一种预防棘球蚴病的疫苗组合物、及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种用于预防棘球蚴病的疫苗组合物、及其制备方法和应用，属于生物制药领域。

背景技术：

1、包虫病(hydatidosis，hydatid disease)又称棘球蚴病(echinococcosis)或囊性包虫病(cystic echinococcosis，ce)，是由细粒棘球绦虫(echinococcus granulosus，eg)或多房棘球绦虫(e.multilocularis)的蚴虫感染牛、羊和寄生在人体肝、肺等脏器所引起的一种人兽共患寄生虫病，是中国卫健委规划防治的五大寄生虫病之一。

2、由于使用药物和包囊摘除的方法治疗包虫病的效果并不理想，因此对于该病来说目前主要以预防为主，基因工程疫苗以其高效性及特异性的特点成为预防该病最理想的方法。研究表明，eg95蛋白是一种能够用于预防棘球绦虫感染的保护性抗原。lightowlers等将eg95蛋白与gst融合表达制备的基因工程亚单位疫苗，能对包虫病能起到很好的免疫保护作用，但因重组蛋白表达量偏低且不可溶，制约了该疫苗的大规模生产及应用。

3、因此，急需一种能大规模生产及应用且免疫效果良好的产品来预防和控制棘球蚴病。

技术实现思路

1、本发明提供了大肠杆菌可溶性表达eg95抗原蛋白的制备方法。

2、本发明提供了大肠杆菌高效表达eg95抗原蛋白的制备方法。

3、本发明提供了eg95抗原蛋白，其为eg95全长蛋白片段，具有良好的免疫原性。

4、本发明提供了含有eg95抗原蛋白的疫苗组合物。

5、本发明提供了保护牛免受棘球蚴虫的感染的疫苗组合物。

6、本发明提供了保护羊免受棘球蚴虫的感染的疫苗组合物。

7、本发明还提供了疫苗组合物在制备牛、羊免受棘球蚴虫的感染的药物中的应用。

8、具体实施方式

9、以下，对本发明的实施方式进行说明。

10、定义

11、术语“棘球蚴病”又称为包虫病。包虫病是由棘球属绦虫的细粒棘球绦虫等数种棘球绦虫的幼虫寄生于人、牛、羊等多种哺乳动物的脏器内而引起的一种危害极大的人畜共患寄生虫病，主要见于草地放牧的牛、羊等。本病的临床表现视包虫囊部位、大小和有无并发症而不同。

12、术语“eg95蛋白”是指位于细粒棘球绦虫六鈎蚴、可育囊生发层、原头蚴以及成虫体被上，可能在六鈎蚴钻穿小肠绒毛上皮层的过程中起重要作用。

13、术语“抗原(antigen)”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被t/b淋巴细胞表面的抗原受体(tcr/bcr)特异性识别与结合，活化t/b细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。

14、本发明所用术语“疫苗”、“疫苗组合物”指含有棘球蚴虫蛋白抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强牛、羊等针对棘球蚴虫的免疫反应。

15、术语“免疫量”应当理解为“免疫有效量”，又称免疫保护量或产生免疫应答的有效量，为可在接受者体内有效诱导免疫应答的抗原量，该量足以预防或改善疾病的体征或症状，包括不利的健康影响或其并发症。所述免疫应答可能足以用于诊断目的或其它试验，或可能适合用于预防疾病的征兆或症状，包括由病原体引起的感染所造成的不利的健康结果或其并发症。体液免疫力或由细胞介导的免疫力或此二者均可被诱导。动物对免疫原性组合物的免疫应答可通过例如测量抗体效价、淋巴细胞增殖分析而间接评估，或在以野生型毒株攻击后通过监测征兆或症状来直接评估，而该由疫苗提供的保护性免疫力可通过测量例如受试者的临床征兆如死亡率、发病率的减少、温度数值、受试者总体生理状况及总体健康和表现来评估。所述免疫应答可包括但不限于诱导细胞性和/或体液免疫力。

