpad prism program软件作图，样品组与阴性对照组比较，采用spss统计分析，p<0.05(*)表示差异显著，p<0.01(**)表示差异极显著。
[0074]
(2)检测结果：结果如表3
‑
4所示。
[0075]
表3影响pge
‑
2分泌的检测结果
[0076]
[0077][0078]
表4调控抗菌肽ll
‑
37的检测结果
[0079]
[0080][0081]
抗菌肽依其结构可分为多种类型，其中cathelicidin和defensin为主要的类型，抗菌肽ll
‑
37是cathelicidin家族中唯一存在于人体皮肤中的抗菌肽。其不仅有杀菌作用，而且在免疫调节中炎症因子的释放和炎症性疾病的发生中也起着关键的作用。已有研究表明，ll
‑
37能抵抗uvb辐射hacat细胞引起的nf
‑
κb蛋白的表达及转录活性的增加，抑制促炎细胞因子pge
‑
2等的释放，从而抑制炎症反应。uvb辐射导致细胞产生炎症反应，抗菌肽ll
‑
37表达增多，抑制炎症因子pge
‑
2等的释放，从而抑制炎症反应，炎症反应降低后，同时抗菌肽ll
‑
37表达减少，调控至平衡状态，因此ll
‑
37的调控对抑制炎症反应有着重要的影响。
[0082]
2.检测组合物的抗氧化功效。
[0083]
(1)检测方法：
[0084]
s1、样品制备：称取20mgdpph，加入无水乙醇溶解并定容于250ml容量瓶中，dpph溶液浓度为2
×
10
‑4mol/l，0
‑
4℃下避光保存，现配现用，4h内有效；阳性对照选用维生素c，维生素浓度为1mg/ml；用无水乙醇将实施例1
‑
5和对比例1
‑
4配制成6个浓度，分别为100％、50％、10％、5％、1％和0.5％，作为待测样品。
[0085]
s2、取1ml的待测液与1ml dpph溶液混匀(a管)；取1ml的无水乙醇与1ml dpph溶液混匀(b管)；取1ml的无水乙醇与1ml的待测液混匀(c管)(如表5所示)；反应30min后，使用酶标仪(infinite m200 pro，tecan)在517nm下测a、b、c管吸光度值。
[0086]
表5
[0087]
编号dpph溶液无水乙醇待测液总体积a1.0ml\1.0ml2.0mlb1.0ml1.0ml\2.0mlc\1.0ml1.0ml2.0ml
[0088]
s3、数据处理：清除率(％)＝[(b+c)
‑
a]/b。
[0089]
(2)检测结果：结果如表6所示。
[0090]
表6 dpph清除率的检测结果
[0091]
[0092]
[0093][0094]
3.检测组合物的美白功效。
[0095]
(1)检测方法：
[0096]
s1、样品制备：称取45.30mg的l
‑
酪氨酸，溶解于50ml的pbs缓冲溶液中，配制成5mm l
‑
酪氨酸溶液，于4℃保存备用；将25ku蘑菇酪氨酸酶粉末完全溶解于2ml预冷的无菌pbs溶液中，以每管50μl分装，保存于
‑
20℃中，使用时，取一管50μl蘑菇酪氨酸酶溶液，加2.45ml pbs缓冲液，稀释至2.5ml使用，于4℃保存备用，且于24h内使用完；阳性对照选用维生素c，维生素c浓度为1mg/ml；将实施例1
‑
5和对比例1
‑
4用pbs溶液配制成5个浓度，分别为0.5％、1％、5％、10％和100％，作为待测样品。
[0097]
s2、将所用到的蘑菇酪氨酸酶、配好的待测样品、pbs、l
‑
酪氨酸溶液37℃摇床中预热10min；取20μl待测样品溶液和pbs溶剂分别加入96孔培养板中，再加入l
‑
酪氨酸(0.5mm)160μl，混合均匀后37℃恒温箱(kyc
‑
100b，上海福玛实验设备有限公司)保温；再加入37℃预热的250u/ml的蘑菇酪氨酸酶溶液20μl(终浓度为25u/ml)，混匀(试剂配比如表7所示)，立即用酶标仪(infinite m200 pro，tecan)测定490nm处的吸光度值a0、b0；测定完后置于37℃的恒温培养箱中反应30min，用酶标仪测定490nm处的吸光度值a30、b30。
[0098]
表7
[0099]
试剂a(样品组)b(溶剂组)l
‑
酪氨酸溶液(μl)160160待测样品或pbs溶剂(μl)2020蘑菇酪氨酸酶溶液(μl)2020
