冠状病毒RNA疫苗的制作方法

冠状病毒rna疫苗
1.相关申请
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)要求2020年1月28日提交的美国临时申请第62/967,006号、2020年2月7日提交的美国临时申请第62/971,825号、2020年3月30日提交的美国临时申请第63/002,094号、2020年4月13日提交的美国临时申请第63/009,005号和2020年4月27日提交的美国临时申请第63/016,175号的权益，所述临时申请各自通过引用整体并入本文。


背景技术：

3.人类冠状病毒是冠状病毒科(coronaviridae family)的高度传染性的包膜阳性单链rna病毒。已知冠状病毒科的两个亚科引起人类疾病。最重要的是β-冠状病毒(beta-coronavirus)。β-冠状病毒是轻度至中度上呼吸道感染的常见病原体。sarscov-2病毒所引起的大流行性疾病已被世界卫生组织(world health organization,who)命名为covid-19(冠状病毒疾病(coronavirus disease)2019)。
4.目前，尚无针对covid-19的特异性治疗或针对sars-cov-2感染的疫苗。与冠状病毒感染(特别是sars-cov-2大流行)相关的持续健康问题和死亡率在国际上引起了极大关注。由sars-cov-2所引起的公共健康危机强调了快速开发针对这些病毒的有效且安全的候选疫苗的重要性。


技术实现要素：

5.本文在一些实施方案中提供了包含rna的免疫组合物(例如rna疫苗)，所述rna编码能够引发针对冠状病毒抗原(例如sars-cov-2抗原)的强效中和抗体反应的高度免疫原性抗原。令人惊讶的是，这种新型冠状病毒的蛋白质抗原序列与严重急性呼吸综合征(sars)冠状病毒的蛋白质抗原序列共有小于80％的同一性，并且与中东呼吸综合征(mers)冠状病毒的蛋白质抗原序列共有小于35％的同一性。
6.在一些实施方案中，本文所提供的构建体包括：天然sars-cov-2刺突(s)蛋白中的多碱基切割位点回复为单碱基切割位点(例如图1，变体7，seq id no:23)；羧基尾处的多碱基er/高尔基体(golgi)信号序列(kxhxx-cooh)的缺失(例如图1，变体8，seq id no:26)；双脯氨酸稳定化突变(例如图1，变体1-6和9，seq id no:5、8、11、14、17、20和29)；经修饰的蛋白酶切割位点以使蛋白质稳定化(例如图1，变体3和5，seq id no:11和17)；胞质尾的缺失(例如图1，变体3、4和6，seq id no:11、14和20)；和/或折叠子支架(例如图1，变体3和4，seq id no:11和14)。本文公开的结构特征包括例如通过任选地用跨膜区替换弗林蛋白酶切割位点来消除弗林蛋白酶切割位点、移植到刺突胞外域的c末端部分的折叠子、缺失的c末端胞内尾(羧基尾)，因此，在一些实施方案中，本文提供的mrna包含编码变体三聚刺突蛋白的开放阅读框，所述变体三聚刺突蛋白包含缺失的弗林蛋白酶切割位点、作为c末端的额外折叠子序列、缺失的羧基尾或其中的序列和/或2脯氨酸突变中的任何一者或多者。
7.本公开的一些方面提供了一种核糖核酸(rna)，其包含开放阅读框(orf)，所述orf
编码能够诱导对sars-cov-2的免疫反应(例如中和抗体反应)的冠状病毒抗原(例如s蛋白、膜(m)蛋白、包膜(e)蛋白、核衣壳(nc)蛋白或表1的蛋白)，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
8.本公开的其他方面提供了一种密码子优化的rna，其包含orf，所述orf包含与编码sars-cov-2抗原的野生型rna具有至少80％同一性的序列，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
9.本公开的其他方面提供了一种化学修饰的rna，其包含orf，所述orf包含与编码sars-cov-2抗原的野生型rna具有至少80％同一性的序列，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
10.本公开的其他方面提供了一种rna，其包含orf，所述orf包含与表1序列中的任一者的序列(例如seq id no:3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、48、50、52、54、56、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82或84)具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:28的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:16的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:19的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:22的序列具有至少80％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:25的序列具有至少80％同一性的序列。
11.在一些实施方案中，所述orf包含与表1序列中的任一者的序列(例如seq id no:3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、48、50、52、54、56、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82或84)具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:28的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含seq id no:28的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:16的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含seq id no:16的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:19的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含seq id no:19的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:22的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含seq id no:22的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:25的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含seq id no:25的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含与seq id no:106的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。在一些实施方案中，所述rna包含orf，所述orf包含seq id no:106的序列。在一些实施方案中，包含orf的mrna被统一修饰(例如，完全修饰、在整个序列中修饰)以进行特定修饰。例如，rna可用1-甲基-假尿苷进行统一修饰，使得序列中的每个u都是1-甲基-假尿苷。
12.在一些实施方案中，所述rna还包含5'utr，任选地其中所述5'utr包含seq id no:2或seq id no:36的序列。
20mol％或5-15mol％)非阳离子(例如中性)脂质；25-55mol％(例如30-45mol％或35-40mol％)固醇；和20-60mol％(例如40-60mol％、40-50mol％、45-55mol％或45-50mol％)可电离的阳离子脂质。在一些实施方案中，所述peg修饰的脂质是1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)，所述非阳离子脂质是1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质具有化合物1的结构：
[0027][0028]
本公开的其他方面提供了一种组合物，所述组合物包含前述实施方案中的任一实施方案的rna和脂质混合物。在一些实施方案中，所述脂质混合物包含peg修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离的阳离子脂质或其任何组合。在一些实施方案中，所述脂质混合物包含0.5-15mol％(例如0.5-10mol％、0.5-5mol％或1-2mol％)peg修饰的脂质；5-25mol％(例如5-20mol％或5-15mol％)非阳离子(例如中性)脂质；25-55mol％(例如30-45mol％或35-40mol％)固醇；和20-60mol％(例如40-60mol％、40-50mol％、45-55mol％或45-50mol％)可电离的阳离子脂质。在一些实施方案中，所述peg修饰的脂质是1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)，所述非阳离子脂质是1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质具有化合物1的结构。
[0029]
在一些实施方案中，所述脂质混合物形成脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，将rna配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒首先形成为空的脂质纳米颗粒，并且在即将施用之前(例如在几分钟至一小时内)与疫苗的mrna组合。
[0030]
本公开的其他方面提供了一种方法，所述方法包括向受试者施用前述实施方案中的任一实施方案的rna，其量有效诱导所述受试者中针对冠状病毒的中和抗体反应。
[0031]
本公开的其他方面提供了一种方法，所述方法包括向受试者施用前述实施方案中的任一实施方案的组合物，其量有效诱导所述受试者中针对冠状病毒的中和抗体反应和/或t细胞免疫反应、任选地cd4
+
和/或cd8
+
t细胞免疫反应。
[0032]
在一些实施方案中，所述冠状病毒是sars-cov-2。
[0033]
在一些实施方案中，所述受试者是免疫受损的。在一些实施方案中，所述受试者患有肺病。在一些实施方案中，所述受试者为5岁或更小、或65岁或更大。
[0034]
在一些实施方案中，所述方法包括向所述受试者施用至少两个剂量的组合物。
[0035]
在一些实施方案中，在施用rna或包含rna的组合物后1-72小时，在受试者的血清中产生可检测水平的冠状病毒抗原。
[0036]
在一些实施方案中，在施用rna或包含rna的组合物后1-72小时，在受试者的血清中产生至少100nu/ml、至少500nu/ml或至少1000nu/ml的中和抗体滴度。
[0037]
应理解，术语“sars-cov-2”、“2019新型冠状病毒”和“2019-ncov”是指最近出现的、现称为sars-cov-2的同一种β冠状病毒，并且其在本文中可互换使用。
[0038]
国际申请第pct/us2016/058327号(公开第wo2017/07062号)和国际申请第pct/
us2018/022777号(公开第wo2018/170347号)的全部内容通过引用并入本文。
附图说明
[0039]
图1显示由本公开的sars-cov-2 mrna编码的各种示例性s蛋白抗原的示意图。顶部示意图代表野生型sars-cov-2蛋白；下方示意图绘示相对于所述野生型的sars-cov-2蛋白变体。
[0040]
图2显示由本公开的sars-cov-2 mrna编码的各种sars-cov-2蛋白变体的24小时体外表达数据的图表。
[0041]
图3显示由本公开的sars-cov-2 mrna编码的各种sars-cov-2蛋白变体的24小时体外表达数据的图表。测试了两种不同量的mrna。
[0042]
图4a至图4b显示在不同小鼠品系中用不同剂量的sars-cov-2变体9mrna疫苗(图4a)和在较高剂量下(图4b)免疫后的血清抗体滴度测量值的图表。
[0043]
图5a至图5c显示与sars-cov-2变体9mrna疫苗和编码野生型sars-cov-2 s蛋白的mrna(图5b)相比，在用不同剂量的sars-cov-2变体5mrna疫苗(图5a)免疫后的血清抗体滴度测量值的图表。图5c是对七种不同的sars-cov-2 mrna疫苗和编码野生型sars-cov-2 s蛋白序列的mrna的血清抗体滴度进行比较的图表。
[0044]
图6显示在利用不同剂量的sars-cov-2变体9mrna进行免疫后，小鼠中的时程性抗体反应图表。
[0045]
图7显示绘示给药时间表的示意图。
[0046]
图8a至图8c显示在balb/c小鼠(图8a)、c57bl/6小鼠(图8b)和c3b6小鼠(图8c)中，在初免剂量的sars-cov-2变体9mrna疫苗后两周和在加强剂量的wuahn-hu-1变体9mrna疫苗后两周，小鼠中的血清抗体滴度图表。对各种疫苗剂量进行测试。
[0047]
图9a至图9e显示在balb/c小鼠(图9a)和c3b6小鼠(图9b)中，在初免剂量的sars-cov-2变体5mrna疫苗后两周和在加强剂量的sars-cov-2变体5mrna疫苗后两周，或在初免剂量和加强剂量的编码野生型sars-cov-2蛋白的mrna(图9c)后，来自小鼠的血清抗体滴度图表。对各种疫苗剂量进行测试。图9d至图9e显示用sars-cov-2变体9mrna疫苗、sars-cov-2变体5mrna疫苗或编码野生型sars-cov-2 s蛋白的mrna实施免疫的balb/c小鼠(图9d)和c3b6小鼠(图9e)中的血清抗体滴度比较图表。
[0048]
图10显示用七种不同的sara-cov-2 mrna疫苗中的一者或编码野生型sars-cov-2 s蛋白序列的mrna实施免疫的小鼠在加强剂量后的血清抗体滴度比较图表。
[0049]
图11a至图11b显示在利用sars-cov-2变体9mrna疫苗、sars-cov-2变体5mrna疫苗或sars-cov-2变体6mrna疫苗对小鼠实施免疫后，使用对sars-cov-1 s1亚基的n末端结构域具有特异性的5653-118(“118”)抗体进行流式细胞术分析的结果的图表。使用从小鼠获得的淋巴结(图11a)和脾(图11b)样品实施所述分析。
[0050]
