没食子酸在制备大肠杆菌性腹泻病防治药物中的应用

1.本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及没食子酸或其药学上可接受的酯或盐在制备大肠杆菌性腹泻病防治药物中的应用。


背景技术：

2.奶牛腹泻是由多种因素引发的一类疾病，其诱因主要包括大肠杆菌、轮状病毒、冠状病毒和隐孢子虫等病原微生物，以及营养、环境和饲养管理等外界因素，其中腹泻性大肠杆菌(diarrheagenic e.coli，dec)引起的腹泻病的发病率和死亡率较高，其感染在奶牛中十分普遍，严重危害奶牛养殖业的发展。牛群感染dec后，主要表现为腹泻、毒血症和结肠炎等临床症状，并能导致继发感染，引起生长迟缓和发育不良。细菌携带的高致病性质粒或毒力基因往往能够编码特定的黏附素、毒素和铁载体等，导致集体免疫系统失衡，尤其dec感染引起的炎症反应是结肠损伤的关键因素。由于发病机制还不清楚，目前临床上仍无有效的预防和治疗措施。因此，寻求针对奶牛大肠杆菌性腹泻病更为有效、安全的防治措施一直是该领域的研究热点。
3.没食子酸(gallic acid)化学名称为3,4,5-三羟基苯甲酸，是一种天然存在的多酚类有机酸，是传统中药五倍子的重要组成部分(含量高达50％～70％)，广泛存在于山茱萸和掌叶大黄等植物中，在中医临床上具有重要地位，其药用功效记载于《本草纲目》中。没食子酸具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒和抗氧化等生物学功效，具有极低的毒性和良好的安全性，临床上具有收敛、止血、降血糖和止泻作用。
4.临床大肠杆菌性腹泻病是一种严重危害奶牛健康的消化系统疾病，由于致病机制还不清晰，临床治疗往往以对症治疗为主，包括抗生素、营养支持、益生素或益生菌添加剂等。如果采用传统抗生素药物进行临床治疗，很容易出现多重耐药性和药物残留等问题，影响药物治疗效果，尤其是携带bla
ctx-m
基因产超广谱β-内酰胺酶 (esbl)的dec菌株的广泛流行。因此，开发一种安全高效的抗菌素替代物或方法来防治奶牛大肠杆菌性腹泻病，改善奶牛肠道健康，已成为亟待解决的技术问题。
5.目前研究表明结肠炎和奶牛大肠杆菌性腹泻病的发生和发展密切相关。大肠杆菌性腹泻病患牛往往伴有严重的结肠炎症反应，同时dec可以很好地在结肠中定殖，表明结肠炎症反应和细菌定殖在奶牛大肠杆菌性腹泻病的发生和发展中发挥着重要作用。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供没食子酸在制备大肠杆菌性腹泻病防治药物中的应用。
7.本发明根据没食子酸的药学性质以及奶牛大肠杆菌性腹泻病的发病特点，即没食子酸具有抑菌作用，并能缓解结肠炎症反应，对没食子酸在奶牛大肠杆菌性腹泻病可能发挥重要缓解作用进行了验证，并在充分了解没食子酸和奶牛大肠杆菌性腹泻病的相关特性，评估实验设计的安全性和可行性的基础上，以奶牛大肠杆菌性腹泻病为主要研究对象，解析没食子酸的作用机制。本发明通过建立细胞模型和奶牛大肠杆菌性腹泻病小鼠模型来
探索新的精准高效的治疗措施，评估没食子酸对奶牛大肠杆菌性腹泻病模型的干预作用，进一步验证了没食子酸在治疗奶牛大肠杆菌性腹泻病中的重要作用。
8.为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在制备大肠杆菌性腹泻病防治药物中的应用。
9.优选地，所述大肠杆菌为ctx-m型esbl-dec菌株。
10.第二方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在制备腹泻性大肠杆菌抑菌剂中的应用。
11.优选地，所述大肠杆菌为ctx-m型esbl-dec菌株。
12.第三方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在制备由腹泻性大肠杆菌感染所致疾病的防治药物中的应用。
13.所述疾病包括结肠炎、腹泻。
14.优选地，所述大肠杆菌为ctx-m型esbl-dec菌株。
15.第四方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在制备减轻由腹泻性大肠杆菌感染诱发的结肠炎症反应的制剂中的应用。
16.所述结肠炎症反应包括il-1β、tnf-α表达量的增加，il-10、tgf-β表达量的降低。
17.优选地，所述大肠杆菌为ctx-m型esbl-dec菌株。
18.第五方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在制备用于维持腹泻性大肠杆菌感染小鼠体重以及提高小鼠存活率的药物中的应用。
