表没食子儿茶素没食子酸酯在制备预防或治疗水母毒素全身性中毒的药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，具体地说，是表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)在制备预防或治疗水母毒素全身性中毒的药物中的应用。


背景技术：

2.水母是水生环境中一类低等的无脊椎浮游动物，具有种类多、数量大和分布广等特点。受全球气候变暖、过度捕捞和生物多样性变化等因素的影响，世界各海域频繁发生水母暴发现象，严重危害沿海地区经济发展和涉海作业人员的安全与健康。
3.一般情况下，水母蜇伤立即引发疼痛、鞭痕样红肿或瘙痒等局部症状；当毒素进一步吸收入血后，可能出现恶心、呕吐或头痛等全身症状；若大量毒素进入体内，还可能出现呼吸困难、心跳骤停及肝肾功能衰竭等急性致死症状。水母蜇伤后复杂多样的中毒症状主要是水母毒素所导致，研究发现水母毒素具有溶血毒性、心血管毒性、神经毒性、皮肤与肌肉毒性以及多种酶活性。其中溶血毒性和酶活性在水母毒素中普遍存在，是水母蜇伤后局部水疱、溶血、多器官损伤等症状的主要原因，还会加重水母毒素的心脏毒性，导致急性肺水肿、呼吸心跳骤停等致死症状。目前，水母蜇伤的救治措施主要是对症治疗，尚没有疗效确切的特效抗毒药物。
4.表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)，分子式为c
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，是从茶叶中分离得到的儿茶素类的单体，为绿茶的主要活性和水溶性成分，约占绿茶茶多酚总量的50％～70％，对正常人体几乎无毒害作用。大量的实验和流行病学研究表明，egcg具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗紫外辐射等生物学活性，能够预防多种慢性疾病，如心脏病、糖尿病、神经变性型疾病和癌症等。目前，儿茶素广泛应用于食品、日用品、保健品、药品等多个领域。例如，儿茶素良好的杀菌作用使得其被广泛添加于保健品中，起到抗龋齿、抑菌作用；鉴于儿茶素良好的抗肿瘤、抗动脉粥样硬化作用，也将其用于多种疾病的辅助治疗。
5.迄今为止，未见有关egcg用于预防或治疗水母毒素全身性中毒的相关报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)的新医药用途，具体是指egcg注射给药在预防或治疗水母毒素(nnv)全身中毒中的应用。
7.本发明研究发现，egcg注射给药可以有效拮抗水母毒素的全身中毒效应，降低中毒小鼠死亡率。这一发现，不仅拓宽了egcg的应用范围，也为水母蜇伤所致中毒救治提供了参考。
8.为实现上述发明目的，本发明采取如下技术方案：
9.(1)动物模型建立。小鼠尾静脉注射不同剂量nnv(0.35mg/kg～0.6mg/kg)，观察小鼠中毒症状和生存情况。当毒素剂量达0.5mg/kg时，中毒小鼠早期出现呼吸急促、心跳加快、乏力、萎靡、蜷缩等症状，而后逐渐出现抽搐、死亡，12h内死亡率100％。因此，本发明选
择该剂量制作水母毒素全身中毒小鼠模型。
10.(2)egcg对水母毒素全身中毒的预防作用。将不同剂量egcg(10mg/kg～100mg/kg)与nnv(0.5mg/kg)预孵半分钟,然后小鼠尾静脉给药。结果表明，与中毒模型组小鼠相比，当egcg剂量≥20mg/kg时，小鼠萎靡、蜷缩、发力等症状得以显著改善，观察至7d，小鼠全部存活。于是选择nnv 0.5mg/kg、egcg 20mg/kg进行下一步病理学观察，设置毒素组(nnv)、阴性对照组(生理盐水)、药物处理组(egcg+nnv)，给药后10min、1h分别取小鼠心、肺、肝、肾进行组织病理学检查。此外，将毒素剂量降为0.42mg/kg，同样设置毒素组、阴性对照组、药物处理组，给药后12h取小鼠心、肺、肝、肾进行组织病理学检查。结果发现，毒素组小鼠中毒早期便出现大范围肝小叶弥散性出血、肝细胞肿胀、肝细胞索断裂，心脏出现淤血表现；晚期肝脏病变更加严重，出现汇管区之间桥接坏死、肝细胞凝固性坏死以及炎性细胞浸润。以上病理变化在egcg处理组均未发现。