图12a至图12b显示在利用sars-cov-2变体9mrna疫苗、sars-cov-2变体5mrna疫苗或sars-cov-2变体6mrna疫苗对小鼠实施免疫后，使用对sars-cov-1 s蛋白的受体结合结构域具有特异性的5652-109(“109”)抗体进行流式细胞术分析的结果的图表。使用从小鼠获得的淋巴结(图12a)和脾(图12b)样品实施所述分析。
[0051]
图13a至图13c显示在体外用六种不同的sars-cov-2 mrna疫苗中的一者转染后的
流式细胞术分析结果的图表。图13a显示阳性抗原呈递细胞(apc+)的百分比，并且图13b显示平均荧光强度(mfi)。图13c显示使用阳性对照(sars抗体)的结果。
[0052]
图14显示使用mab118、mab109和sars mab103(阳性对照)，在体外用sars-cov-2变体9mrna疫苗转染后来自流式细胞术分析的结果的图表。阴性对照不包括一级抗体。
[0053]
图15显示不同浓度的mab118或mab109与sars-cov-2抗原之间的蛋白质结合的图表。
[0054]
图16a至图16b显示在第0周和第3周接种1μg、0.1μg或0.01μg的sars-cov-2变体9mrna疫苗的balb/c小鼠中的结合和中和抗体的图表。图16a显示在第2周(初免后)和第5周(加强后)通过elisa评价的s-2p结合抗体。图16b显示在第5周通过假病毒中和测定在接受1μg或0.1μg的sars-cov-2变体9mrna疫苗的小鼠血清中评价的中和活性。
[0055]
图17a至图17c显示数据图表，其表明sars-cov-2变体9mrna疫苗诱导的免疫性阻止sars-cov-2在balb/c小鼠肺中复制。在第0周和第3周向balb/c小鼠接种1μg、0.1μg或0.01μg的sars-cov-2变体9mrna疫苗，并且在第9周利用小鼠适应性sars-cov-2进行攻击。图17a显示在攻击后第2天通过噬斑测定评价的肺中的病毒滴度。图17b显示在攻击后第2天通过噬斑测定评价的鼻甲中的病毒滴度。图17c显示在感染后随时间推移的体重变化(百分比)。
[0056]
图18a至图18c显示数据图表，其表明sars-cov-2变体9mrna疫苗诱导的免疫性阻止sars-cov-2在balb/c小鼠肺中复制。在第0周向balb/c小鼠接种1μg、0.1μg或0.01μg的sars-cov-2变体9mrna疫苗，并且在第7周利用小鼠适应性sars-cov-2进行攻击。图18a显示在攻击后第2天通过噬斑测定评价的鼻甲中的病毒滴度。图18b显示在攻击后第2天通过噬斑测定评价的肺中的病毒滴度。图18c显示在感染后随时间推移的体重变化(百分比)。
[0057]
图19显示实施例10中使用的第0周和第3周免疫时间表。
[0058]
图20a至图20c显示数据图表，其表明sars-cov-2变体9mrna疫苗诱导的免疫性阻止sars-cov-2在balb/c小鼠肺中复制。在第0周和第4周向balb/c小鼠接种10μg、1μg或0.1μg的sars-cov-2变体9，并且在第7周利用小鼠适应性sars-cov-2进行攻击。图20a显示在攻击后第2天通过噬斑测定评价的鼻甲中的病毒滴度。图20b显示在攻击后第2天通过噬斑测定评价的肺中的病毒滴度。图20c显示在感染后随时间推移的体重变化(百分比)。
[0059]
图21a至图21h显示与在balb/c小鼠的mrna免疫后的中和抗体反应相关的数据图表。在每个血清稀释度下取一式三份的平均值，从相对荧光素酶单位(rlu)读数生成s形曲线，并且将未感染的细胞视为代表100％中和并将仅经病毒转导的细胞视为代表0％中和，计算50％(ic
50
)(图21a、图21c、图21e、图21g)和80％(ic
80
)(图21b、图21d、图21f、图21h)中和活性。每个符号代表个别小鼠，条形代表几何平均滴度(gmt)，并且误差条指示几何标准偏差(sd)。图21a至图21f显示用于比较0.1μg和1μg剂量的未配对t检验。图21g和图21h显示通过单因素方差分析(one-way anova)与kruskal-wallis多重比较检验比较的各组。
[0060]
图22a至图22c显示与利用替代性刺突抗原设计对balb/c小鼠进行低剂量mrna免疫后的结合和中和抗体反应相关的数据图表。图22a显示血清终点滴度。图22b显示将未感染的细胞视为代表100％中和并且将仅经病毒转导的细胞视为代表0％中和所计算的50％(ic
50
)中和活性。每个符号代表个别小鼠，条形代表几何平均滴度(gmt)，并且误差条指示几何标准偏差(sd)。在图22a和图22b中，通过单因素方差分析与kruskal-wallis多重比较检
验对各组进行比较。图22c显示通过斯皮尔曼相关性(spearman correlation)比较的抗体结合和中和滴度。
具体实施方式
[0061]
本公开提供了引发针对冠状病毒抗原的强效中和抗体的组合物(例如免疫/免疫原性组合物，例如脂质纳米颗粒中的rna疫苗)。在一些实施方案中，免疫组合物包括脂质纳米颗粒中的编码冠状病毒抗原(例如sars-cov-2抗原)的rna(例如信使rna(mrna))。在一些实施方案中，所述冠状病毒抗原是结构蛋白。在一些实施方案中，所述冠状病毒抗原是刺突蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或膜蛋白。在一些实施方案中，所述冠状病毒抗原是稳定化的融合前刺突蛋白。在一些实施方案中，所述mrna包含编码变体三聚刺突蛋白的开放阅读框。所述三聚刺突蛋白例如可以包含稳定化的融合前刺突蛋白。在一些实施方案中，所述稳定化的融合前刺突蛋白包含双脯氨酸(s2p)突变。
[0062]
抗原
[0063]
如本文所用的抗原是能够诱导免疫反应的蛋白质(例如使免疫系统产生针对所述抗原的抗体)。在本文中，除非另有说明，否则使用术语“抗原”涵盖免疫原性蛋白质和免疫原性片段(诱导(或能够诱导)对(至少一种)冠状病毒的免疫反应的免疫原性片段)。应理解，术语“蛋白质”涵盖肽并且术语“抗原”涵盖抗原性片段。其他分子可为抗原性的，例如细菌多糖或蛋白质与多糖结构的组合，但对于本文所包括的病毒疫苗来说，病毒蛋白、病毒蛋白片段和源自β冠状病毒sars-cov-2的经设计和或突变的蛋白质是本文所提供的抗原。
[0064]
在一些实施方案中，本文提供的mrna包含编码变体三聚刺突蛋白的开放阅读框。在一些实施方案中，所述开放阅读框编码包含稳定化的融合前刺突蛋白的变体三聚刺突蛋白。在一些实施方案中，所述稳定化的融合前刺突蛋白包含双脯氨酸(s2p)突变。
[0065]
所述冠状病毒抗原和本公开的组合物中编码所述冠状病毒抗原的rna(例如mrna)的示例性序列提供于表1中。
[0066]
在一些实施方案中，组合物包含编码冠状病毒抗原的rna(例如mrna)和任选地脂质纳米颗粒，所述冠状病毒抗原包含与seq id no:5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、33、34、35、47、49、59、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或85中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，组合物包含编码冠状病毒抗原的rna(例如mrna)，所述冠状病毒抗原包含seq id no:29的序列。在一些实施方案中，组合物包含编码冠状病毒抗原的rna(例如mrna)，所述冠状病毒抗原包含seq id no:17的序列。在一些实施方案中，组合物包含编码冠状病毒抗原的rna(例如mrna)，所述冠状病毒抗原包含seq id no:20的序列。在一些实施方案中，组合物包含编码冠状病毒抗原的rna(例如mrna)，所述冠状病毒抗原包含seq id no:23的序列。在一些实施方案中，组合物包含编码冠状病毒抗原的rna(例如mrna)，所述冠状病毒抗原包含seq id no:26的序列。
[0067]
应理解，由本文所阐述的rna编码的抗原中的任一者可包含或可不包含信号序列。
[0068]
核酸
[0069]
本公开的组合物包含具有编码冠状病毒抗原(例如，变体三聚刺突蛋白，例如稳定化的融合前刺突蛋白)的开放阅读框(orf)的(至少一种)rna。在一些实施方案中，所述rna
是信使rna(mrna)。在一些实施方案中，所述rna(例如mrna)还包含5
′
utr、3
′
utr、多聚(a)尾和/或5
′
帽类似物。
[0070]
还应理解，本公开的冠状病毒疫苗可包括任何5
′
非翻译区(utr)和/或任何3
′
utr。示例性utr序列提供于序列表中(例如seq id no:2、36、4或37)；然而，可使用其他utr序列或用其交换本文所阐述的utr序列中的任一者。utr也可从本文所提供的rna多核苷酸中省略。
[0071]
核酸包含核苷酸(核苷酸单体)的聚合物。因此，核酸也称为多核苷酸。核酸可为或可包括例如脱氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、苏糖核酸(tna)、乙二醇核酸(gna)、肽核酸(pna)、锁核酸(lna，包括具有β-d-核糖构型的lna、具有α-l-核糖构型的α-lna(lna的非对映异构体)、具有2'-氨基官能化的2'-氨基-lna和具有2'-氨基官能化的2'-氨基-α-lna)、乙烯核酸(ena)、环己烯基核酸(cena)和/或其嵌合体和/或组合。
[0072]
信使rna(mrna)是编码(至少一种)蛋白质(天然存在、非天然存在或经修饰的氨基酸聚合物)的任何rna，并且可经翻译以在体外、体内、原位或离体产生所编码的蛋白质。本领域技术人员将了解，除非另有注明，否则本技术中所陈述的核酸序列可在代表性dna序列中列举“t”，但在所述序列代表rna(例如mrna)时，“t”将由“u”取代。因此，由本文中的特定序列识别号公开并识别的任何dna也公开与所述dna互补的相应rna(例如mrna)序列，其中所述dna序列的每个“t”被“u”取代。
[0073]
开放阅读框(orf)是以起始密码子(例如甲硫氨酸(atg或aug))开始并以终止密码子(例如taa、tag或tga，或uaa、uag或uga)结束的连续dna或rna区段。orf通常编码蛋白质。将理解，本文所公开的序列还可包含额外元件，例如5
′
和3
′
utr，但不同于orf，那些元件不一定存在于本公开的rna多核苷酸中。
[0074]
在一些实施方案中，组合物包含rna(例如mrna)，所述rna包含与seq id no:1、6、9、12、15、18、21、24、27、30、51、53、55、57、58、60或86-97中的任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的核苷酸序列。
[0075]
在一些实施方案中，组合物包含rna(例如mrna)，其包含orf，所述orf包含与seq id no:3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、48、50、52、54、56、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82或84中的任一者的核苷酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的核苷酸序列。
[0076]
变体
[0077]
在一些实施方案中，本公开的组合物包括编码冠状病毒抗原变体(例如，变体三聚刺突蛋白，例如稳定化的融合前刺突蛋白)的rna。抗原变体或其他多肽变体是指其氨基酸序列不同于野生型、天然或参照序列的分子。与天然或参照序列相比，抗原/多肽变体可在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与野生型、天然或参照序列具有至少50％的同一性。在一些实施方案中，变体与野生型、天然或参照序列共有至少80％或至少90％的同一性。
[0078]
由本公开的核酸编码的变体抗原/多肽可含有赋予许多所需性质中的任一者的氨基酸变化，例如增强其在受试者中的免疫原性、增强其表达和/或改进其稳定性或pk/pd性质。变体抗原/多肽可使用常规诱变技术制得并在适当时进行测定以确定其是否具有所需性质。确定表达水平和免疫原性的测定法是本领域中众所周知的，并且这些示例性测定法
陈述于实施例部分中。类似地，可使用业内公认的技术来测量蛋白质变体的pk/pd性质，例如通过测定抗原在接种疫苗的受试者中随时间推移的表达和/或通过观察所诱导免疫反应的持久性。由变体核酸编码的蛋白质的稳定性可通过测定热稳定性或尿素变性时的稳定性来测量，或者可使用计算机预测来测量。用于这些实验和计算机测定的方法是本领域中已知的。
[0079]
在一些实施方案中，组合物包含rna或rna orf，其包含本文所提供序列中的任一者的核苷酸序列(参见例如序列表和表1)，或包含与本文所提供序列中的任一者的核苷酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的核苷酸序列。
[0080]
术语“同一性”是指如通过对序列进行比较所确定，两个或更多个多肽(例如抗原)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系。同一性也指如通过两个或更多个氨基酸残基或核酸残基串之间的匹配数所确定的序列间的序列相关性程度。同一性测量两个或更多个序列中较小序列之间的相同匹配的百分比，其中空位比对(如果存在)通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)寻址。相关抗原或核酸的同一性可通过已知方法容易地计算。“同一性百分比(％)”在应用于多肽或多核苷酸序列时被定义为在比对序列并引入空位(必要时)以达到最大同一性百分比后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基(氨基酸残基或核酸残基)同一的残基的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域中众所周知的。应理解，同一性取决于对同一性百分比的计算，但其值可因在计算中所引入的空位和罚分而有所不同。通常，如通过本文所阐述并且为本领域技术人员所已知的序列比对程序和参数所确定，特定多核苷酸或多肽(例如抗原)的变体与特定参照多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列同一性。此类用于比对的工具包括blast套件的那些工具(stephen f.altschul等人(1997)，“gapped blast and psi-blast:a new generation of protein database search programs”,nucleic acids res.25:3389-3402)。另一种常用的局部比对技术是基于史密斯-沃特曼算法(smith-waterman algorithm)(smith,t.f.和waterman,m.s.(1981)“identification of common molecular subsequences.”j.mol.biol.147:195-197)。基于动态程序化的通用整体比对技术是尼德曼-翁施算法(needleman-wunsch algorithm)(needleman,s.b.和wunsch,c.d.(1970)“a general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.”j.mol.biol.48:443-453)。最近，已开发出快速最佳整体序列比对算法(fast optimal global sequence alignment algorithm,fogsaa)，据称，其较其他最佳整体比对方法(包括尼德曼-翁施算法)更快地产生对核苷酸和蛋白质序列的整体比对。