[0100]
s3、数据处理：
[0101]
(3)检测结果：结果如表8所示。
[0102]
表8酪氨酸酶抑制率检测结果
[0103]
[0104][0105]
上述检测结果表明，天山雪莲细胞培养物和五味子质量比在本发明保护范围内的实施例1
‑
5能显著抑制pge
‑
2的分泌，同时调控抗菌肽ll
‑
37的含量，使其恢复至平衡状态，其抗炎和调控抗菌肽的能力、抗氧化和美白的能力均优于对比例1
‑
2中的天山雪莲细胞培养物组合物和五味子组合物，证明两种天然药用植物原料按一定比例复配，可协同增强其抗炎和调控抗菌肽、抗氧化和美白的能力。而通过对比实施例1
‑
5和对比例3
‑
4的检测结果，证明天山雪莲细胞培养物和五味子质量比不在本发明保护范围内的抗炎组合物无法发挥上述协同增效作用。
[0106]
实施例6
‑
10一种抗炎组合物及其制备方法
[0107]
实施例6
‑
10中所述的抗炎组合物原料及用量如表9所示
[0108]
表9
[0109] 实施例6实施例7实施例8实施例9实施例10天山雪莲细胞培养物/g55555五味子/g55555白藜芦醇/％0.10.150.20.250.3
[0110]
制备方法为：包括以下步骤：
[0111]
s1、称取天山雪莲细胞培养物和五味子，按照料液比雪莲五味子：30％1，3
‑
丁二醇＝1:50，加入30％1，3
‑
丁二醇；
[0112]
s2、100℃热回流2.5h，冷却后用0.45μm滤板抽滤；
[0113]
s3、复配0.2％白藜芦醇，即得到上述组合物。
[0114]
对比例5
[0115]
本对比例与实施例8的不同在于：所述抗炎组合物的原料包括10g天山雪莲细胞培养物，不包括五味子。
[0116]
对比例6
[0117]
本对比例与实施例8的不同在于：所述抗炎组合物的原料包括10g五味子，不包括天山雪莲细胞培养物。
[0118]
对比例7
[0119]
本对比例与实施例8的不同在于：所述抗炎组合物的原料包括5g芍药，不包括天山雪莲细胞培养物。
[0120]
对比例8
[0121]
本对比例与实施例8的不同在于：所述抗炎组合物的原料包括5g黄芩，不包括五味子。
[0122]
效果评价
[0123]
1.检测组合物对pge
‑
2分泌的影响及调控抗菌肽ll
‑
37的能力。
[0124]
(1)检测方法
[0125]
与上述检测方法一致。
[0126]
(2)检测结果：结果如表10
‑
11所示
[0127]
表10影响pge
‑
2分泌的检测结果
[0128]
[0129][0130]
表11调控抗菌肽ll
‑
37的检测结果
[0131]
[0132][0133]
2.检测组合物的抗氧化功效。
[0134]
(1)检测方法
[0135]
与上述检测方法一致。
[0136]
(2)检测结果：结果如表12所示。
[0137]
表12 dpph清除率的检测结果
[0138]
[0139]
[0140][0141]
3.检测组合物的美白功效。
[0142]
(1)检测方法：
[0143]
与上述检测方法一致
[0144]
(2)检测结果：结果如表13所示。
[0145]
表13酪氨酸酶抑制率检测结果
[0146]
[0147][0148]
上述检测结果表明，天山雪莲细胞培养物、五味子和白藜芦醇的质量比在本发明保护范围内实施例6
‑
10能显著抑制pge
‑
2的分泌，同时调控抗菌肽ll
‑
37的含量，使其恢复至平衡状态，且抗炎和调控抗菌肽的效果、抗氧化和美白的效果均优于天山雪莲细胞培养物和五味子两者复配的组合物，通过对比实施例6
‑
10和实施例2的检测结果，证明三种天然药用植物原料按一定比例复配，可协同增强其抗炎和调控抗菌肽的能力、抗氧化和美白的能力。通过对比实施例8和对比例7
‑
8的检测结果，表明即使将其中一种原料换成同样重量份且具有抗炎抗菌功效的其他天然药用植物原料，其抗炎、抗氧化和美白效果显著降低，通过对比实施例6
‑
10和对比例5
‑
6的检测结果，表明特定质量比的天山雪莲细胞培养物、五味
子和白藜芦醇可发挥协同增效作用。
[0149]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。