16、术语“sumo”是指类泛素蛋白修饰分子，用于蛋白翻译后修饰方式。

17、所述“elp40”是指类弹性蛋白多肽，人工合成的基因工程化多肽聚合物。

18、术语“药学上可接受的载体”是指在本发明疫苗组合物中除棘球蚴虫蛋白抗原之外的其它所有成分，不刺激机体不阻碍使用化合物的生物学活性和特性的载体或者稀释剂，优选为佐剂。术语“佐剂”可包括铝胶佐剂；皂苷(saponin)，如quil a、qs-21(cambridgebiotech incorporation,cambridge ma)、gpi-0100(galenica pharmaceuticalsincorporation，birmingham al)；油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物选出的化合物。术语“乳剂”可尤其基于轻液体石蜡油(european pharmacopea类型)；因烯烃寡聚产生的类异戊二烯油(isoprenoid oil)，如角鲨烷(squalane)或角鲨烯油(squalene oil)，尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烷基的酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二-(辛酸酯/葵酸酯)、甘油三-(辛酸酯/葵酸酯)或丙二醇二油酸酯；支链脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇(mannide)的酯(如无水甘露醇油酸酯)、脂肪族二元醇(glycol)的酯、聚甘油(polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，尤其pluronic产品，特别是l121。参见hunter等编写的《the theory and practical application of adjuvants》(ed.by des stewart-tull,john wiley and sons,new york,1995:51-94)和todd等编写的《vaccine》(1997,15:564-570)。例如，可使用powell m和newman m编写的《vaccinedesign,the subunit and adiuvant approach》(plenum press,1995)第147页描述的spt乳剂及第183页描述的mf59乳剂。术语“丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物”优选为交联的丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物，尤其是与糖(sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为卡波姆(carbomer，商品名carbopol)(phameuropa,1996,8(2))。本领域技术人员还可参见美国专利us2909462，其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂烃基(aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团(ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出售，(bfgoodrich,ohio,usa)特别合适。它们与烯丙基蔗糖或与烯丙基季戊四醇(allylpentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974p、934p和971p，最优选使用卡波普971p。术语“顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物”也可考虑顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物ema(monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中和至生理ph，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。术语“佐剂”还包括，但不限于，ribi佐剂系统(ribi incorporation)、block co-polymer(cytrx,atlanta ga)、saf-m(chiron,emeryville ca)、单磷酰脂质a(monophosphoryl lipid a)、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素(重组或其它)、霍乱毒素、ims 1314、胞壁酰二肽、gel佐剂等。优选地，所述佐剂包括矿物油、铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基(alkenyl)衍生物的共聚物、ribi佐剂系统、block co-polymer、saf-m、单磷酰脂质a、avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素、霍乱毒素、ims 1314、胞壁酰二肽、montanide isa 206或gel佐剂中的一种或几种。

19、术语“冻干保护剂”是指是除赋形剂外，给予药物有效成分在冷冻干燥过程及冻干后储存阶段保护药物药效的成分。

20、术语“剂型”是指药物制剂的形态。也指根据药物性质，以及治病和处方的要求制成的药剂(成品药)。合适的剂型是为了发挥药物的最佳疗效，减少毒副作用，以及便于使用、贮存和运输。

21、术语“注射剂(injection)”是指药物制成的供注入体内的无菌溶液(包括乳浊液和混悬液)以及供临用前配成溶液或混悬液的无菌粉末或浓溶液，可以是注射水针剂(溶媒为水)、注射油针剂(溶媒为油)；尚有用其它溶媒的注射剂，如乙醇(氢化可的松注射液的溶媒就是乙醇)、甘油、丙二醇(peg)等。

22、术语“注射用粉末”是指在无菌环境下将药液冷冻，将原料药“掺”在某些辅料或溶在某些溶媒中，经过一定的加工处理制成不同形式的制剂。术语“预防”在涉及棘球蚴虫感染时是指抑制棘球蚴虫的复制、抑制棘球蚴虫的传播或防止棘球蚴虫在其宿主体内定居，以及减轻棘球蚴虫感染的疾病或病症的症状。