大青木潜在抗奶牛乳房炎活性组分提取工艺的优化方法

1.本发明涉及大青木潜在抗奶牛乳房炎活性组分提取工艺的优化方法，属于大青木活性组分提取技术领域。


背景技术：

2.奶牛乳房炎是由细菌、病毒、机械损伤等因素引起的疾病，是造成奶牛养殖业巨大经济损失的常见病之一。临床治疗方面，主要以针对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、链球菌等病原菌的抗生素疗法为主。但抗生素的长期大量使用，不仅引起牛奶中抗生素残留问题，而且导致广泛耐药性的产生，严重危害公共卫生安全。植物中含有大量的活性物质，具有抗氧化、抗菌等功能，将其作为饲料添加剂使用，安全性高，毒副作用小。因此，从植物中寻求防治奶牛乳房炎的新型饲料添加剂，已成为当今畜牧养殖业研究的热点。
3.大青木(clerodendrum cyrtophyllum turcz.)为马鞭草科大青属植物，性凉、味苦，具有清热凉血、解毒利湿等功效，是贵州省黔东南苗族地区常使用的一味民族药。苗医常用其水煎液内服，治疗疱疹病毒感染和流行性感冒等。前期研究中课题组在大青木中分离得到一种潜在抗奶牛乳房炎活性组分—类叶升麻苷与木犀草苷，其中类叶升麻苷表现出较强的抗氧化活性，可对抗乳腺炎症反应而产生的过氧化物，进而缓解或阻止其炎症反应，达到修复乳腺细胞的作用；木犀草苷表现出较强的抗菌活性，可对病原菌起到直接杀灭作用，两者发生协同作用，进而达到抗奶牛乳房炎的效果。大青木中的类叶升麻苷与木犀草苷的相对含量较高，如果将其通过提取工艺优化富集，可能会成为一个有潜力的防治奶牛乳房炎的饲料添加剂。
4.鉴于此，优化大青木潜在抗奶牛乳房炎活性组分的提取工艺，提高大青木中类叶升麻苷与木犀草苷的获得率。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的是提供大青木潜在抗奶牛乳房炎活性组分提取工艺的优化方法，可以克服现有技术的不足。
6.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
7.与现有技术比较，本发明公开了大青木潜在抗奶牛乳房炎活性组分提取工艺的优化方法，它包括以下步骤：步骤1.以大青木粉末进行多个单因素提取试验，记录各个影响因素对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响；步骤2.根据单因素试验得到的对类叶升麻苷和木犀草苷得率结果；步骤3.从各个因素中随机选择三个因素为考察因素，进行响应面法中心组合试验，利用design-expert 10.0.4 软件进行3因素3水平的试验设计，重复选择不同组合的三个考察因素，获取不同组合下类叶升麻苷和木犀草苷得率的归一值(od)；步骤4.通过上述响应面法中心组合试验，以类叶升麻苷和木犀草苷得率的归一值(od)为评价指标，对大青木中类叶升麻苷和木犀草苷的提取条件进行优化，得大青木优化后的提取工艺。
8.上述影响因素包括粒度目数、乙醇浓度、料液比、提取次数、提取时间及提取温度。
9.上述大青木优化后的提取工艺为粒度目数100目、乙醇浓度62％、料液比1： 22、提取3次、提取时间1.5h、提取温度83℃。
10.上述的步骤3中，od计算公式为di＝(y
i-y
imin
)/(y
imax-y
imin
)，od＝(d1d2)
1/2
；
11.其中，yi表示第i个因素指标,y
imin
表示第i个因素指标的最小值，y
imax
表示第i个因素指标的最大值。
12.前述骤1中，提前以高效液相色谱法法测定大青木中类叶升麻苷和木犀草苷含量，以做对照组。
13.本发明的有益效果是：
14.1、本发明采用乙醇回流提取法对黔产大青木中潜在抗奶牛乳房炎活性组分—类叶升麻苷及木犀草苷的提取工艺进行考察，通过单因素试验及响应面优化后得到优化后的提取工艺条件为：粒度目数100目、乙醇浓度62％、料液比1：22、提取3次、每次提取1.5h、提取温度83℃。采用此方法提取大青木中类叶升麻苷与木犀草苷的得率分别稳定在9.62
±
0.09mg/g、2.25
±
0.02mg/g，提取效率高。此外，抗氧化试验中结果表明，大青木提取物对dpph自由基、abts自由基、羟自由基均表现出较好的清除能力。
15.本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
16.为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：
17.图1类叶升麻苷标准曲线。
18.图2木犀草苷标准曲线。
19.图3粒度目数对类叶升麻苷、木犀草苷得率的影响。
20.图4乙醇浓度对类叶升麻苷、木犀草苷得率的影响。
21.图5料液比对类叶升麻苷、木犀草苷得率的影响。
22.图6提取次数对类叶升麻苷、木犀草苷得率的影响。
23.图7提取时间对类叶升麻苷、木犀草苷得率的影响。
24.图8提取温度对类叶升麻苷、木犀草苷得率的影响。