19.本发明中，前期根据犊牛粪便非靶向代谢组学研究结果，发现健康犊牛肠道中的没食子酸含量显著高于腹泻犊牛，基于这一差异进而开展没食子酸用于大肠杆菌性腹泻病的防治研究。该腹泻性大肠杆菌(diarrheagenic escherichia coli)
‑‑
大肠埃希氏菌(escherichia coli)1587，分离自临床患有大肠杆菌腹泻病的犊牛，能引发奶牛的急性腹泻病。该菌现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号cgmcc no.23694，保藏日期2021年10月29日。
20.所述腹泻性大肠杆菌感染小鼠的构建方法为：配制腹泻性大肠杆菌的菌悬液，菌悬液经腹腔注射给小鼠。
21.前述的方法，所述小鼠为cd-1小鼠。
22.前述的方法，所述小鼠为出生后35-42天(优选42天)的母鼠。
23.前述的方法，所述菌悬液中腹泻性大肠杆菌的浓度为5
×
107～1
×
108cfu/ml，用 pbs溶液进行配制。
24.进一步地，所述方法包括：给小鼠腹腔注射1ml菌悬液，小鼠可自由采食，充足饮水，于通风干燥条件，饲养18～24h(优选24h)。
25.第六方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在促进动物肠道短链脂肪酸(如乙酸)生成中的应用。
26.第七方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在制备调控动物结肠发育的制剂中的应用，所述调控为正调控。
27.第八方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在抗腹泻性大肠杆菌感染以及预防或治疗由腹泻性大肠杆菌感染所致疾病中的应用。
28.第九方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在减轻由腹泻性大肠杆菌感染诱发的结肠炎症反应中的应用。
29.所述结肠炎症反应包括il-1β、tnf-α表达量的增加，il-10、tgf-β表达量的降低。
30.第十方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在维持腹泻性大肠杆菌感染小鼠体重以及提高小鼠存活率中的应用。
31.第十一方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受的酯或盐或其衍生物在保护动物结肠正常发育中的应用。
32.第十二方面，本发明提供没食子酸或其药学上可接受酯类在制备预防或治疗奶牛大肠杆菌性腹泻的药物中的应用。
33.进一步地，所述没食子酸或其药学上可接受酯类具有减轻结肠炎症反应的作用。
34.进一步地，所述没食子酸或其药学上可接受酯类具有抑菌作用。
35.进一步地，所述没食子酸或其药学上可接受酯类能降低白介素-1β(il-1β)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的表达，促进抑炎因子白介素-10(il-10)和转化生子因子-α (tgf-β)的表达。
36.进一步地，所述没食子酸或其药学上可接受酯类能保护结肠正常生长发育。
37.进一步地，所述没食子酸或其药学上可接受酯类能增加结肠内容物中短链脂肪酸的产生量。
38.本发明中，没食子酸药学上可接受的酯可选自表没食子儿茶素没食子酸酯、没食子酸儿茶素酯、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、没食子酸丙酯、没食子酸丁酯、没食子酸异丁酯、没食子酸异戊酯、没食子酸月桂酯、没食子酸辛酯等中的至少一种；优选表没食子儿茶素没食子酸酯。
39.本发明通过体外实验，证实了没食子酸可以抑制dec菌株增殖。同时，通过细胞实验，证实了没食子酸可以通过抑制白介素-1β(il-1β)，促进白介素-10(il-10) 和转化生子因子-α(tgf-β)的表达，维持细胞之间的紧密连接，从而起到对奶牛大肠杆菌性腹泻病的保护作用。本发明提供了没食子酸的新用途，其对奶牛大肠杆菌性腹泻病引起的结肠炎症反应具有很好的保护作用，肿瘤坏死因子-α(tnf-α)在没食子酸作用下显著降低，白介素-10(il-10)在没食子酸作用下显著增加，没食子酸干预能维持奶牛大肠杆菌性腹泻病小鼠模型的体重，保护结肠的生长发育，增加结肠中短链脂肪酸的产生量，提高奶牛大肠杆菌性腹泻病模型小鼠的存活率，为采用没食子酸进行奶牛(犊牛)大肠杆菌性腹泻病的防治奠定了理论基础。
附图说明
40.图1为本发明较佳实施例中腹泻性大肠杆菌体外培养示意图。