[0081]
因此，编码相对于参照序列、特别是本文所公开的多肽(例如抗原)序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包括在本公开的范围内。例如，可将序列标签或氨基酸(例如一个或多个赖氨酸)添加至肽序列(例如在n末端或c末端处)。序列标签可用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可用于增加肽溶解性或容许进行生物素化。或者，可任选地使位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基末端区域处的氨基酸残基缺失，从而提供截短序列。取决于序列的用途(如例如使序列表达为可溶性或连接至固体支持
物的较大序列的一部分)，某些氨基酸(例如c末端或n末端残基)可替代地缺失。在一些实施方案中，用于(或编码)信号序列、终止序列、跨膜结构域、接头、多聚化结构域(例如折叠子区)等的序列可被实现相同或相似功能的替代序列取代。在一些实施方案中，蛋白质核心中的空腔可被填充以改进稳定性，例如通过引入更大的氨基酸。在其他实施方案中，掩埋的氢键网络可被疏水性残基代替以改进稳定性。在其他实施方案中，可去除糖基化位点并用适当残基代替。本领域技术人员可容易地鉴定出此类序列。还应理解，本文所提供的一些序列含有序列标签或末端肽序列(例如在n末端或c末端处)，其可在例如用于rna(例如mrna)疫苗制剂中之前缺失。
[0082]
如本领域技术人员所公认，蛋白质片段、功能性蛋白质结构域和同源蛋白质也视为在目标冠状病毒抗原的范围内。例如，本文提供了参照蛋白质的任何蛋白质片段(意指比参照抗原序列短至少一个氨基酸残基，但其他方面同一的多肽序列)，条件是所述片段为免疫原性的并赋予对冠状病毒的保护性免疫反应。除与参照蛋白质同一但截短的变体以外，在一些实施方案中，如本文所提供或提及的任何序列中所示，抗原包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个突变。抗原/抗原性多肽的长度可在约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质范围内。
[0083]
稳定化元件
[0084]
除例如5'-帽结构或3'-多聚(a)尾的其他结构特征以外，天然存在的真核mrna分子也可含有稳定化元件，包括(但不限于)在其5'端(5'utr)和/或在其3'端(3'utr)的非翻译区(utr)。5'utr和3'utr两者通常都从基因组dna转录，并且是成熟前mrna的元件。成熟mrna的特征性结构特征(例如5'-帽和3'-多聚(a)尾)通常是在mrna加工期间添加至经转录(成熟前)的mrna。
[0085]
在一些实施方案中，组合物包括rna多核苷酸，其具有编码至少一种具有至少一个修饰、至少一个5'末端帽的抗原性多肽的开放阅读框，并且配制在脂质纳米颗粒内。可根据制造商方案，使用以下化学rna帽类似物在体外转录反应期间同时完成对多核苷酸的5'加帽以产生5'-鸟苷帽结构：3
′‑
o-me-m7g(5')ppp(5')g[arca帽]；g(5')ppp(5')a；g(5')ppp(5')g；m7g(5')ppp(5')a；m7g(5')ppp(5')g(new england biolabs,ipswich,ma)。可使用牛痘病毒加帽酶在转录后完成对经修饰rna的5'加帽，以产生“帽0”结构：m7g(5')ppp(5')g(new england biolabs,ipswich,ma)。可使用牛痘病毒加帽酶和2'-o甲基-转移酶两者来产生帽1结构，以产生：m7g(5')ppp(5')g-2'-o-甲基。可从帽1结构接着使用2'-o甲基-转移酶对5'-倒数第三核苷酸进行2'-o-甲基化来产生帽2结构。可从帽2结构接着使用2'-o甲基-转移酶对5'-倒数第四核苷酸进行2'-o-甲基化来产生帽3结构。酶可源自重组来源。
[0086]
3'-多聚(a)尾通常是添加至所转录mrna的3'端的腺嘌呤核苷酸区段。在一些情况中，其可包含至多约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，就个别mrna的稳定性而言，3'-多聚(a)尾的长度可为必不可少的要素。
[0087]
在一些实施方案中，组合物包括稳定化元件。稳定化元件可包括例如组蛋白茎环。已鉴定出一种茎环结合蛋白(slbp)，其为32kda的蛋白质。所述蛋白质与细胞核和细胞质两者中组蛋白信息的3'端处的组蛋白茎环缔合。其表达水平受细胞周期调控；其在s期期间达到峰值，此时组蛋白mrna水平也升高。已表明，所述蛋白质对于u7snrnp对组蛋白前mrna进行有效3'端加工必不可少。在加工后，slbp继续与茎环缔合，然后刺激成熟组蛋白mrna翻译成细胞质中的组蛋白。slbp的rna结合结构域在整个后生动物和原生动物中都是保守的；其
与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点包括相对于茎环的至少三个5'核苷酸和两个3
′
核苷酸。
[0088]
在一些实施方案中，rna(例如mrna)包括编码区、至少一个组蛋白茎环和任选地poly(a)序列或多聚腺苷酸化信号。所述poly(a)序列或多聚腺苷酸化信号通常应增强所编码蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，所编码的蛋白质不是组蛋白、报告蛋白(例如荧光素酶、gfp、egfp、β-半乳糖苷酶、egfp)或标志物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤:鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(gpt))。
[0089]
在一些实施方案中，rna(例如mrna)包括poly(a)序列或多聚腺苷酸化信号与至少一个组蛋白茎环的组合，尽管两者在自然界中代表替代机制，但其协同作用使蛋白质表达增加至超过任一个别元件所观察到的水平。poly(a)与至少一个组蛋白茎环的组合的协同效应不依赖于元件的次序或poly(a)序列的长度。
[0090]
在一些实施方案中，rna(例如mrna)不包括组蛋白下游元件(hde)。“组蛋白下游元件”(hde)包括在天然存在的茎环3'的富含嘌呤的大约15至20个核苷酸的多核苷酸区段，其代表参与将组蛋白前mrna加工为成熟组蛋白mrna的u7 snrna的结合位点。在一些实施方案中，核酸不包括内含子。
[0091]
rna(例如mrna)可含有或可不含有增强子和/或启动子序列，其可经修饰或未经修饰或其可经活化或灭活。在一些实施方案中，所述组蛋白茎环通常源自组蛋白基因，并且包括由间隔区(由短序列组成)分隔的两个相邻部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，其形成结构的环。未配对的环区通常无法与茎环元件中的任一者进行碱基配对。由于未配对的环区是许多rna二级结构的关键组分，因此其更常见于rna中，但也可存在于单链dna中。茎环结构的稳定性通常取决于长度、错配或膨出部的数目以及配对区的碱基组成。在一些实施方案中，可产生摆动碱基配对(非沃森-克里克(non-watson-crick)碱基配对)。在一些实施方案中，所述至少一个组蛋白茎环序列包含15至45个核苷酸长度。
[0092]
在一些实施方案中，rna(例如mrna)的一个或多个富含au的序列被去除。这些序列有时称为aures，其是在3'utr中发现的去稳定化序列。可将aures从rna疫苗中去除。或者，可使aures保留在rna疫苗中。
[0093]
信号肽
[0094]
在一些实施方案中，组合物包含rna(例如mrna)，其具有编码与冠状病毒抗原融合的信号肽的orf。信号肽包含蛋白质的n末端的15-60个氨基酸，其通常为在分泌途径上进行跨膜易位所需，并因此在真核生物和原核生物两者中普遍控制大多数蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白质(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗面内质网(er)膜，并起始生长中的肽链穿过er膜转运以进行加工。er加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常由宿主细胞的er驻留信号肽酶从前体蛋白质切割下来，或者它们保持未切割并起到膜锚的作用。信号肽也可有助于使蛋白质靶向细胞膜。
[0095]
信号肽的长度可为15-60个氨基酸。例如，信号肽的长度可为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸。在一些实施方案中，信号肽的长度为20-60、25-60、30-60、35-60、40-60、45-60、50-60、55-60、15-55、20-55、25-55、30-55、35-55、40-55、45-55、50-55、15-50、20-50、25-50、30-50、35-50、40-50、45-50、15-45、
20-45、25-45、30-45、35-45、40-45、15-40、20-40、25-40、30-40、35-40、15-35、20-35、25-35、30-35、15-30、20-30、25-30、15-25、20-25或15-20个氨基酸。
[0096]
来自异源基因的信号肽(其调控自然界中除冠状病毒抗原以外的基因的表达)是本领域中已知的，并且可测试其所需性质并且然后并入到本公开的核酸中。在一些实施方案中，所述信号肽可包含以下序列中的一者：mdskgssqkgsrlllllvvsnlllpqgvvg(seq id no:38)；mdwtwilflvaaatrvhs(seq id no:39)；metpaqllfllllwlpdttg(seq id no:40)；mlgsnsgqrvvftillllvapays(seq id no:41)；mkcllylaflfigvnca(seq id no:42)；mwlvslaivtacaga(seq id no:43)；或mfvflvllplvssqc(seq id no:99)。
[0097]
融合蛋白
[0098]
在一些实施方案中，本公开的组合物包括编码抗原性融合蛋白的rna(例如mrna)。因此，所编码的一种或多种抗原可包括接合在一起的两种或更多种蛋白质(例如蛋白质和/或蛋白质片段)。或者，与蛋白质抗原融合的蛋白质不促进对其自身的强免疫反应，而是促进对冠状病毒抗原的强免疫反应。在一些实施方案中，抗原性融合蛋白保留来自每个原始蛋白质的功能性质。
[0099]
支架部分
[0100]
在一些实施方案中，如本文所提供的rna(例如mrna)疫苗编码包含连接至支架部分的冠状病毒抗原的融合蛋白。在一些实施方案中，此类支架部分赋予由本公开的核酸所编码抗原所期望的性质。例如，支架蛋白可改进抗原的免疫原性，例如通过改变抗原的结构、改变抗原的摄取和加工和/或使抗原结合至结合伴侣。
[0101]
在一些实施方案中，所述支架部分是可自组装成高度对称、稳定且结构有序的蛋白质纳米颗粒的蛋白质，所述蛋白质纳米颗粒的直径为10-150nm，这是与免疫系统的各种细胞进行最佳相互作用高度适宜的大小范围。在一些实施方案中，可使用病毒蛋白或病毒样颗粒来形成稳定纳米颗粒结构。此类病毒蛋白的实例是本领域中已知的。例如，在一些实施方案中，所述支架部分是乙型肝炎表面抗原(hbsag)。hbsag形成平均直径为约22nm的球形颗粒，并且其缺乏核酸并因此不具传染性(lopez-sagaseta,j.等人,computational and structural biotechnology journal 14(2016)58-68)。在一些实施方案中，所述支架部分是自组装成直径为24-31nm的颗粒的乙型肝炎核心抗原(hbcag)，其类似于从hbv感染的人类肝脏获得的病毒核心。hbcag自组装产生为具有和直径的两类不同大小的纳米颗粒，对应于180或240个原体。在一些实施方案中，使冠状病毒抗原与hbsag或hbcag融合，以促进展示冠状病毒抗原的纳米颗粒的自组装。
[0102]
在一些实施方案中，可使用细菌蛋白质平台。这些自组装蛋白质的非限制性实例包括铁蛋白、2,4-二氧四氢蝶啶(lumazine)和包封蛋白(encapsulin)。
[0103]
铁蛋白是主要功能为细胞内铁储存的蛋白质。铁蛋白由24个亚基组成，其各自由四-α-螺旋束构成，所述亚基以具有八面体对称性的四级结构自组装(cho k.j.等人,j mol biol.2009；390:83-98)。已确定铁蛋白的若干种高分辨率结构，这证实幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori)铁蛋白是由24个相同原体组成，而在动物中，存在可单独组装或以不同比率组合成24个亚基颗粒的铁蛋白轻链和重链(granier t.等人,j biol inorg chem.2003；8:105-111；lawson d.m.等人,nature.1991；349:541-544)。铁蛋白自组装成具有稳固热和化学稳定性的纳米颗粒。因此，铁蛋白纳米颗粒非常适合携带并暴露抗原。
[0104]
2,4-二氧四氢蝶啶合酶(ls)也非常适合作为用于抗原展示的纳米颗粒平台。ls负责核黄素的生物合成中的倒数第二个催化步骤，其是存在于众多种生物体中的酶，包括古细菌、细菌、真菌、植物和真细菌(weber s.e.flavins and flavoproteins.methods and protocols,series:methods in molecular biology.2014)。ls单体长150个氨基酸，并且由β-折叠连同其两侧的串联α-螺旋组成。已报道ls的多种不同的四级结构，这说明其形态多样性：从同五聚体至形成直径为的衣壳的12个五聚体的对称组装体。甚至已阐述超过100个亚基的ls笼(zhang x.等人,j mol biol.2006；362:753-770)。