25.图9提取温度和料液比对od值的影响。
26.图10提取温度和乙醇浓度对od值的影响。
27.图11料液比和乙醇浓度对od值的影响。
28.图12 dpph自由基清除率。
29.图13 abts自由基清除率。
30.图14羟自由基清除率。
具体实施方式
31.以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例
仅为了说明本发明，而不是为了限制本发明的保护范围。
32.实施例
33.本发明公开的大青木潜在抗奶牛乳房炎活性组分提取工艺的优化方法，其特征在于：它包括以下步骤：
34.步骤1.以大青木粉末进行多个单因素提取试验，记录各个影响因素对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响；
35.步骤2.根据单因素试验得到的对类叶升麻苷和木犀草苷得率结果；
36.步骤3.从各个因素中随机选择三个因素为考察因素，进行响应面法中心组合试验，利用design-expert 10.0.4软件进行3因素3水平的试验设计，重复选择不同组合的三个考察因素，获取不同组合下类叶升麻苷和木犀草苷得率的归一值(od)；
37.步骤4.通过上述响应面法中心组合试验，以类叶升麻苷和木犀草苷得率的归一值(od)为评价指标，对大青木中类叶升麻苷和木犀草苷的提取条件进行优化，得大青木优化后的提取工艺。
38.具体过程如下：
39.1材料与方法
40.1.1试验材料
41.大青木(clerodendron cyrtophyllum turcz.)采摘于贵州省贵定县云雾镇，经贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为马鞭草科大青属植物。
42.类叶升麻苷标准品购自于成都德思特生物技术有限公司，批号dstdl006101；木犀草
43.苷标准品购自于成都普菲德生物技术有限公司，批号20060301；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)、2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐 (abts)、抗坏血酸、水杨酸购自于合肥巴斯夫生物科技有限公司；甲醇、无水乙醇均为分析纯购自于成都市科隆化学品有限公司；乙腈、甲醇均为色谱纯购自于上海星可高纯溶剂有限公司；磷酸购自于重庆川东化工(集团)有限公司；过硫酸钾购自于天津市百世化工有限公司；硫酸亚铁购自于天津市永大化学试剂有限公司。
44.1.2试验仪器
45.uitimate 3000型高效液相色谱仪购自赛默飞世尔科技公司；dk-98
‑ⅱ
型电热恒温水浴锅购自天津市泰斯特仪器有限公司；uv-1900i紫外分光光度仪购自岛津公司；rotavapor r-3型数显旋转蒸发仪购自瑞士步琦有限公司；sk3300b 型超声波清洗器购自上海科导超声仪器有限公司；fw177型手提式高速粉碎机购自天津泰斯特仪器有限公司；fr124cn型分析天平购自奥豪斯仪器有限公司。
46.1.3试验方法
47.1.3.1 hplc法测定类叶升麻苷和木犀草苷含量
48.1.3.1.1色谱条件
49.syncronis c18色谱柱：(250
×
4.6mm，0.5μm)；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液＝20：80；流速：1.0ml/min；检测波长：332nm；进样体积：5μl。
50.1.3.1.2供试品溶液的制备
51.精密称取过80目筛的大青木粉末10g，置于500ml圆底烧瓶中，料液比1： 15，加入
70％乙醇，80℃水浴加热回流1次，提取1h，趁热过滤，合并滤液，浓缩得到大青木浸膏。精密称取大青木浸膏20mg超声溶于50％甲醇溶液中，配制成5.0mg/ml的溶液，用有机微孔滤膜(0.45μm)过滤，得到供试品溶液。
52.1.3.1.3混合对照品溶液的制备
53.精密称取类叶升麻苷、木犀草苷标准品各25.0mg，置于50ml容量瓶中，加50％甲醇溶液定容至刻度，混匀得到对照品溶液。
54.1.3.1.4线性关系的考察
55.分别精密吸取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml混合对照品溶液，置于10ml 容量瓶中，定容至刻度，即得0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml的混合标准品溶液，按照1.3.1.1色谱条件测定峰面积。以两种成分的浓度(c)为横坐标，对应的峰面积(a)作为纵坐标，绘制相对应的标准曲线。
56.1.3.2提取工艺考察
57.1.3.2.1单因素试验
58.(1)粒度目数对得率的影响
59.分别精密称取20、40、60、80、100目大青木粉末各10g，按料液比1：15，加入70％乙醇溶液，80℃加热回流提取1次，提取1h，考察不同粒度目数对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响。