11.(3)egcg对nnv溶血活性的拮抗作用。水母毒素中的溶血组分会迅速引发红细胞溶解，产生大量的钾和乳酸引起高钾血症和酸血症，并加重水母毒素的心血管毒性和肌毒性，因此溶血毒性也是水母毒素全身中毒后出现急性死亡的一个主要原因。体外溶血实验发现，nnv具有显著的溶血活性，当毒素浓度为0.05μg/ml时，其溶血率即达84.34％。将0.05mg/ml egcg加入溶血体系后再加nnv，溶血率显著下降，说明egcg可以显著抑制nnv的溶血作用。
12.(4)egcg对水母毒素全身中毒的治疗作用。小鼠尾静脉注射nnv(0.5mg/kg)，建立水母毒素全身中毒模型。然后间隔不同时间静脉注射egcg(20mg/kg)，观察小鼠中毒症状和生存情况。结果表明，小鼠中毒后5min内给予egcg可以起到良好的治疗效果，小鼠几乎全部存活；5min～10min给予egcg可以起到一定的治疗效果，小鼠生存时间明显延长，且有一半小鼠可以存活；10min之后再给予egcg，虽然小鼠生存时间有一定延长，但并不能提高小鼠生存率。
13.基于以上技术方案。本发明的第一方面，提供表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)在制备预防或治疗水母毒素全身性中毒的药物中的应用。
14.所述的egcg分子式为c
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，结构如下式i所示：
[0015][0016]
进一步的，所述的预防或治疗水母毒素全身中毒的药物是以egcg作为唯一活性成份或者是包含egcg的药物组合物。
[0017]
进一步的，所述的预防或治疗水母毒素全身性中毒的药物剂型为注射剂。
[0018]
更进一步的，所述的注射剂是将0.5g的加入到50ml的0.9％氯化钠溶液中。
[0019]
进一步的，所述的egcg的给药剂量为20mg/kg。
[0020]
进一步的，所述的药物的给药时间是水母毒素中毒后5min内。
[0021]
进一步的，所述的egcg大幅提高水母毒素中毒后生存率，显著改善中毒后的血压下降；显著抑制水母毒素的溶血活性；明显改善水母毒素所致的早期心、肝损伤以及晚期肝、肾损伤。
[0022]
本发明的第二方面，提供一种预防或治疗水母毒素全身性中毒的药物，所述的药物是以egcg作为唯一活性成份或者是包含egcg的药物组合物。
[0023]
进一步的，所述的药物为注射剂，是将0.5g的egcg加入到50ml的0.9％氯化钠溶液中。给药剂量为20mg/kg，具体可根据病情等进行变化。
[0024]
本发明通过实验证明，egcg和致死剂量水母毒素(nnv)预孵后再注射给药，可大幅度提高小鼠生存率。体外溶血试验发现，egcg可以显著抑制nnv的溶血活性。病理学检查结果显示，egcg和nnv预孵后注射给药，可以明显改善水母毒素所致的小鼠早期心、肝损伤以及晚期肝、肾损伤。
[0025]
通过建立水母毒素小鼠中毒模型，中毒后间隔不同时间注射egcg，观察egcg对水母毒素全身中毒的治疗效果。结果发现，egcg治疗性用药显著提高中毒小鼠生存率，且中毒后越早给药，治疗效果越好。
[0026]
相对于现有技术，本发明优点在于：
[0027]
1、本发明提供了egcg的新用途，egcg注射给药可以对水母毒素全身中毒动物模型起到明显预防和治疗作用，具体为egcg与致死剂量水母毒素预孵后注射小鼠，可显著提高小鼠生存率；egcg与致死剂量水母毒素预孵后注射大鼠，可改善毒素所致大鼠血压降低情况；小鼠水母毒素全身中毒后再注射egcg，也可显著提高其生存率；还发现egcg可显著抑制水母毒素的溶血活性。以上结果表明egcg注射给药可以有效预防和治疗水母毒素全身中毒，这为开发水母蜇伤全身中毒的预防或治疗药物提供了一种有效的候选药物，也为药物新应用临床研究提供参考。
