天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用、天麻钩藤饮提取物的制备方法

1.本发明涉及中药提取物技术领域，尤其涉及天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用、天麻钩藤饮提取物的制备方法。


背景技术：

2.天麻钩藤饮出自《杂病证治新义》，由天麻、钩藤、石决明、栀子、黄芩、牛膝、杜仲、坤草、桑寄生、夜交藤和茯神组成，功能平肝熄风，清热安神。本为主治肝风上扰之头疼、眩晕、失眠之品。天麻钩藤饮的传统煎煮工艺对治疗高血压有很好的效果。在已发表的文献中，虽然公开了天麻钩藤饮的提取，但是多专注于天麻素和多糖的提取工艺优化，得到的天麻素和多糖也是用于防治高血压。


技术实现要素：

3.有鉴于此，本发明的目的在于提供天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用、天麻钩藤饮提取物的制备方法。本发明将天麻钩藤饮用于祛风除湿、止脱健发。
4.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
5.本发明提供了天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用，所述天麻钩藤饮为含有质量比为9：12：18：9：9：9：9：9：9：9：12的天麻、钩藤、石决明、山栀、黄芩、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、硃茯神和川牛膝的中药组合物。
6.优选地，所述天麻钩藤饮以天麻钩藤饮提取物的形式使用。
7.优选地，所述天麻钩藤饮提取物的制备方法包括以下步骤：
8.将天麻钩藤饮和乙醇溶液混合，依次进行浸提和第一超声提取，得到初提液和初提渣；
9.所述初提渣和乙醇溶液混合，进行第二超声提取，得到第二滤液和第二滤渣；
10.将所述第二滤渣进行水提，得到水提液；
11.将所述初提液、第二滤液和水提液分别浓缩后混合，进行冷冻干燥，得到所述天麻钩藤饮提取物。
12.优选地，所述乙醇溶液的体积浓度为90％。
13.优选地，所述天麻钩藤饮和乙醇溶液混合时，所述天麻钩藤饮和乙醇溶液的用量比为1g：(15～21)ml。
14.优选地，所述浸提的时间为10～14h；所述第一超声提取的频率70～85khz，所述第一超声提取的时间为30～60min。
15.优选地，所述初提渣和乙醇溶液混合时，所述初提渣和乙醇溶液的用量比为1g：(18～21)ml；所述第二超声提取的功率为70～85khz，时间为1～2h。
16.优选地，所述水提时，所述第二滤渣和水的用量比为1g：20ml；所述水提的温度为50～60℃，时间为2～3h。
17.优选地，所述冷冻干燥包括依次进行冷冻和干燥；所述冷冻的温度为-80℃，时间为48h，压强为146mbr；所述干燥的温度为-43℃，时间为36～48h。
18.本发明提供了一种天麻钩藤饮提取物的制备方法，包括以下步骤：
19.将天麻钩藤饮和乙醇溶液混合，依次进行浸提和第一超声提取，得到初提液和初提渣；
20.所述初提渣和乙醇溶液混合，进行第二超声提取，得到第二滤液和第二滤渣；
21.将所述第二滤渣进行水提，得到水提液；
22.将所述初提液、第二滤液和水提液分别浓缩后混合，进行冷冻干燥，得到所述天麻钩藤饮提取物。
23.本发明提供了天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用，所述天麻钩藤饮为含有质量比为9：12：18：9：9：9：9：9：9：9：12的天麻、钩藤、石决明、山栀、黄芩、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、硃茯神和川牛膝的中药组合物。本发明中，天麻钩藤饮中的天麻甘平质润，专入肝经，《本经》谓“久服益气力，长阴肥健”，功在平肝熄风，有“定风草”之名。钩藤甘而微寒，归肝与心包，主熄风止痉，平肝熄风。二者共奏祛风除湿、止脱健发之功。