60.(2)乙醇浓度对得率的影响
61.精密称取4份80目大青木粉末各10g，按料液比1：15，分别加入30％、 50％、70％、90％乙醇溶液，80℃加热回流提取1次，提取1h，考察不同乙醇浓度对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响。
62.(3)料液比对得率的影响
63.精密称取4份80目大青木粉末各10g，分别按料液比1：15、1：20、1： 25、1：30，加入70％乙醇溶液，80℃加热回流提取1次，提取1h，考察不同料液比对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响。
64.(4)提取次数对得率的影响
65.精密称取3份80目大青木粉末各10g，按料液比1：15，加入70％乙醇溶液，分别在80℃加热回流1、2、3次，每次提取1h，考察不同提取次数对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响。
66.(5)提取时间对得率的影响
67.精密称取5份80目大青木粉末各10g，按料液比1：15，加入70％乙醇溶液，80℃加热回流1次，分别提取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，考察不同提取时间对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响。
68.(6)提取温度对得率的影响
69.精密称取4份80目大青木粉末各10g，按料液比1：15，加入70％乙醇溶液，分别在75、80、85、90℃加热回流次，提取1h，考察不同提取温度对类叶升麻苷和木犀草苷得率的影响。
70.1.3.2.2响应面法优化大青木中类叶升麻苷和木犀草苷的提取工艺
71.根据单因素试验表明，并考虑各方面的试验情况，选取提取温度(a)、料液比(b)、
在测定波长处对照组的吸光度值。
85.2结果与分析
86.2.1 hplc法同时测定大青木提取物中类叶升麻苷和木犀草苷含量结果
87.2.1.1标准曲线的绘制
88.根据1.3.1中的方法建立标准曲线，确定回归方程如图1、2。类叶升麻苷线性回归方程：y＝139.0632x-0.1211，r2＝0.99954；木犀草苷线性回归方程：y＝194.4266x-0.4085，r2＝0.99993，结果表明类叶升麻苷和木犀草苷在 0.1～0.5mg/ml的范围内线性关系良好。
89.2.2提取工艺结果
90.2.2.1单因素试验结果
91.2.2.1.1粒度目数对得率的影响
92.由图3可知，随着粒度目数的增加，大青木提取物中类叶升麻苷和木犀草苷的得率均明显升高，在100目时，达到最大值，因此选择粒度目数为100目。
93.2.2.1.2乙醇浓度对得率的影响
94.由图4可知，乙醇浓度在30％～70％时，大青木提取物中类叶升麻苷和木犀草苷的得率随着乙醇浓度的增加而增加，在乙醇浓度为70％时，类叶升麻苷和木犀草苷的得率达到了最大值，随后类叶升麻苷和木犀草苷的得率随着乙醇浓度的增大而呈下降趋势，较高浓度的乙醇对类叶升麻苷和木犀草苷的提取起抑制作用，因此选择乙醇浓度为70％。
95.2.2.1.3料液比对得率的影响
96.由图5可知，随着料液比的增加，类叶升麻苷和木犀草苷的得率逐渐增大，在料液比为1：25时达到最大值，随后类叶升麻苷和木犀草苷的得率呈下降趋势，由于溶剂的量增加，在加热回流过程中，部分溶剂蒸发，消耗一定的热量，导致渗透到植物细胞中的溶剂不能充分汽化，不利于提取。因此，选择料液比为1： 25。
97.2.2.1.4提取次数对得率的影响
98.由图6可知，随着提取次数的增加，类叶升麻苷和木犀草苷的得率逐渐增加，在提取4次时，达到最大值，但是提取4次与提取3次相比，类叶升麻苷和木犀草苷的得率增幅较低，因此综合考虑提取效率及工业成本，选择提取次数为3 次。
99.2.2.1.5提取时间对得率的影响
100.由图7可知，随着提取时间的增加，类叶升麻苷和木犀草苷的得率增加，类叶升麻苷的得率在提取1.0h后，得率趋于平稳，木犀草苷的得率在提取1.5h 后，趋于平稳，综合考虑，选择提取时间为1.5h。
101.2.2.1.6提取温度对得率的影响
102.由图8可知，随着提取温度的增加，类叶升麻苷和木犀草苷的得率增加，在 80℃时达到最大值，在达到80℃之后，两者得率分别呈下降趋势，由于温度过低提取不完全，温度过高时会影响类叶升麻苷和木犀草苷的稳定性，导致结构发生变化，因此选择提取温度为80℃。
103.2.2.2响应面优化试验设计与结果
104.根据box-behnken中心组合试验设计原理及单因素试验结果，筛选出对于类叶升麻苷、木犀草苷得率影响较大的3个因素：提取温度(a)、料液比(b)、乙醇浓度(c)为基础，设