[0105]
包封蛋白是从嗜热生物海栖热袍菌(thermotoga maritima)分离出的新型蛋白质笼纳米颗粒，其也可用作在自组装纳米颗粒表面上呈递抗原的平台。包封蛋白是由60份相同的31kda单体组装而成，所述单体具有薄的二十面体t＝1对称笼状结构，其中内径和外径分别为20nm和24nm(sutter m.等人,nat struct mol biol.2008,15:939-947)。尽管尚未明确了解包封蛋白在海栖热袍菌中的确切功能，但其晶体结构最近已得到解决，并且其功能被假定为一种细胞区室，其可封装参与氧化应激反应的蛋白质如dyp(染料脱色过氧化酶)和flp(铁蛋白样蛋白)(rahmanpour r.等人,febs j.2013,280:2097-2104)。
[0106]
在一些实施方案中，本公开的rna编码与折叠子结构域融合的冠状病毒抗原(例如sars-cov-2 s蛋白)。所述折叠子结构域可例如从噬菌体t4次要纤维蛋白(fibritin)获得(参见例如tao y等人,structure.1997年6月15日；5(6):789-98)。
[0107]
接头和可切割肽
[0108]
在一些实施方案中，本公开的mrna编码一种以上多肽，其在本文中称为融合蛋白。在一些实施方案中，所述mrna进一步编码位于融合蛋白的至少一个或每个结构域之间的接头。所述接头可为例如可切割接头或蛋白酶敏感性接头。在一些实施方案中，所述接头选自由以下组成的组：f2a接头、p2a接头、t2a接头、e2a接头和它们的组合。这种自切割肽接头(称为2a肽)家族已在本领域中进行阐述(参见例如kim,j.h.等人,(2011)plos one 6:e18556)。在一些实施方案中，所述接头是f2a接头。在一些实施方案中，所述接头是gggs(seq id no:98)接头。在一些实施方案中，所述融合蛋白含有具有中间接头的三个结构域，其具有如下结构：结构域-接头-结构域-接头-结构域。
[0109]
本领域中已知的可切割接头可结合本公开使用。此类示例性接头包括：f2a接头、t2a接头、p2a接头、e2a接头(参见例如wo2017/127750)。本领域技术人员将了解，其他业内公认的接头可适用于本公开的构建体中(例如由本公开的核酸编码)。本领域技术人员将同样了解，其他多顺反子构建体(在同一分子内分别编码一种以上抗原/多肽的mrna)可适于如本文所提供的用途。
[0110]
序列优化
[0111]
在一些实施方案中，使编码本公开抗原的orf经密码子优化。密码子优化方法是本领域中已知的。例如，可使本文所提供序列中的任何一者或多者的orf经密码子优化。在一些实施方案中，密码子优化可用于匹配靶标和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏置gc含量以增加mrna稳定性或减少二级结构；使可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基操作最小化；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质输送序列；在编码蛋白质中去除/添加翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制位点；修饰核糖体结合位点和mrna降解位点；调整翻译速率以容许蛋白质
的各个结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域中已知的，非限制性实例包括来自geneart(life technologies)、dna2.0(menlo park ca)和/或专有方法的服务。在一些实施方案中，使用优化算法使开放阅读框(orf)序列优化。
[0112]
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列orf(例如编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共有小于95％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共有小于90％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共有小于85％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共有小于80％的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共有小于75％的序列同一性。
[0113]
在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共有介于65％与85％之间(例如介于约67％与约85％之间或介于约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施方案中，密码子优化的序列与天然存在或野生型序列(例如编码冠状病毒抗原的天然存在或野生型mrna序列)共有介于65％与75％或约80％之间的序列同一性。
[0114]
在一些实施方案中，密码子优化的序列编码的抗原与非密码子优化的序列编码的冠状病毒抗原具有相同免疫原性，或其免疫原性比非密码子优化的序列编码的冠状病毒抗原高(例如高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％)。
[0115]
当转染至哺乳动物宿主细胞中时，经修饰的mrna具有介于12-18小时之间或大于18小时(例如24、36、48、60、72或大于72小时)的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
[0116]
在一些实施方案中，密码子优化的rna可为其中g/c水平增强的rna。核酸分子(例如mrna)的g/c含量可影响rna的稳定性。鸟嘌呤(g)和/或胞嘧啶(c)残基量增加的rna可在功能上比含有大量腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)核苷酸的rna更稳定。举例来说，wo02/098443公开了一种药物组合物，其含有通过翻译区中的序列修饰而稳定化的mrna。由于遗传密码的简并性，所述修饰通过用现有密码子取代促进更高rna稳定性而不改变所得氨基酸的那些密码子来发挥作用。所述方法限于rna的编码区。
[0117]
未经化学修饰的核苷酸
[0118]
在一些实施方案中，rna(例如mrna)未经化学修饰，并且包含由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准核苷残基，例如存在于所转录rna中的那些残基(例如a、g、c或u)。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含标准脱氧核糖核苷，例如存在于dna中的那些脱氧核糖核苷(例如da、dg、dc或dt)。
[0119]
化学修饰
[0120]
在一些实施方案中，本公开的组合物包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的
rna，其中核酸包含可为标准(未经修饰)或如本领域中所已知经修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施方案中，本公开的核苷酸和核苷包含经修饰的核苷酸或核苷。此类经修饰的核苷酸和核苷可为经修饰的天然存在的核苷酸和核苷或经修饰的非天然存在的核苷酸和核苷。此类修饰可包括如本领域中所公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分处的那些修饰。
[0121]
在一些实施方案中，本公开的经修饰的天然存在的核苷酸或核苷是如本领域中所通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类经修饰的天然存在的核苷酸和核苷的非限制性实例可尤其见于广泛认可的modomics数据库中。
[0122]
在一些实施方案中，本公开的经修饰的非天然存在的核苷酸或核苷是如本领域中所通常已知或公认的核苷酸或核苷。此类经修饰的非天然存在的核苷酸和核苷的非限制性实例可尤其见于如下已公开的美国申请第pct/us2012/058519号；第pct/us2013/075177号；第pct/us2014/058897号；第pct/us2014/058891号；第pct/us2014/070413号；第pct/us2015/36773号；第pct/us2015/36759号；第pct/us2015/36771号；或第pct/ib2017/051367号，所有所述申请均通过引用并入本文。
[0123]
因此，本公开的核酸(例如dna核酸和rna核酸，例如mrna核酸)可包含标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。
[0124]
在一些实施方案中，本公开的核酸(例如dna核酸和rna核酸，例如mrna核酸)包含各种(一种以上)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施方案中，核酸的特定区域含有一个、两个或更多个(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。
[0125]
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入到细胞或生物体中的经修饰的rna核酸(例如经修饰的mrna核酸)分别在所述细胞或生物体中表现出降低的降解。
[0126]
在一些实施方案中，相对于包含标准核苷酸和核苷的未经修饰的核酸，引入到细胞或生物体中的经修饰的rna核酸(例如经修饰的mrna核酸)可分别在所述细胞或生物体中表现出降低的免疫原性(例如降低的先天性反应)。
[0127]
在一些实施方案中，核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)包含非天然修饰的核苷酸，其是在核酸的合成期间或合成后引入，以实现所需功能或性质。所述修饰可存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可利用化学合成或利用聚合酶在链末端或链中的任何其他位置处引入。核酸中的任何区域都可经化学修饰。
[0128]
本公开提供了核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)的组合的化合物。“核苷酸”是指包括磷酸基的核苷。经修饰的核苷酸可通过任何可用方法(例如化学、酶促或重组地)来合成，以包括一个或多个经修饰或非天然的核苷。核酸可包含一个或多个连接的核苷区域。此类区域可具有可变的主链键联。所述键联可为标准磷酸二酯键联，在这种情况下，核酸将包含核苷酸区域。
[0129]
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，并且还涵盖在核苷酸和/或包含非标准或经修饰碱基的经修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基与标准碱基之间或在两个互补非标准碱基结构之间(例如在具有至少一个化学修饰的那些核酸中)形成氢键。这种非
标准碱基配对的一个实例是在经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可并入到本公开的核酸中。
[0130]
在一些实施方案中，核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)中的经修饰的核碱基包含1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(e1ψ)、5-甲氧基-尿苷(mo5u)、5-甲基-胞苷(m5c)和/或假尿苷(ψ)。在一些实施方案中，核酸(例如rna核酸，例如mrna核酸)中的经修饰的核碱基包含5-甲氧基甲基尿苷、5-甲硫基尿苷、1-甲氧基甲基假尿苷、5-甲基胞苷和/或5-甲氧基胞苷。在一些实施方案中，多聚核糖核苷酸包括上文所提及的任何经修饰核碱基中的至少两者(例如2者、3者、4者或更多者)的组合，包括(但不限于)化学修饰。
[0131]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代。
[0132]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的1-甲基-假尿苷(m1ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
[0133]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代。
[0134]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的假尿苷(ψ)取代和在核酸的一个或多个或所有胞苷位置处的5-甲基胞苷取代。
[0135]
在一些实施方案中，本公开的mrna包含在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处的尿苷。
[0136]
在一些实施方案中，mrna统一经修饰(例如完全修饰、贯穿整个序列中修饰)以获得特定修饰。例如，核酸可统一经1-甲基-假尿苷修饰，这意味着mrna序列中的所有尿苷残基均用1-甲基-假尿苷代替。类似地，可针对序列中所存在的任何类型的核苷残基对核酸进行统一修饰，其是通过用经修饰的残基(例如上文所陈述的那些残基)进行代替来实施。
[0137]
本公开的核酸可沿着整个分子长度部分或完全地修饰。例如，在本公开的核酸中或在其预定序列区域中(例如在包括或不包括多聚(a)尾的mrna中)，一个或多个或全部或给定类型的核苷酸(例如嘌呤或嘧啶，或a、g、u、c中的任何一者或多者或全部)可统一经修饰。在一些实施方案中，本公开的核酸中(或其序列区域中)的所有核苷酸x都是经修饰的核苷酸，其中x可为核苷酸a、g、u、c中的任一者，或组合a+g、a+u、a+c、g+u、g+c、u+c、a+g+u、a+g+c、g+u+c或a+g+c中的任一者。
[0138]
核酸可含有约1％至约100％的经修饰核苷酸(相对于总核苷酸含量，或相对于一种或多种类型的核苷酸，即a、g、u或c中的任何一者或多者)或任何中间百分比(例如1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％和95％至100％)。将理解，任何剩余的百分比是由存在未经修饰的a、g、u或c引起。
[0139]
mrna可含有最少1％且最多100％的经修饰核苷酸，或任何中间百分比，例如至少5％的经修饰核苷酸、至少10％的经修饰核苷酸、至少25％的经修饰核苷酸、至少50％的经