24.本发明还提供了一种天麻钩藤饮提取物的制备方法，包括以下步骤：将天麻钩藤饮和乙醇溶液混合，依次进行浸提和第一超声提取，得到初提液和初提渣；所述初提渣和乙醇溶液混合，进行第二超声提取，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第二滤渣进行水提，得到水提液；将所述初提液、第二滤液和水提液分别浓缩后混合，进行冷冻干燥，得到所述天麻钩藤饮提取物。本发明提供的制备方法，对天麻钩藤饮提取物的提取率为17～21％；同时，得到的天麻钩藤饮提取物能够有效防治脂溢性脱发。
附图说明
25.图1为小鼠的毛发生长结果图；
26.图2为小鼠毛发的评分标准；
27.图3为图1中小鼠的毛发统计结果图；
28.图4为各组小鼠背部皮肤真皮毛囊横断面的he染色(100
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)，其中，a：对照组；b：双氢睾酮组(dht，0.5mg/只/天)；c：阳性药5％的米诺地尔组；d：实施例1所得天麻钩藤饮提取物低剂量处理组(ltgy，1mg/只/天)；e：实施例1所得天麻钩藤饮提取物高剂量处理组(htgy，5mg/只/天)；f：ltgy+dht处理组；g：htgy+dht处理组。
具体实施方式
29.本发明提供了天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用，所述天麻钩藤饮含有质量比为9：12：18：9：9：9：9：9：9：9：12的天麻、钩藤、石决明、山栀、黄芩、杜仲、益母草、桑寄生、夜交藤、硃茯神和川牛膝的中药组合物。
30.在本发明中，天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用包括天麻钩藤饮在预防脂溢性脱发中的应用和天麻钩藤饮在治疗脂溢性脱发中的应用。
31.在本发明中，如无特殊说明，本发明所用原料均优选为市售产品。
32.在本发明中，所述天麻钩藤饮优选以天麻钩藤饮提取物的形式使用。
33.在本发明中，所述天麻钩藤饮提取物的制备方法优选包括以下步骤：
34.将天麻钩藤饮和乙醇溶液混合，依次进行浸提和第一超声提取，得到初提液和初提渣；
35.所述初提渣和乙醇溶液混合，进行第二超声提取，得到第二滤液和第二滤渣；
36.将所述第二滤渣进行水提，得到水提液；
37.将所述初提液、第二滤液和水提液分别浓缩后混合，进行冷冻干燥，得到所述天麻钩藤饮提取物。
38.本发明将天麻钩藤饮和乙醇溶液混合，依次进行浸提和第一超声提取，得到初提液和初提渣。
39.在本发明中，所述乙醇溶液的体积浓度优选为90％；所述天麻钩藤饮和乙醇溶液混合时，所述天麻钩藤饮和乙醇溶液的用量比优选为1g：(15～21)ml，进一步优选为1g：20ml。
40.在本发明中，所述浸提的温度优选为室温，即既不需要额外加热也不需要额外降温。在本发明中，所述浸提的时间优选为10～14h，进一步优选为12h。
41.在本发明中，所述第一超声提取的频率优选为70～85khz，进一步优选为75～80khz；所述第一超声提取的温度优选为20～35℃，进一步优选为25～30℃；所述第一超声提取的时间优选为30～60min。
42.所述第一超声提取后，本发明优选还包括将所得第一超声提取体系进行固液分离，得到初提液和初提渣。
43.在本发明中，所述固液分离的方式优选为离心，本发明对所述离心的转速和时间不做具体限定，只要能够使固液分离即可。
44.得到初提渣后，本发明将所述初提渣和乙醇溶液混合，进行第二超声提取，得到第二滤液和第二滤渣。
45.在本发明中，所述乙醇溶液的体积浓度优选为90％；所述初提渣和乙醇溶液混合时，所述初提渣和乙醇溶液的用量比优选为1g：(18～21)ml，进一步优选为1g：(19～20)ml。在本发明中，所述第二超声提取的功率优选为70～85khz，进一步优选为75～80khz；所述第二超声提取的时间优选为1～2h。
46.所述第二超声提取后，本发明优选还包括将所得第二超声提取体系进行固液分离，得到第二滤液和第二滤渣。