计三因素三水平响应面分析试验。试验因素和水平设计见表1，响应面试验设计方案及结果见表2。
105.表2提取工艺响应面试验设计方案与结果
[0106][0107][0108]
采用design-expert 10.0.4软件对试验结果进行方差分析，得到回归模型方差结果，见表3，同时多项式回归拟合，建立响应面回归模型：
[0109]
od＝0.90+0.22a-0.045b+0.038c-2.500e-003ab+0.012ac-0.023bc-0.30a
2-0.25b
2-0.34 c2。
[0110]
表3二元多次回归拟合box-behnken试验设计的方差分析结果
[0111][0112]
注：p《0.05为差异显著，以*表示；p《0.01为差异极显著，以**表示。
[0113]
由表3可知，该回归方程的模型拟合相关系数r2＝0.9817，r
2adj
＝0.9581，说明该模型可信度良好；该模型f＝41.65，且p《0.0001，模型差异极显著，方程与实际的拟合情况相符；失拟项p＝0.5588，无显著性，并且未知因素对试验结果有较小干扰，表明该响应曲面设计试验拟合回归方程具有显著意义，模型预测性较好。根据拟合回归方程各项方差数据可知，表中方程一次项系数a达到极显著水平，二次项系数a2、b2、c2均达到极显著水平，其他均无显著性。根据a、b、 c三种单因素的f值90.23、3.61、2.51可知，单因素对od值的影响程度为a》 b》c。
[0114]
根据二次多项方程式，用design-expert 10.0.4做出各因素相互作用对od 值影响的三维曲面图和二维等高线图，见图9-11。
[0115]
由图9-11可以看出，响应面起伏明显，各因素之间交互作用对od值影响较为明显；随着提取温度的增加，od值也在增加，但当提取温度增加到一定程度后， od值随之下降；随着料液比的增加，od值增加，当料液比增加到一定比例之后， od值下降；随着乙醇浓度的增加，od值先增加之后下降。由响应曲面的陡峭程度可知，提取温度对od值影响非常显著。
[0116]
2.2.3优化后的提取工艺确定及验证试验
[0117]
通过对拟合的线性回归方程进行层次的分析，软件分析给出优化后的提取参数，即提取温度83.81℃、料液比1：21.78、乙醇浓度61.97％，在此条件下，类叶升麻苷、木犀草苷得率的预测值为9.63mg/g、2.26mg/g。结合实际试验，设置实际提取工艺参数为粒度目数100目、乙醇浓度62％、料液比1：22、提取次数3次、提取时间1.5h、提取温度83℃，进行提取工艺试验(n＝3),实际测得类叶升麻苷与木犀草苷得率分别为9.62mg/g、2.25mg/g，这与理论预测值差异无显著性(p》0.05)。
[0118]
2.2.4大青木提取物抗氧化活性比较
[0119]
2.2.4.1 dpph自由基清除能力
[0120]
由图12可知，随着大青木提取物浓度从5μg/ml升高到100μg/ml，对 dpph自由基的清除率逐渐增加。当大青木提取物浓度为100μg/ml时，对dpph 自由基清除率为65.80％，表明大青木提取物对dpph自由基有一定的清除作用。
[0121]
2.2.4.2 abts自由基清除能力
[0122]
由图13可知，随着大青木提取物浓度从5μg/ml升高到100μg/ml，对abts自由基的清除率逐渐增加。当大青木提取物浓度为100μg/ml时，对abts 自由基清除率为65.36％，表明大青木提取物对abts自由基有一定的清除作用。
[0123]
2.2.4.3羟自由基清除能力
[0124]
由图14可知，随着大青木提取物浓度从5μg/ml升高到100μg/ml，对羟自由基的清除率逐渐增加。当大青木提取物浓度为100μg/ml时，对羟自由基清除率为51.51％，表明大青木提取物对羟自由基有一定的清除作用。
[0125]
3结论
[0126]
本研究采用乙醇回流提取法对黔产大青木中潜在抗奶牛乳房炎活性组分—类叶升麻苷及木犀草苷的提取工艺进行考察，通过单因素试验及响应面优化后得到优化后的提取工艺条件为：粒度目数100目、乙醇浓度62％、料液比1：22、提取3次、每次提取1.5h、提取温度83℃。采用此方法提取大青木中类叶升麻苷与木犀草苷的得率分别稳定在9.62
±
0.09mg/g、2.25
±
0.02mg/g，提取效率高。此外，抗氧化试验中结果表明，大青木提取物对dpph自由基、abts自由基、羟自由基均表现出较好的清除能力。
[0127]
此研究仅对提取工艺进行了优化，得到的样品为粗提物，下一步还要继续研究大青木提取物的纯化工艺，提高其类叶升麻苷及木犀草苷相对含量，为大青木抗奶牛乳房炎饲料添加剂的临床使用提供物质基础。
[0128]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式保密的限制，任何未脱离本发明技术方案内容、依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。