修饰核苷酸、至少80％的经修饰核苷酸或至少90％的经修饰核苷酸。例如，核酸可含有经修饰的嘧啶，例如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶由经修饰的尿嘧啶(例如5-取代的尿嘧啶)代替。经修饰的尿嘧啶可由具有单一独特结构的化合物代替，或者可由多种具有不同结构(例如2、3、4或更多种独特结构)的化合物代替。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶由经修饰的胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶)代替。经修饰的胞嘧啶可由具有单一独特结构的化合物代替，或者可由多种具有不同结构(例如2、3、4或更多种独特结构)的化合物代替。
[0140]
非翻译区(utr)
[0141]
本公开的mrna可包含一个或多个充当非翻译区或起到非翻译区作用的区域或部分。倘若mrna经设计以编码至少一种目标抗原，则核酸可包含这些非翻译区(utr)中的一者或多者。核酸的野生型非翻译区经转录但不翻译。在mrna中，5'utr起始于转录起始位点并延续至起始密码子但不包括起始密码子；而3'utr紧接着终止密码子起始并延续至转录终止信号。越来越多的证据表明，utr在核酸分子的稳定性和翻译方面起调控作用。可将utr的调控性特征并入到本公开的多核苷酸中，以尤其增强分子的稳定性。也可并入所述特定特征，以确保转录本在错引导至不期望的器官位点时使其受控下调。本领域中已知并且可获得多种5'utr和3'utr序列。
[0142]5′
utr是位于起始密码子(由核糖体翻译的mrna转录本的第一个密码子)正上游(5
′
)的mrna区域。5
′
utr不编码蛋白质(是非编码的)。天然5'utr具有在翻译起始中起作用的特征。它们带有印记如kozak序列，众所周知所述序列与核糖体启动许多基因翻译的过程有关。kozak序列具有共有ccr(a/g)ccaugg(seq id no:44)，其中r是在起始密码子(aug)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，所述起始密码子(aug)后接另一个
‘
g’。还已知5'utr形成参与延长因子结合的二级结构。
[0143]
在本公开的一些实施方案中，5'utr是异源性utr，即是在自然界中发现的与不同orf缔合的utr。在另一个实施方案中，5'utr是合成性utr，即不存在于自然界中。合成性utr包括已经突变以改进其性质的utr，例如增加基因表达的utr以及完全合成的那些utr。示例性5'utr包括爪蟾(xenopus)或人类源性a-球蛋白或b-球蛋白(8278063；9012219)、人类细胞色素b-245a多肽和羟基类固醇(17b)脱氢酶以及烟草蚀纹病毒(us8278063、9012219)。也可使用cmv即刻早期1(ie1)基因(us2014/0206753、wo2013/185069)、序列gggauccuacc(seq id no:45)(wo2014144196)。在另一个实施方案中，top基因的5'utr是缺少5'top基序(寡嘧啶带)的top基因的5'utr(例如wo/2015/101414、wo2015/101415、wo/2015/062738、wo2015/024667、wo2015/024667)；可使用源自核糖体蛋白质大32(l32)基因的5'utr元件(wo/2015/101414、wo2015/101415、wo/2015/062738)、源自羟基类固醇(17-β)脱氢酶4基因(hsd17b4)的5'utr的5'utr元件(wo2015/024667)或源自atp5a1的5'utr的5'utr元件(wo2015/024667)。在一些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(ires)代替5'utr。
[0144]
在一些实施方案中，本公开的5'utr包含选自seq id no:2和seq id no:36的序列。
[0145]3′
utr是位于终止密码子(mrna转录本中发出终止翻译信号的密码子)正下游(3
′
)的mrna区域。3
′
utr不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3'utr中内嵌有腺苷和
尿苷区段。这些富含au的印记在具有高更替率的基因中尤为普遍。基于其序列特征和功能性质，可将富含au的元件(are)分成三类(chen等人,1995):i类are在u富集区内含有auuua基序的若干个分散拷贝。c-myc和myod含有i类are。ii类are具有两个或更多个重叠uuauuua(u/a)(u/a)(seq id no:46)九聚体。含有这种类型的are的分子包括gm-csf和tnf-a。iii类ares的定义较不明确。这些u富集区不含auuua基序。c-jun和myogenin是这种类别的两个充分研究的实例。已知大多数结合至are的蛋白质使信使不稳定，而elav家族的成员(最著名的是hur)已被证明增加mrna的稳定性。hur结合至所有三个类别的are。将hur特异性结合位点工程化至核酸分子的3'utr中将导致hur结合，并且由此使体内信息稳定化。
[0146]
引入、去除或修饰3'utr富含au的元件(are)可用于调节本公开的核酸(例如rna)的稳定性。当工程化特定核酸时，可引入一个或多个are拷贝以使本公开的核酸较不稳定，并且由此缩减翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，可鉴定并去除are或使其突变以增加细胞内稳定性，并由此增加所得蛋白质的翻译和产生。使用本公开的核酸，可在相关细胞系中进行转染实验，并且可在转染后的各个时间点对蛋白质产生进行测定。例如，可利用不同are工程化分子转染细胞，并且通过使用针对相关蛋白质的elisa试剂盒并测定在转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。
[0147]3′
utr可为异源的或合成的。关于3'utr，球蛋白utr(包括爪蟾β-球蛋白utr和人类β-球蛋白utr)是本领域中已知的(8278063、9012219、us2011/0086907)。通过从头至尾克隆两个连续人类β-球蛋白3'utr，已开发出在一些细胞类型中具有增强的稳定性的经修饰的β-球蛋白构建体，并且是本领域中众所周知的(us2012/0195936、wo2014/071963)。另外，a2-球蛋白、a1-球蛋白、utr和其突变体也是本领域中已知的(wo2015/101415、wo2015/024667)。在非专利文献中的mrna构建体中所描述的其他3
′
utr包括cyba(ferizi等人,2015)和白蛋白(thess等人,2015)。其他示例性3
′
utr包括牛或人类生长激素(野生型或经修饰)的3'utr(wo2013/185069、us2014/0206753、wo2014152774)，兔β球蛋白和乙型肝炎病毒(hbv)、α-球蛋白3'utr和病毒veev 3'utr序列也是本领域中已知的。在一些实施方案中，使用序列uuugaauu(wo2014/144196)。在一些实施方案中，使用人类和小鼠核糖体蛋白质的3
′
utr。其他实例包括rps9 3'utr(wo2015/101414)、fig4(wo2015/101415)和人类白蛋白7(wo2015/101415)。
[0148]
在一些实施方案中，本公开的3
′
utr包含选自seq id no:4和seq id no:37的序列。
[0149]
本领域普通技术人员将理解，异源性或合成性5'utr可与任何期望的3'utr序列一起使用。例如，异源性5'utr可与合成性3'utr和异源性3'utr一起使用。
[0150]
非utr序列也可用作核酸内的区域或亚区。例如，可将内含子或内含子序列的一部分并入到本公开核酸的区域中。并入内含子序列可增加蛋白质产生以及核酸水平。
[0151]
特征的组合可包括在侧接区域中并且可含于其他特征内。例如，orf可侧接有5'utr(其可含有强kozak翻译起始信号)和/或3'utr(其可包括用于模板化添加多聚a尾的寡(dt)序列)。5
′
utr可包含来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，例如美国专利申请公开第2010/0293625号和pct/us2014/069155中所阐述的5
′
utr，所述专利是通过引用整体并入本文。
[0152]
应理解，来自任何基因的任何utr都可并入到核酸的区域中。此外，可利用任何已
知基因的多种野生型utr。提供不为野生型区域变体的人工utr也在本公开的范围内。可将这些utr或其部分以与在从中选择其的转录本相同的定向放置，或者可改变其定向或位置。因此，5'或3'utr可倒置、缩短、加长、用一个或多个其他5'utr或3'utr制得。如本文所用，术语“经改变”在涉及utr序列时，意指utr相对于参照序列已以某种方式改变。例如，3'utr或5'utr可如上文所教导通过改变定向或位置而相对于野生型或天然utr发生改变，或者可通过纳入额外核苷酸、使核苷酸缺失、使核苷酸交换或转座而发生改变。产生“经改变”utr(无论3'或5')的这些变化中的任一者构成变体utr。
[0153]
在一些实施方案中，可使用双重、三重或四重utr(例如5'utr或3'utr)。如本文所用，“双重”utr是两个相同utr拷贝串联或基本上串联编码的utr。例如，可如美国专利公开2010/0129877中所阐述使用双β-球蛋白3'utr，所述专利公开的内容是通过引用整体并入本文。
[0154]
模式化的utr也在本公开的范围内。如本文所用，“模式化utr”是反映重复或交替模式的那些utr，例如重复一次、两次或3次以上的ababab或aabbaabbaabb或abcabcabc或其变体。在这些模式中，每个字母a、b或c代表核苷酸水平上的不同utr。
[0155]
在一些实施方案中，侧接区域选自其蛋白质共有共同功能、结构、特征或性质的转录本家族。例如，目标多肽可属于在特定细胞、组织中或有时在发育期间表达的蛋白质家族。可将来自这些基因中的任一者的utr换成相同或不同蛋白质家族的任何其他utr，以产生新的多核苷酸。如本文所用，“蛋白质家族”是以最广泛意义使用，其指一组共有至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的两种或更多种目标多肽。
[0156]
非翻译区也可包括翻译增强子元件(tee)。作为非限制性实例，tee可包括通过引用整体并入本文的美国申请第2009/0226470号中所阐述的那些tee，和本领域中已知的那些tee。
[0157]
rna的体外转录
[0158]
可使用体外转录(ivt)系统来转录编码本文所阐述多核苷酸的cdna。rna的体外转录是本领域中已知的并且阐述于国际公开wo 2014/152027中，所述公开是通过引用整体并入本文。在一些实施方案中，本公开的rna是根据wo 2018/053209和wo 2019/036682中所阐述方法中的任何一者或多者来制备，所述专利各自是通过引用并入本文。
[0159]
在一些实施方案中，使用未扩增的线性化dna模板，在用以产生rna转录本的体外转录反应中来产生rna转录本。在一些实施方案中，模板dna是经分离的dna。在一些实施方案中，模板dna是cdna。在一些实施方案中，通过rna多核苷酸(例如(但不限于)冠状病毒mrna)的逆转录来形成cdna。在一些实施方案中，使细胞(例如细菌细胞，例如大肠杆菌(e.coli)，例如dh-1细胞)经质粒dna模板转染。在一些实施方案中，培养经转染的细胞以复制质粒dna，然后将其分离并纯化。在一些实施方案中，dna模板包括rna聚合酶启动子，例如位于目标基因的5'并与其可操作地连接的t7启动子。
[0160]
在一些实施方案中，体外转录模板编码5'非翻译(utr)区，含有开放阅读框，并且编码3'utr和多聚(a)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于所述模板所编码的mrna。
[0161]“5'非翻译区”(utr)是指位于起始密码子(即由核糖体翻译的mrna转录本的第一个密码子)正上游(即5
′
)的不编码多肽的mrna区域。当产生rna转录本时，5'utr可包含启动
子序列。此类启动子序列是本领域中已知的。应理解，此类启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。
[0162]“3'非翻译区”(utr)是指位于终止密码子(即mrna转录本中发出终止翻译信号的密码子)正下游(即3
′
)的不编码多肽的mrna区域。
[0163]“开放阅读框”是以起始密码子(例如甲硫氨酸(atg))开始，并且以终止密码子(例如taa、tag或tga)结束并编码多肽的连续dna区段。
[0164]“多聚(a)尾”是位于3'utr下游(例如正下游(即3'))的含有多个连续单磷酸腺苷的mrna区域。多聚(a)尾可含有10至300个单磷酸腺苷。例如，多聚(a)尾可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施方案中，多聚(a)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关生物学环境中(例如在细胞中、在体内)，多聚(a)尾起保护mrna免受酶促降解(例如在细胞质中)的作用，并且有助于转录终止和/或mrna从细胞核的输出和翻译。
[0165]
在一些实施方案中，核酸包括200至3,000个核苷酸。例如，核酸可包括200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000、或2000至3000个核苷酸。
[0166]
体外转录系统通常包含转录缓冲液、核苷酸三磷酸(ntp)、rna酶抑制剂和聚合酶。
[0167]
所述ntp可在内部制造，可从供应商选择，或者可如本文所阐述进行合成。所述ntp可选自(但不限于)本文所阐述的那些ntp，包括天然和非天然(经修饰)ntp。
[0168]
许多rna聚合酶或变体可用于本公开的方法中。所述聚合酶可选自(但不限于)噬菌体rna聚合酶，例如t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、sp6 rna聚合酶和/或突变体聚合酶，例如(但不限于)能够并入经修饰核酸和/或经修饰核苷酸(包括化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。一些实施方案排除dna酶的使用。
[0169]
在一些实施方案中，经由酶促加帽使rna转录本加帽。在一些实施方案中，所述rna包含5'末端帽，例如7mg(5')ppp(5')nlmpnp。