47.本发明对所述固液分离的方式不做具体限定，只要能够实现固液分离即可。
48.得到第二滤渣后，本发明将所述第二滤渣进行水提，得到水提液。
49.在本发明中，所述水提时，所述第二滤渣和水的用量比优选为1g：20ml；所述水提的温度优选为50～60℃，进一步优选为55℃；所述水提的时间优选为2～3h。
50.所述水提后，本发明优选还包括将所得水提体系进行固液分离，得到水提液和废渣。本发明对所述固液分离的方式不做具体限定，只要能够实现固液分离即可。
51.得到初提液、第二滤液和水提液后，本发明将初提液、第二滤液和水提液分别浓缩后混合，进行冷冻干燥，得到所述天麻钩藤饮提取物。
52.在本发明中，所述初提液的浓缩的方式为旋转蒸发，所述旋转蒸发的温度优选为40～50℃，转速优选为109r/min；本发明对所述旋转蒸发的时间不做具体限定，只要浓缩至原液体积的0.5～1.0％即可。
53.在本发明中，所述第二滤液的浓缩方式优选为旋转蒸发，所述第二滤液的旋转蒸发的参数与初提液的旋转蒸发参数一致，只要浓缩至原液体积的0.4～1.0％即可。
54.在本发明中，所述水提液的浓缩的方式优选为旋转蒸发，所述水提液的旋转蒸发的参数与所述初提液的旋转蒸发参数一致，只要浓缩至原液体积的4.5～5％即可。
55.在本发明中，所述冷冻干燥优选包括依次进行冷冻和干燥；所述冷冻的温度优选为-80℃，压强优选为146mbr，时间优选为48h；所述干燥的温度优选为-43℃，时间优选为36～48h。
56.本发明中，天麻钩藤饮中的天麻甘平质润，专入肝经，《本经》谓“久服益气力，长阴肥健”，功在平肝熄风，有“定风草”之名。钩藤甘而微寒，归肝与心包，主熄风止痉，平肝熄风。二者共奏祛风除湿、止脱健发之功。
57.本发明还提供了一种天麻钩藤饮提取物的制备方法，包括以下步骤：
58.将天麻钩藤饮和乙醇溶液混合，依次进行浸提和第一超声提取，得到初提液和初提渣；
59.所述初提渣和乙醇溶液混合，进行第二超声提取，得到第二滤液和第二滤渣；
60.将所述第二滤渣进行水提，得到水提液；
61.将所述初提液、第二滤液和水提液分别浓缩后混合，进行冷冻干燥，得到所述天麻钩藤饮提取物。
62.在本发明中，所述天麻钩藤饮提取物的制备方法的参数优选与上述技术方案一致，在此不再赘述。
63.本发明提供的天麻钩藤饮提取物的制备方法，经浸提、第一超声提取、第二超声提取和水提，获得了17～21％的提取率；且所得天麻钩藤饮提取物具有优异的防治脂溢性脱发的功效。
64.下面结合实施例对本发明提供的天麻钩藤饮在防治脂溢性脱发中的应用、天麻钩藤饮提取物的制备方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
65.实施例1
66.称量天麻(9g)、钩藤(12g)、石决明(18g)、山栀(9g)、黄芩(9g)、杜仲(9g)、益母草(9g)、桑寄生(9g)、夜交藤(9g)、硃茯神(9g)和川牛膝(12g)，将上述混合物和体积浓度为90％的乙醇溶液按照1g：20ml的比例混合，于室温浸提12h；然后于室温、80khz下进行第一超声提取30min，经离心，得到初提液和初提渣；将所述初提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的0.5％，得到初提物；
67.将所述初提渣和体积浓度为90％的乙醇溶液按1g：20ml的比例混合，于室温、80khz下进行第二超声提取1h，经过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第二滤液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的0.4％，得到第二提取物；
68.将第二滤渣和水按照1g：20ml的比例混合，于50～60℃下水提3h，经离心，得到水提液；所述水提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的5％，得到水提取物；