41.图2为本发明较佳实施例中人结肠癌上皮细胞(caco-2细胞)培养的照片。其中， a为caco-2空白对照细胞，b为脂多糖诱导caco-2细胞，c为没食子酸干预的结果。
42.图3为本发明较佳实施例中mem+水、mem+没食子酸、脂多糖+水、脂多糖+没食子酸组caco-2细胞促炎因子mrna水平影响示意图。
43.图4a为图3中四组caco-2细胞nf-κb信号通路中磷酸化iκb(p-iκb)和iκb，以及细胞紧密连接蛋白的表达示意图。
44.图4b为磷酸化iκb(p-iκb)和iκb相对表达量比值的量化示意图。其中，横坐标分别为mem+水、mem+没食子酸、脂多糖+水、脂多糖+没食子酸组四个分组，纵坐标代表p-iκb和iκb相对表达量的比值。
45.图4c为细胞紧密连接蛋白occludin相对表达量的量化示意图。其中，横坐标分别为mem+水、mem+没食子酸、脂多糖+水、脂多糖+没食子酸组四个分组，纵坐标代表occludin和β-actin相对表达量的比值。
46.图5a为本发明较佳实施例中pbs、安慰剂和没食子酸组小鼠感染dec后体重变化示意图。
47.图5b为本发明较佳实施例中pbs、安慰剂和没食子酸组小鼠感染dec后存活率示意图。
48.图6为图5中三组小鼠感染dec后促炎因子mrna表达示意图。其中，横坐标分别为pbs、安慰剂和没食子酸三个分组，纵坐标代表细胞因子mrna的相对表达量。
49.图7为分离图5所述的三组小鼠结肠组织nf-κb信号通路中磷酸化iκb(p-iκb)和iκb，以及紧密连接蛋白的表达示意图。
50.图8为图5三组小鼠的结肠长度示意图。其中，横坐标分别为pbs、安慰剂和没食子酸三个分组，纵坐标代表小鼠结肠长度。
51.图9为图5三组小鼠的结肠肠壁在组织镜下观察和病理学评分的结果示意图。其中，病理图片分别为pbs、安慰剂和没食子酸三个分组，以及小鼠结肠病理评分。
52.图10为分离图5所述的三组小鼠结肠中短链脂肪酸产生示意图。其中，横坐标分别为pbs、安慰剂和没食子酸三个分组，纵坐标代表小鼠结肠内容物短链脂肪酸的含量，分别为乙酸、丙酸和丁酸。
53.图中，*、**和***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示p《0.05， **表示p《0.01，***表示p《0.001。
具体实施方式
54.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
55.以下实施例中使用的没食子酸(gallic acid)购自中国阿拉丁公司，分子式为c7h6o5，分子质量为170.12g/mol，纯度≥99％。本品溶解于无菌去离子水中，配置成2g/l母液，按比例稀释到相应作用浓度用于实验。
56.lps(脂多糖，lipopolysaccharide)提取试剂盒购自美国sigma公司。按照lps提取试剂盒说明书提取dec菌株lps成分，溶解于modifed eagle’s medium(mem)培养基，配置成1mg/ml母液，按比例稀释到相应作用浓度用于实验。
57.实施例1dec菌株的分离纯化
58.dec菌株
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大肠埃希氏菌(escherichia coli)1587(保藏编号cgmcc no.23694) 分离自临床患有大肠杆菌腹泻病的犊牛，该菌能引发奶牛的急性腹泻病。经16s rdna 测序，根据测序结果以及微生物学特征及生理生化特性，将该菌鉴定为腹泻性大肠杆菌(diarrheagenic escherichia coli)，血清型为o101:h9，该菌具有细胞黏附性。
59.实施例2没食子酸抑制dec菌株的体外增殖
60.将处于对数生长期的dec菌株按1:1000比例接种到含有氨苄西林抗性的lb液体培养基，在实验组细菌培养液(菌液起始浓度od600
nm
＝0.2)中加入没食子酸(0.08g/l、 0.8g/l)，对照组中加入等体积的水，分别于接种后第0、4、8、12、24小时各收集细菌培养物，分别用分光光度计检测600nm波长下菌液的吸光光度值，如图1所示，加入没食子酸后可以明显抑制dec菌株增殖，且随着没食子酸添加剂量的增加，抑菌现象愈加明显(高0.8g/l组和对照组相比，p＝0.0168)。
61.实施例3没食子酸抑制caco-2细胞炎症反应
62.caco-2细胞在添加含10％胎牛血清的mem培养基中生长，按照2
×