[0170]
化学合成
[0171]
固相化学合成。本公开的核酸可使用固相技术全部或部分地制造。核酸的固相化学合成是自动化方法，其中将分子固定在固体支持物上并且在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于在核酸序列中位点特异性引入化学修饰。
[0172]
液相化学合成。通过依序添加单体构建单元来合成本公开的核酸可在液相中进行。
[0173]
合成方法的组合。上文所论述的合成方法各自具有其自身的优点和局限性。已尝试将这些方法组合以克服局限性。此类方法组合在本公开的范围内。使用固相或液相化学合成与酶促连接的组合提供有效产生无法通过单独的化学合成获得长链核酸的方式。
[0174]
核酸区域或亚区的连接
[0175]
还可使用通过连接酶组装核酸。dna或rna连接酶经由形成磷酸二酯键而促进多核苷酸链的5'和3'端的分子间连接。可通过连接一个或多个区域或亚区来制备例如嵌合多核苷酸和/或环状核酸的核酸。dna片段可通过连接酶催化的反应而接合，以产生具有不同功能的重组dna。两个寡脱氧核苷酸(一个具有5'磷酰基并且另一个具有游离3'羟基)用作dna
连接酶的底物。
[0176]
纯化
[0177]
本文所阐述核酸的纯化可包括(但不限于)核酸清除、质量保证和质量控制。清除可通过本领域中已知的方法来实施，例如(但不限于)珠粒(beckman coulter genomics,danvers,ma)、聚t珠粒、lnatm寡t捕获探针(inc,vedbaek,denmark)或基于hplc的纯化方法，例如(但不限于)强阴离子交换hplc、弱阴离子交换hplc、反相hplc(rp-hplc)和疏水性相互作用hplc(hic-hplc)。术语“经纯化”在关于核酸使用时(例如“经纯化的核酸”)是指与至少一种污染物分离的核酸。“污染物”是使另一物质不合格、不纯或劣质的任何物质。因此，经纯化的核酸(例如dna和rna)是以不同于其在自然界中所发现的形式或环境存在，或以不同于使其经受处理或纯化方法之前所存在的形式或环境存在。
[0178]
可使用例如(但不限于)凝胶电泳、uv吸光度或分析型hplc的方法来进行质量保证和/或质量控制检查。
[0179]
在一些实施方案中，可通过包括(但不限于)逆转录酶-pcr的方法对核酸进行测序。
[0180]
量化
[0181]
在一些实施方案中，本公开的核酸可在外泌体中或在源自一种或多种体液时进行量化。体液包括外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(csf)、痰液、唾液、骨髓、滑液、水样液、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper's fluid)或预射精液、汗液、粪便物、毛发、泪液、囊肿液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间隙液、月经、脓、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、来自窦腔的灌洗液、支气管肺抽吸物、胚泡腔液和脐带血。或者，可从选自由以下组成的组的器官中获取外泌体：肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾脏、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳房、前列腺、脑、食管、肝脏和胎盘。
[0182]
可使用构建体特异性探针、血细胞计数法、qrt-pcr、实时pcr、pcr、流式细胞术、电泳、质谱或其组合来实施测定，而外泌体可使用例如酶联免疫吸附测定(elisa)方法的免疫组织化学方法来分离。外泌体也可通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸收剂捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离。
[0183]
这些方法使得研究人员能够实时监测剩余或递送的核酸的水平。这是可能的，因为在一些实施方案中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而与内源性形式不同。
[0184]
在一些实施方案中，可使用例如(但不限于)紫外可见光谱法(uv/vis)的方法对核酸进行量化。uv/vis光谱仪的非限制性实例是光谱仪(thermofisher,waltham,ma)。可对量化的核酸进行分析，以确定所述核酸是否可具有适当大小，检查有没有发生核酸降解。可通过例如(但不限于)以下的方法来检查核酸的降解：琼脂糖凝胶电泳、基于hplc的纯化方法(例如(但不限于)强阴离子交换hplc、弱阴离子交换hplc、反相hplc(rp-hplc)和疏水性相互作用hplc(hic-hplc))、液相色谱-质谱(lcms)、毛细管电泳(ce)和毛细管凝胶电泳(cge)。
[0185]
脂质纳米颗粒(lnp)
[0186]
在一些实施方案中，将本公开的rna(例如mrna)配制在脂质纳米颗粒(lnp)中。脂质纳米颗粒通常包含可电离的阳离子脂质、非阳离子脂质、固醇和peg脂质组分以及目标核酸货物。可使用如本领域中通常已知的组分、组合物和方法来产生本公开的脂质纳米颗粒，参见例如pct/us2016/052352；pct/us2016/068300；pct/us2017/037551；pct/us2015/027400；pct/us2016/047406；pct/us2016000129；pct/us2016/014280；pct/us2016/014280；pct/us2017/038426；pct/us2014/027077；pct/us2014/055394；pct/us2016/52117；pct/us2012/069610；pct/us2017/027492；pct/us2016/059575和pct/us2016/069491，其全部通过引用整体并入本文。
[0187]
通常将本公开的疫苗配制在脂质纳米颗粒中。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含至少一种可电离的阳离子脂质、至少一种非阳离子脂质、至少一种固醇和/或至少一种聚乙二醇(peg)修饰的脂质。
[0188]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离的阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含20-50mol％、20-40mol％、20-30mol％、30-60mol％、30-50mol％、30-40mol％、40-60mol％、40-50mol％或50-60mol％可电离的阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20mol％、30mol％、40mol％、50mol％或60mol％可电离的阳离子脂质。
[0189]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5-25mol％非阳离子脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5-20mol％、5-15mol％、5-10mol％、10-25mol％、10-20mol％、10-25mol％、15-25mol％、15-20mol％或20-25mol％非阳离子脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5mol％、10mol％、15mol％、20mol％或25mol％非阳离子脂质。
[0190]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含25-55mol％固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含25-50mol％、25-45mol％、25-40mol％、25-35mol％、25-30mol％、30-55mol％、30-50mol％、30-45mol％、30-40mol％、30-35mol％、35-55mol％、35-50mol％、35-45mol％、35-40mol％、40-55mol％、40-50mol％、40-45mol％、45-55mol％、45-50mol％或50-55mol％固醇。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含25mol％、30mol％、35mol％、40mol％、45mol％、50mol％或55mol％固醇。
[0191]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％peg修饰的脂质。例如，所述脂质纳米颗粒可包含0.5-10mol％、0.5-5mol％、1-15mol％、1-10mol％、1-5mol％、2-15mol％、2-10mol％、2-5mol％、5-15mol％、5-10mol％或10-15mol％peg修饰的脂质。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含0.5mol％、1mol％、2mol％、3mol％、4mol％、5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％peg修饰的脂质。
[0192]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含20-60mol％可电离的阳离子脂质、5-25mol％非阳离子脂质、25-55mol％固醇和0.5-15mol％peg修饰的脂质。
[0193]
在一些实施方案中，本公开的可电离的阳离子脂质包含式(i)化合物：
[0194][0195]
或其盐或异构体，其中：
[0196]
r1选自由以下组成的组：c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr”、-yr”和-r”m'r'；
[0197]
r2和r3独立地选自由以下组成的组：h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr”、-yr”和-r*or”，或者r2和r3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
[0198]
r4选自由以下组成的组：c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取代的c
1-6
烷基，其中q选自碳环、杂环、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-n(r)2、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和
–
c(r)n(r)2c(o)or，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
[0199]
每个r5独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0200]
每个r6独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0201]
m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-n(r')c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or')o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0202]
r7选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0203]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0204]
r9选自由以下组成的组：h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环；
[0205]
每个r独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0206]
每个r'独立地选自由以下组成的组：c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr”、-yr”和h；
[0207]
每个r”独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0208]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0209]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0210]
每个x独立地选自由以下组成的组：f、cl、br和i；并且
[0211]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13。
[0212]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括如下的那些化合物：当r4是-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr或-cq(r)2时，则(i)在n为1、2、3、4或5时，q不为-n(r)2，或(ii)在n为1或2时，q不为5元、6元或7元杂环烷基。
[0213]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括如下的那些化合物：
[0214]
r1选自由以下组成的组：c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr”、-yr”和-r”m'r'；
[0215]
r2和r3独立地选自由以下组成的组：h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr”、-yr”和-r*or”，或者r2和r3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
[0216]
r4选自由以下组成的组：c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取
代的c
1-6
烷基，其中q选自c
3-6