69.将所述初提物、第二提取物和水提取物混合，于-80℃、146mbr下冷冻，时间为48h；再在-43℃下干燥48h，得到23.94g天麻钩藤饮提取物，收率为21％。
70.实施例2
71.重复实施例1中的提取操作多次，得到天麻钩藤饮提取物，提取率为17～21％。
72.对比例1
73.称量天麻(9g)、钩藤(12g)、石决明(18g)、山栀(9g)、黄芩(9g)、杜仲(9g)、益母草(9g)、桑寄生(9g)、夜交藤(9g)、硃茯神(9g)和川牛膝(12g)，将上述混合物和体积浓度为95％的乙醇溶液按照1g：20ml的比例混合，于室温下浸提12h，经离心，得到浸提液和浸提渣；将所述浸提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的0.5％，得到浸提物；
74.浸提渣和水按照1g：20ml比例混合，于50～60℃下水提3h，经离心，得到水提液；所述水提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的5％，得到水提物；
75.将浸提物和水提物混合，于-80℃、146mbr下冷冻，时间为48h；再在-43℃下干燥48h，得到5.7g天麻钩藤饮提取物，提取率为5％。
76.对比例2
77.称量天麻(9g)、钩藤(12g)、石决明(18g)、山栀(9g)、黄芩(9g)、杜仲(9g)、益母草(9g)、桑寄生(9g)、夜交藤(9g)、硃茯神(9g)和川牛膝(12g)，将上述混合物和体积浓度为90％的乙醇溶液按照1g：20ml的比例混合，于室温下浸提12h，经离心，得到浸提液和浸提渣；将所述浸提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的0.5％，得到浸提物；
78.浸提渣和水按照1g：20ml比例混合，于50～60℃下水提3h，经离心，得到水提液；所述水提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的5％，得到水提物；
79.将浸提物和水提物混合，于-80℃、146mbr下冷冻，时间为48h；再在-43℃下干燥48h，得到9.12g天麻钩藤饮提取物，提取率为8％。
80.对比例3
81.称量天麻(9g)、钩藤(12g)、石决明(18g)、山栀(9g)、黄芩(9g)、杜仲(9g)、益母草(9g)、桑寄生(9g)、夜交藤(9g)、硃茯神(9g)和川牛膝(12g)，将上述混合物和体积浓度为75％的乙醇溶液按照1g：20ml的比例混合，于室温下浸提12h，经离心，得到初提液和初提渣；将所述初提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的0.5％，得到初提物；
82.将所述初提渣和体积浓度为75％的乙醇溶液按1g：20ml的比例混合，于室温、80khz下进行第二超声提取2h，经过滤，得到第二滤液和第二滤渣；将所述第二滤液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的0.4％，得到第二提取物；
83.将第二滤渣和水按照1g：20ml的比例混合，于50～60℃下水提3h，经离心，得到水提液；所述水提液在40～50℃、109r/min下旋转蒸发浓缩至原液体积的5％，得到水提物；
84.将所述初提物、第二提取物和水提物混合，于-80℃、146mbr下冷冻，时间为48h；再在-43℃下干燥48h，得到9.12g天麻钩藤饮提取物，提取率为8％。
85.一、治疗脂溶性脱发性能测试
86.6周龄雄性c57bl/6j小鼠，在正常饲养情况下适应环境1周，检查皮肤颜色、是否有伤痕，取皮肤处于休止期且皮肤无损伤的小鼠开始脱毛，在实验动物背部制造面积约为3cm
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5cm的无毛区域。分为7组，每组10只。