[0028]
2、我国有长期饮茶的历史和习惯，egcg作为绿茶的主要成分，安全性有保证，因此本发明内容具有良好的临床应用推广价值。
附图说明
[0029]
图1：小鼠静脉注射水母毒素生存率。
[0030]
图2：egcg对小鼠中毒模型生存率的影响。
[0031]
图3：不同浓度水母毒素的溶血活性。
[0032]
图4：egcg对水母毒素溶血活性的抑制作用。
[0033]
图5：小鼠尾静脉注射nnv(0.5mg/kg)、nnv(0.5mg/kg)+egcg(20mg/kg)1h后心、肝、肺、肾形态变化。(a)正常心脏组织；(b)注射nnv后的心脏组织，心肌细胞嗜酸性变(黑色箭头)，胞质嗜酸性增强，胞核固缩；间质毛细血管可见淤血(人字形白色箭头)；(c)混合注射nnv+egcg后的心脏组织，未见明显异常；(d)正常肝脏组织；(e)注射nnv后的肝脏组织，组织肝细胞中度肿胀(黑色箭头)，胞质疏松淡染，混有少量的圆形脂肪空泡(灰色箭头)；大范围肝小叶弥散性出血(人字形白色箭头)，有的肝细胞索断裂；(f)混合注射nnv+egcg后的肝脏
组织，肝小叶结构清晰，有广泛的肝细胞轻度空泡变性；(g)正常肺脏组织；(h)注射nnv后的肺脏组织，少量上皮细胞增生，少量的中性粒细胞浸润(三角形白色箭头)(i)混合注射nnv+egcg后的肺脏组织，未见明显异常；(j)正常肾脏组织；(k)注射nnv后的肾脏组织，未见明显异常；(l)混合注射nnv+egcg后的肾脏组织，未见明显异常。
[0034]
图6：小鼠尾静脉注射nnv(0.42mg/kg)、nnv(0.42mg/kg)+egcg(20mg/kg)12h后心、肝、肺、肾形态变化。(a)正常心脏组织；(b)注射nnv后的心脏组织，未见明显异常；(c)混合注射nnv+egcg后的心脏组织，未见明显异常；(d)正常肝脏组织；(e)注射nnv后的肝脏组织，组织广泛的汇管区之间桥接坏死，肝细胞凝固性坏死，胞质嗜酸性增强，胞核消失，伴轻度的出血(人字形白色箭头)，少量的中性粒细胞浸润(三角形白色箭头)，周围个别肝细胞重度空泡变性(黑色箭头)，多见周围肝细胞微泡性脂肪变性(灰色箭头)；(f)混合注射nnv+egcg后的肝脏组织，肝小叶结构清晰，广泛的肝细胞重度空泡变性(黑色箭头)，胞体肿胀，胞质疏松淡染，较多呈气球样变(人字形白色箭头)，未见明显的炎性细胞浸润；(g)正常肺脏组织；(h)注射nnv后的肺脏组织组织，未见明显异常；(i)混合注射nnv+egcg后的肺脏组织，未见明显异常；(j)正常肾脏组织；(k)注射nnv后的肾脏组织，较多的肾小管上皮细胞脂肪变性(黑色箭头)，胞质中可见微小的圆形空泡，未见明显的炎性细胞浸润；(l)混合注射nnv+egcg后的肾脏组织，未见明显异常。
[0035]
图7：egcg(20mg/kg)治疗性给药对小鼠中毒模型生存率的影响。
具体实施方式
[0036]
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0037]
实施例1:小鼠静脉注射水母毒素(nnv)致死剂量的摸索
[0038]
1、实验方法
[0039]
将icr小鼠随机分成5组(n＝3)，尾静脉注射不同剂量的nnv(0.42mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.72mg/kg、0.86mg/kg，溶剂为生理盐水，定容至0.1ml)，观察不同剂量nnv对小鼠的生存影响。
[0040]
2、实验结果
[0041]