碳环、具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5元至14元杂芳基、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-crn(r)2c(o)or、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5元至14元杂环烷基，其被一个或多个选自氧代基(＝o)、oh、氨基、单烷基氨基或二烷基氨基和c
1-3
烷基的取代基取代，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
[0217]
每个r5独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0218]
每个r6独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0219]
m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-n(r')c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or')o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0220]
r7选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0221]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0222]
r9选自由以下组成的组：h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环；
[0223]
每个r独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0224]
每个r'独立地选自由以下组成的组：c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr”、-yr”和h；
[0225]
每个r”独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0226]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0227]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0228]
每个x独立地选自由以下组成的组：f、cl、br和i；并且
[0229]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0230]
或其盐或异构体。
[0231]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括如下的那些化合物：
[0232]
r1选自由以下组成的组：c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr”、-yr”和-r”m'r'；
[0233]
r2和r3独立地选自由以下组成的组：h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr”、-yr”和-r*or”，或者r2和r3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
[0234]
r4选自由以下组成的组：c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取代的c
1-6
烷基，其中q选自c
3-6
碳环、具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5元至14元杂环、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-crn(r)2c(o)or、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和-c(＝nr9)n(r)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；并且当q是5元至14元杂环并且(i)r4是-(ch2)nq，其中n是1或2，或(ii)r4是-(ch2)nchqr，其中n是1，或(iii)r4是-chqr和-cq(r)2时，则q是5元至14元杂芳基或8元至14元杂环烷基；
[0235]
每个r5独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0236]
每个r6独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0237]
m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-n(r')c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or')o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0238]
r7选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0239]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0240]
r9选自由以下组成的组：h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环；
[0241]
每个r独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0242]
每个r'独立地选自由以下组成的组：c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr”、-yr”和h；
[0243]
每个r”独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0244]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0245]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0246]
每个x独立地选自由以下组成的组：f、cl、br和i；并且
[0247]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0248]
或其盐或异构体。
[0249]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括如下的那些化合物：
[0250]
r1选自由以下组成的组：c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr”、-yr”和-r”m'r'；
[0251]
r2和r3独立地选自由以下组成的组：h、c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr”、-yr”和-r*or”，或者r2和r3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
[0252]
r4选自由以下组成的组：c
3-6
碳环、-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr、-cq(r)2和未被取代的c
1-6
烷基，其中q选自c
3-6
碳环、具有一个或多个选自n、o和s的杂原子的5元至14元杂芳基、-or、-o(ch2)nn(r)2、-c(o)or、-oc(o)r、-cx3、-cx2h、-cxh2、-cn、-c(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)c(o)n(r)2、-n(r)c(s)n(r)2、-crn(r)2c(o)or、-n(r)r8、-o(ch2)nor、-n(r)c(＝nr9)n(r)2、-n(r)c(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、-n(or)c(o)r、-n(or)s(o)2r、-n(or)c(o)or、-n(or)c(o)n(r)2、-n(or)c(s)n(r)2、-n(or)c(＝nr9)n(r)2、-n(or)c(＝chr9)n(r)2、-c(＝nr9)r、-c(o)n(r)or和-c(＝nr9)n(r)2，并且每个n独立地选自1、2、3、4和5；
[0253]
每个r5独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0254]
每个r6独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0255]
m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-n(r')c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or')o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0256]
r7选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0257]
r8选自由c
3-6
碳环和杂环组成的组；
[0258]
r9选自由以下组成的组：h、cn、no2、c
1-6
烷基、-or、-s(o)2r、-s(o)2n(r)2、c
2-6
烯基、c
3-6
碳环和杂环；
[0259]
每个r独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0260]
每个r'独立地选自由以下组成的组：c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr”、-yr”和h；
[0261]
每个r”独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0262]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
2-12
烯基组成的组；
[0263]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0264]
每个x独立地选自由以下组成的组：f、cl、br和i；并且
[0265]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0266]
或其盐或异构体。
[0267]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括如下的那些化合物：
[0268]
r1选自由以下组成的组：c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr”、-yr”和-r”m'r'；
[0269]
r2和r3独立地选自由以下组成的组：h、c
2-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr”、-yr”和-r*or”，或者r2和r3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
[0270]
r4是-(ch2)nq或-(ch2)nchqr，其中q是-n(r)2，并且n选自3、4和5；
[0271]
每个r5独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0272]
每个r6独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0273]
m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-n(r')c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or')o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0274]
r7选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0275]
每个r独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0276]
每个r'独立地选自由以下组成的组：c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr”、-yr”和h；
[0277]
每个r”独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0278]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
1-12
烯基组成的组；
[0279]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0280]
每个x独立地选自由以下组成的组：f、cl、br和i；并且
[0281]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0282]
或其盐或异构体。
[0283]
在一些实施方案中，式(i)化合物的另一个子集包括如下的那些化合物：
[0284]
r1选自由以下组成的组：c
5-30
烷基、c
5-20
烯基、-r*yr”、-yr”和-r”m'r'；
[0285]
r2和r3独立地选自由以下组成的组：c
1-14
烷基、c
2-14
烯基、-r*yr”、-yr”和-r*or”，或者r2和r3与其所连接的原子一起形成杂环或碳环；
[0286]
r4选自由以下组成的组：-(ch2)nq、-(ch2)nchqr、-chqr和-cq(r)2，其中q是-n(r)2，并且n选自1、2、3、4和5；
[0287]
每个r5独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0288]
每个r6独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0289]
m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-n(r')c(o)-、-c(o)-、-c(s)-、-c(s)s-、-sc(s)-、-ch(oh)-、-p(o)(or')o-、-s(o)