87.a组：对照组；b组：双氢睾酮组(dht，0.5mg/只/天)；c组：阳性药5％的米诺地尔组；d组：实施例1所得天麻钩藤饮提取物低剂量处理组(ltgy，1mg/只/天)；e组：实施例1所得天麻钩藤饮提取物高剂量处理组(htgy，5mg/只/天)；f组：ltgy+dht处理组；g组：htgy+dht处理组。采用背部涂抹给药方法，每天早9点给药，连续14天给药。
88.每天观察各组小鼠脱毛部位皮肤及毛发生长状况，并记录每只小鼠脱毛区皮肤颜色由粉红变成黑色的时间及开始长毛发的时间，评价药物对小鼠毛发生长周期的影响。给药0、7、10、14天时对每组拍照，结果如图1所示；按照图2给出的评分标准，对毛发生长情况进行评分并记录，结果如图3所示。
89.图2中的评分标准：0分：未生长，脱毛区皮肤呈粉色；1分：脱毛区皮肤呈灰色(《20％的增长)；2分：脱毛区皮肤呈黑色(》20％且《40％)；3分：脱毛区皮肤呈黑色并有少许毛发生长(》40％且《60％的生长)；4分：脱毛区皮肤呈黑色并有部分毛发生长(60％～80％的生长)；5分：脱毛区毛发基本完全生长(80％～100％的生长)。
90.从图1和3可以看出：dht组在给药14天后皮肤依旧处于休止期说明造模成功，在天麻钩藤饮提取物给药组中，高剂量组能够有效的逆转aga模型的毛发生长处于休止期，从而进入生长期。从而证实了天麻钩藤饮可用于治疗雄激素性脱发。
91.二、组织学检测
92.对不同处理后所得小鼠的组织进行染色，观察小鼠背部皮肤真皮下部毛囊数量。步骤包括：
93.2.1取材
94.各组小鼠于给药第14天后，2％的戊巴比妥钠以0.1ml/10g体质量腹腔注射麻醉，脱颈处死，刮取毛后，在给药部位平行于脊椎处取材，将皮肤修剪成1cm宽的长条状，置4％的多聚甲醛中固定24～36h。
95.2.2he染色
96.(1)取材后，用pbs清洗，采用4％多聚甲醛固定。
97.(2)脱水：将组织浸泡在体积浓度为75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇i、95％乙醇ii、无水乙醇i和无水乙醇ii中，各10min。
98.(3)透明：将脱水后的组织分别浸泡在二甲苯i和二甲苯ii中各10min。
99.(4)透蜡：将透明处理过的组织浸泡于融化的石蜡中3h。
100.(5)包埋。
101.(6)切片：使用切片机将组织切成5μm厚度的组织片，使其紧贴载玻片上。
102.(7)烤片：将切片放置于65℃烘箱中上。
103.(8)脱蜡复水：二甲苯i、二甲苯ii各10min，无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、蒸馏水各2min。
104.(9)苏木素染色：苏木精染料10min，流水冲洗3s，镜检，若苏木素着色过深可用l％盐酸酒精进行分脱色3s，脱去细胞质中多余的苏木素染色液，然后自来水3min。
105.(10)伊红染液染色：染色2min、95％乙醇脱水5min、二甲苯10min。
106.(11)封片：中性树脂封片。
107.(12)镜检：细胞核蓝色、细胞质红色。
108.所得结果如图4所示。图4为小鼠背部皮肤真皮毛囊横断面图，其中，a：对照组；b：双氢睾酮组(dht，0.5mg/只/天)；c：阳性药5％的米诺地尔组；d：实施例1所得天麻钩藤饮提取物低剂量处理组(ltgy，1mg/只/天)；e：实施例1所得天麻钩藤饮提取物高剂量处理组(htgy，5mg/只/天)；f：ltgy+dht处理组；g：htgy+dht处理组。
109.从图4可以看出：dht造模组总毛囊数量较对照组明显减少，说明造模成功；5％米
诺地尔组、ltgy组、htgy组较对照组总毛囊增加，同时htgy组的总毛囊数量明显多于对照组，其数量甚至高于阳性药5％的米诺地尔组，说明小鼠背部皮肤毛囊数量随着天麻钩藤饮浓度的增加而增加且天麻钩藤饮有很好的促进毛囊生长的作用；ltgy+dht组和htgy+dht组较dht组相比，其毛囊数量明显增高，且随着浓度的升高毛囊数量明显增加，表明天麻钩藤饮可以通过抑制dht的作用从而发挥治疗雄激素性脱发的目的，且高剂量浓度治疗的效果甚至优于5％的米诺地尔。
110.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。