当毒素剂量≥0.6mg/kg时，小鼠在2h内陆续死亡。毒素剂量为0.5mg/kg时，小鼠存活时间延长，但最终1d内还是全部死亡。毒素剂量为0.42mg/kg时，部分小鼠可以存活超过1周。
[0042]
实施例2：nnv中毒小鼠生存分析
[0043]
1、实验方法
[0044]
根据实施例1的结果，重新确定nnv剂量范围，并扩大每组小鼠数量。将icr小鼠随机分成5组(n＝10)，尾静脉注射不同剂量的nnv(0.35mg/kg、0.42mg/kg、0.45mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg，溶剂为生理盐水，定容至0.1ml)，观察不同剂量nnv对小鼠的生存影响。
[0045]
2、实验结果
[0046]
如图1所示，当毒素剂量≤0.42mg/kg时，小鼠早期表现为兴奋反应，10min后逐渐出现萎靡、反应迟钝、蜷缩，部分小鼠在3d内陆续死亡。当毒素剂量为0.45mg/kg或0.5mg/kg
时，小鼠早期出现呼吸急促、心跳增强、乏力、萎靡、蜷缩，逐渐出现抽搐，死亡。而当毒素剂量达到0.6mg/kg时，小鼠立即出现抽搐，并迅速死亡。
[0047]
实施例3：egcg拮抗致死剂量nnv的有效剂量范围摸索
[0048]
1、实验方法
[0049]
用生理盐水将egcg配成10mg/ml的溶剂。icr小鼠随机分成5组(n＝2)将不同剂量的egcg(100mg/kg、80mg/kg、40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)与0.5mg/kg nnv混合，用生理盐水定容至0.2ml，尾静脉注射，观察小鼠反应以及生存时间。
[0050]
2、实验结果
[0051]
除10mg/kg egcg组一只小鼠死亡外，其余小鼠均存活7d。20mg/kg以上剂量组的小鼠早期呈现轻度兴奋状态，约2h后恢复正常。
[0052]
实施例4：egcg注射给药对nnv全身中毒的预防作用
[0053]
1、实验方法
[0054]
根据实施例3结果，icr小鼠随机分成4组(n＝10)，将不同剂量的egcg(5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg)与0.5mg/kg nnv混合，对照组单用nnv，均用生理盐水定容至0.1ml，尾静脉注射，观察小鼠反应以及生存时间。
[0055]
2、实验结果
[0056]
如图2所示，将egcg与nnv预孵，当egcg剂量达到5mg/kg时，即可改善中毒小鼠的生存率。当egcg剂量达到20mg/kg时，可以完全拮抗0.5mg/kg nnv对小鼠的急性毒性作用。
[0057]
实施例5：nnv溶血活性测试
[0058]
1、实验方法
[0059]
制备2％浓度的小鼠红细胞悬液：眼球取血法将小鼠全血滴入15ml离心管中，加入8ml的pbs，轻轻混匀后，4℃下1000
×
g离心10min，弃上清。再加入8ml pbs，混匀、离心、弃上清，重复2～3次。然后取200μl的红细胞加入9800μl的生理盐水中，制成2％的红细胞悬液。
[0060]
取2％红细胞悬液400μl和不同浓度的nnv 400μl混合，此外设置阴性对照组(0.9％氯化钠溶液400μl+2％红细胞悬液400μl)和阳性对照组(去离子水400μl+2％红细胞悬液400μl)，在37℃温水中孵育30min，4℃下1000
×
g离心10min，取200μl上清滴入96孔微量滴定板，每个体系3个复孔，测定450nm下的吸光度。
[0061]
2、实验结果
[0062]
如图3所示，nnv对小鼠红细胞具有明显溶血作用，毒素浓度越高，溶血作用越强，nnv达到0.5μg/ml时，溶血率超过100％。
[0063]
实施例6：egcg对nnv溶血活性的抑制作用
[0064]
1、实验方法
[0065]