106cell/孔接种到6孔细胞培养板，37℃，5％co2细胞培养箱中培养12h使细胞完全贴壁。待细胞贴壁后，吸弃原培养液，实验组中加入含有没食子酸(0.02g/l)的mem完全培养基1ml，对照组加入含有等量水的mem完全培养基1ml，继续培养24h，吸弃原培养液，用脂多糖(lps)处理细胞(10μg/ml)，并设立未处理组。处理后6h收获细胞，一部分细胞用于提取细胞rna，实时荧光定量pcr方法检测细胞内白介素-1β(il-1β)、白介素-10(il-10)和转化生长因子-β(tgf-β)的mrna表达水平；另一部分细胞中加入细胞裂解液，收获细胞蛋白，免疫印迹方法检测细胞紧密连接蛋白的表达水平和 nf-κb信号通路的激活情况。图2为caco-2细胞培养的照片，图2的a为caco-2空白对照组细胞，图2的b为脂多糖(lps)诱导caco-2细胞，如图2的c所示，没食子酸的干预可以维持细胞的正常状态。上述细胞实验结果如图3和图4a～图4c所示。图3为检测没食子酸对脂多糖(lps)处理的caco-2细胞促炎因子mrna表达影响。结果表明没食子酸干预可降低caco-2细胞白介素-1β(il-1β)，上调白介素-10(il-10)和转化生长因子-β(tgf-β)的表达。
63.图4a为没食子酸对lps处理的caco-2细胞nf-κb信号通路中磷酸化iκb(p-iκb) 和iκb蛋白，以及细胞紧密连接蛋白表达的影响。结果没食子酸干预可在一定程度上抑制细胞内nf-κb信号通路，维持细胞之间的紧密连接
64.图4b和图4c分别为磷酸化iκb(p-iκb)和iκb相对表达量比值和occludin相对表达量的量化示意图。
65.实施例4没食子酸抑制小鼠结肠炎症反应
66.1、小鼠感染模型的构建
67.恒温通风干燥条件下，4周龄同群spf级cd-1小鼠分组后饲养在单独的鼠笼内，自由采食和饮水，每组6-8只，在饮水中添加没食子酸(40mm)连续饲喂小鼠，同时设立安慰剂组和pbs对照组，连续饲喂1周后通过腹腔注射方式感染亚致死剂量(5
ꢀ×
107cfu)的dec菌株，感染后1周内检测小鼠的体重变化情况和存活率。结果如图 5a和图5b所示。
68.如图5a所示，没食子酸可以维持dec感染小鼠的体重，没食子酸干预组较安慰剂组体重下降减少且有统计学差异(p《0.0001)。如图5b所示，没食子酸能够提高小鼠生存率，没食子酸干预组较安慰剂组生存率提高。pbs对照组和没食子酸干预组生存率为100％，安慰剂(去离子水)组为77.38％。
69.2、没食子酸抑制小鼠结肠炎症反应的鉴定
70.在感染后第7天收获小鼠，引颈处死小鼠，分离结肠，一部分结肠组织用于提取细胞rna，实时荧光定量pcr方法检测细胞内白介素-10(il-10)和肿瘤坏死因子-α (tnf-α)的mrna表达水平；另一部分结肠组织中加入细胞裂解液，收获细胞蛋白，免疫印迹方法检测细
胞紧密连接蛋白的表达水平和nf-κb信号通路的激活情况。实验结果如图6～图7所示。
71.如图6所示，安慰剂组小鼠肠道组织促炎因子的表达要显著高于pbs组，而没食子酸干预组能够显著降低促炎因子白介素-10(il-10)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α) mrna的表达。
72.如图7所示，安慰剂组小鼠肠道组织磷酸化iκb(p-iκb)和iκb蛋白相对表达量的比值要高于pbs组，而没食子酸干预组能够显著降低磷酸化iκb(p-iκb)和iκb蛋白相对表达量的比值。同时，dec感染后细胞紧密连接蛋白的表达呈下降趋势，没食子酸干预能够明显维持细胞间紧密连接。
73.与此同时，收获小鼠后采集小鼠结肠，测量结肠长度，10％甲醛固定上述组织并用苏木精&伊红染色法(h&e)分析没食子酸处理组，安慰剂组和pbs对照组的表观病理学数据。其实验结果如图8～图10所示。
74.如图8所示，dec感染能够明显抑制结肠生长发育，没食子酸干预后能够维持结肠正常生长(p《0.0001)。
75.如图9所示，在实验结束后，剖检上述三组小鼠，发现pbs对照组小鼠各器官脏器正常。dec感染组小鼠结肠肠壁水肿，肠道弹性差，易碎。镜检可见dec感染组结肠内肠腺遭到严重破坏，部分组织结构坏死消失。没食子酸干预组结肠肠壁轻度水肿，弹性较好，镜检可见结肠腺体和上皮完整，无炎性细胞浸润。病理学评分：其中包括0、1、2、3、4、5分。由该图可知，没食子酸干预能够显著减低dec感染后的病理评分且有统计学差异(p＝0.0012)。
76.3、没食子酸对结肠中短链脂肪酸产生的影响
77.感染后第7天，收集没食子酸处理组，安慰剂组和pbs对照组小鼠的结肠内容物，气相色谱法检测短链脂肪酸(乙酸，丙酸和丁酸等)的含量。实验结果如图10所示。 dec感染后结肠内容物中短链脂肪酸表达量显著降低，经没食子酸干预能够显著增加dec感染后的乙酸的表达量(p《0.0001)，对丙酸和丁酸无明显作用。
78.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。