根据nnv溶血试验结果，选定0.2μg/ml nnv作为检测egcg对nnv溶血活性抑制作用的毒素浓度。将0.16μg的nnv与不同剂量的egcg预先混合，并用生理盐水定容至400μl，而后与400μl 2％红细胞悬液混合，同时设置阴性对照组(0.9％氯化钠溶液400μl+2％红细胞悬液400μl)、阳性对照组(去离子水400μl+2％红细胞悬液400μl)和单用水母毒素组，在37℃温水中孵育30min，4℃下1000
×
g离心10min，取200μl上清滴入96孔微量滴定板，每个体系3个复孔，测定450nm下的吸光度。
[0066]
2、实验结果
[0067]
实验结果显示，egcg对nnv溶血活性具有明显抑制作用。如图4所示，0.05mg/ml egcg处理组的溶血率仅为2.23％，几乎完全抑制了nnv的溶血作用。
[0068]
实施例7：egcg与nnv预孵后注射给药对小鼠脏器的保护作用i
[0069]
1、实验方法
[0070]
icr小鼠随机分成3组：生理盐水对照组、0.5mg/kg nnv组、0.5mg/kg nnv+20mg/kg egcg组，注射给药后10min，取各组小鼠的心、肝、肺、肾组织，以4％多聚甲醛固定，进行组织病理学检查。
[0071]
2、实验结果
[0072]
如图5所示，水母毒素中毒小鼠模型早期肝组织病变比较明显，组织肝细胞中度肿胀，胞质疏松淡染，混有少量的圆形脂肪空泡，大范围肝小叶弥散性出血，有的肝细胞索断裂。心脏组织稍有变化，心肌细胞嗜酸性变，胞质嗜酸性增强，胞核固缩，间质毛细血管可见淤血，肺脏和肾脏基本无变化。以上病理改变在egcg处理组均得以显著改善。
[0073]
实施例8：egcg与nnv预孵后注射给药对小鼠脏器的保护作用ii
[0074]
1、实验方法
[0075]
icr小鼠随机分成3组：生理盐水对照组、0.42mg/kg nnv组、0.42mg/kg nnv+20mg/kg egcg组，注射给药后12h，取各组小鼠的心、肝、肺、肾组织，以4％多聚甲醛固定，进行组织病理学检查。
[0076]
2、实验结果
[0077]
如图6所示，水母蜇伤中毒小鼠模型晚期肝组织病变更加严重，组织广泛的汇管区之间桥接坏死，肝细胞凝固性坏死，胞质嗜酸性增强，胞核消失，伴轻度的出血，少量的中性粒细胞浸润，周围个别肝细胞重度空泡变性，多见周围肝细胞微泡性脂肪变性，肾脏有较多的肾小管上皮细胞脂肪变性，心肺基本无变化。以上病理改变在egcg处理组均得以显著改善。
[0078]
实验例9：egcg注射给药对nnv全身中毒的治疗作用i
[0079]
1、实验方法
[0080]
icr小鼠尾静脉注射nnv(0.5mg/kg)，建立小鼠水母毒素全身中毒模型，随机分成3组(n＝5)，5min后尾静脉注射不同剂量egcg(20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg)，观察小鼠的反应以及生存分析。
[0081]
2、实验结果
[0082]
小鼠早期出现心跳加快、乏力症状，但是随着给予egcg，症状得以逐渐缓解，所有小鼠均存活。
[0083]
实验例10：egcg注射给药对nnv全身中毒的治疗作用ii
[0084]
1、实验方法
[0085]
icr小鼠尾静脉注射nnv(0.5mg/kg)，建立小鼠水母毒素全身中毒模型，随机分成3组(n＝10)，于给予毒素后5min、10min、20min分别尾静脉注射20mg/kg egcg，观察小鼠的反应以及生存分析。
[0086]
2、实验结果
[0087]
如图7所示，给予毒素后5min内注射egcg，小鼠症状得到有效缓解，水母毒素全身中毒小鼠存活率为90％；间隔10min给予egcg，水母毒素全身中毒小鼠存活率降为50％；间
隔20min再给予egcg，仅能稍微延长小鼠存活时间。可见egcg对水母毒素全身中毒具有一定的治疗作用，但需尽早注射给药。
[0088]
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。