2-、-s-s-、芳基和杂芳基；
[0290]
r7选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0291]
每个r独立地选自由以下组成的组：c
1-3
烷基、c
2-3
烯基和h；
[0292]
每个r'独立地选自由以下组成的组：c
1-18
烷基、c
2-18
烯基、-r*yr”、-yr”和h；
[0293]
每个r”独立地选自由c
3-14
烷基和c
3-14
烯基组成的组；
[0294]
每个r*独立地选自由c
1-12
烷基和c
1-12
烯基组成的组；
[0295]
每个y独立地是c
3-6
碳环；
[0296]
每个x独立地选自由以下组成的组：f、cl、br和i；并且
[0297]
m选自5、6、7、8、9、10、11、12和13，
[0298]
或其盐或异构体。
[0299]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(ia)的那些化合物：
[0300][0301]
或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m选自5、6、7、8和9；m1是键或m'；r4是未被取代的c
1-3
烷基或-(ch2)nq，其中q是oh、-nhc(s)n(r)2、-nhc(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)r8、-nhc(＝nr9)n(r)2、-nhc(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、杂芳基或杂环烷基；m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-p(o)(or')o-、-s-s-、芳基和杂芳基；并且r2和r3独立地选自由以下组成的组：h、c
1-14
烷基和c
2-14
烯基。
[0302]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(ii)的那些化合物：
[0303]
或其盐或异构体，其中l选自1、2、3、4和5；m1是键或m'；r4是未被取代的c
1-3
烷基或-(ch2)nq，其中n是2、3或4，并且q是oh、-nhc(s)n(r)2、-nhc(o)n(r)2、-n(r)c(o)r、-n(r)s(o)2r、-n(r)r8、-nhc(＝nr9)n(r)2、-nhc(＝chr9)n(r)2、-oc(o)n(r)2、-n(r)c(o)or、杂芳基或杂环烷基；m和m'独立地选自-c(o)o-、-oc(o)-、-c(o)n(r')-、-p(o)(or')o-、-s-s-、芳基和杂芳基；并且r2和r3独立地选自由以下组成的组：h、c
1-14
烷基和c
2-14
烯基。
[0304]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(iia)、(iib)、(iic)或(iie)的那些化合物：
[0305][0306]
或其盐或异构体，其中r4是如本文所阐述。
[0307]
在一些实施方案中，式(i)化合物的子集包括式(iid)的那些化合物：
[0308][0309]
或其盐或异构体，其中n是2、3或4；并且m、r'、r”和r2至r6是如本文所阐述。例如，r2和r3中的每一者可独立地选自由c
5-14
烷基和c
5-14
烯基组成的组。
[0310]
在一些实施方案中，本公开的可电离的阳离子脂质包含具有如下结构的化合物：
[0311][0312]
在一些实施方案中，本公开的可电离的阳离子脂质包含具有如下结构的化合物：
[0313][0314]
在一些实施方案中，本公开的非阳离子脂质包含1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二-十一酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(dupc)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(popc)、1,2-二-o-十八烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0diether pc)、1-油酰基-2胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(ochemspc)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(c16 lyso pc)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(me 16.0pe)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(dopg)、鞘磷脂和其混合物。
[0315]
在一些实施方案中，本公开的peg修饰的脂质包含peg修饰的磷脂酰乙醇胺、peg修饰的磷脂酸、peg修饰的神经酰胺、peg修饰的二烷基胺、peg修饰的二酰基甘油、peg修饰的二烷基甘油和其混合物。在一些实施方案中，peg修饰的脂质是dmg-peg、peg-c-domg(也称为peg-domg)、peg-dsg和/或peg-dpg。
[0316]
在一些实施方案中，本公开的固醇包含胆固醇、粪固醇、植固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚和其混合物。
[0317]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含化合物1的可电离的阳离子脂质，其中所述非阳离子脂质是dspc，所述结构脂质是胆固醇，并且所述peg脂质是dmg-peg。
[0318]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含45-55摩尔百分比(mol％)的可电离的阳离子脂质。例如，脂质纳米颗粒可包含45mol％、46mol％、47mol％、48mol％、49mol％、50mol％、51mol％、52mol％、53mol％、54mol％或55mol％可电离的阳离子脂质。
[0319]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含5-15mol％dspc。例如，所述脂质纳米颗粒可包含5mol％、6mol％、7mol％、8mol％、9mol％、10mol％、11mol％、12mol％、13mol％、14mol％或15mol％dspc。
[0320]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含35-40mol％胆固醇。例如，所述脂质纳米颗粒可包含35mol％、36mol％、37mol％、38mol％、39mol％或40mol％胆固醇。
[0321]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含1-2mol％dmg-peg。例如，所述脂质纳米颗粒可包含1mol％、1.5mol％或2mol％dmg-peg。
[0322]
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含50mol％可电离的阳离子脂质、10mol％dspc、38.5mol％胆固醇和1.5mol％dmg-peg。
[0323]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约2:1至约30:1的n:p比率。
[0324]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约6:1的n:p比率。
[0325]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约3:1的n:p比率。
[0326]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约10:1至约100:1的可电离的阳离子脂质组分对rna的wt/wt比率。
[0327]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约20:1的可电离的阳离子脂质组分对rna的wt/wt比率。
[0328]
在一些实施方案中，本公开的lnp包含约10:1的可电离的阳离子脂质组分对rna的wt/wt比率。
[0329]
在一些实施方案中，本公开的lnp的平均直径为约50nm至约150nm。
[0330]
在一些实施方案中，本公开的lnp的平均直径为约70nm至约120nm。
[0331]
多价疫苗
[0332]
如本文所提供的组合物可包括编码相同或不同物种的两种或更多种抗原的rna或多种rna。在一些实施方案中，组合物包括编码两种或更多种冠状病毒抗原的rna或多种rna。在一些实施方案中，所述rna可编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种冠状病毒抗原。
[0333]
在一些实施方案中，可将两种或更多种编码抗原的不同rna(例如mrna)配制在同一脂质纳米颗粒中。在其他实施方案中，可将两种或更多种编码抗原的不同rna配制在单独脂质纳米颗粒中(每个rna配制在单一脂质纳米颗粒中)。然后可将脂质纳米颗粒组合并且以单一疫苗组合物形式(例如，包含编码多种抗原的多种rna)施用或者可分开施用。
[0334]
组合疫苗
[0335]
如本文所提供的组合物可包括编码相同或不同病毒株的两种或更多种抗原的rna或多种rna。本文也提供了组合疫苗，其包括编码一种或多种冠状病毒和不同生物体的一种或多种抗原的rna。因此，本公开的疫苗可为靶向相同毒株/物种的一种或多种抗原或不同毒株/物种的一种或多种抗原的组合疫苗，所述抗原是例如诱导对在冠状病毒感染风险高的同一地理区域中发现的生物体或个体在暴露于冠状病毒时有可能暴露于其的生物体的免疫性的抗原。
[0336]
药物制剂
[0337]
本文提供了用于预防或治疗例如人类和其他哺乳动物中的冠状病毒的组合物(例如药物组合物)、方法、试剂盒和试剂。本文所提供的组合物可用作治疗剂或预防剂。其可用于药物中以预防和/或治疗冠状病毒感染。
[0338]
在一些实施方案中，可将含有如本文所阐述的rna的冠状病毒疫苗施用给受试者(例如哺乳动物受试者，例如人类受试者)，并且rna多核苷酸在体内翻译以产生抗原性多肽(抗原)。
[0339]
组合物(例如包含rna)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用方式、rna的物理特征(例如长度、核苷酸组成和/或经修饰核苷的程度)、疫苗的其他组分和其他决定因素，例如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。通常，有效量的组合物提供经诱导或加强的免疫反应，其随受试者细胞中的抗原产生而变化。在一些实施方案中，有效量的含有具有至少一个化学修饰的rna多核苷酸的组合物比含有编码相同抗原或肽抗原的相应未经修饰的多核苷酸的组合物更有效。增加的抗原产生可通过以下来证明：细胞
转染增加(经rna疫苗转染的细胞百分比)、从多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达增加、核酸降解减少(如例如通过从经修饰的多核苷酸的蛋白质翻译的持续时间延长所证明)或宿主细胞的抗原特异性免疫反应改变。
[0340]
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载体的组合，使得组合物尤其适于体内或离体的诊断性或治疗性用途。“药学上可接受的载体”在施用于受试者后或施用给受试者时不会引起不希望的生理学效应。药物组合物中的载体也必须在与活性成分相容并且可能够使其稳定的意义上为“可接受的”。可利用一种或多种增溶剂作为用于递送活性剂的药物载体。药学上可接受的载体的实例包括(但不限于)生物相容性媒介物、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。其他适宜药物载体和稀释剂以及使用其的药物必需品阐述于remington's pharmaceutical sciences中。
[0341]
在一些实施方案中，本公开的组合物(包含多核苷酸和其编码的多肽)可用于治疗或预防冠状病毒感染。组合物可作为主动免疫方案的一部分预防性地或治疗性地施用给健康个体，或在感染早期的潜伏期期间或症状发作后的活动性感染期间施用。在一些实施方案中，向细胞、组织或受试者提供的rna量可为有效用于免疫预防的量。
[0342]
组合物可与其他预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可为佐剂或加强剂。如本文所用，当提及预防性组合物(例如疫苗)时，术语“加强剂”是指预防性(疫苗)组合物的额外施用。可在早期施用预防性组合物之后给予加强剂(或加强疫苗)。预防性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可为(但不限于)1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或99年以上。在示例性实施方案中，预防性组合物的初始施用与加强剂之间的施用时间可为(但不限于)1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
[0343]
在一些实施方案中，与本领域中已知的灭活疫苗的施用类似，组合物可肌内、鼻内或真皮内施用。
[0344]
取决于感染的盛行率或未满足医疗需求的程度或水平，组合物可用于各种环境中。作为非限制性实例，rna疫苗可用于治疗和/或预防多种传染病。rna疫苗具有优异性质，因为其相比于市售疫苗产生显著更大的抗体滴度、更好的中和免疫性、产生更持久的免疫反应和/或更早地产生反应。
[0345]
本文提供了药物组合物，其包括rna和/或任选地与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的复合物。
[0346]
rna可单独或与一种或多种其他组分联合配制或施用。例如，免疫组合物可包含其他组分，包括(但不限于)佐剂。
[0347]
在一些实施方案中，免疫组合物不包括佐剂(其不含佐剂)。
[0348]
rna可与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合配制或施用。在一些实施方案中，疫苗组合物包含至少一种额外活性物质，例如治疗活性物质、预防活性物质或二者的组合。疫苗组合物可为无菌的、无热原的或既无菌又无热原的。医药剂(例如疫苗组合物)的配制和/或制造中的一般考虑因素可见于例如remington:the science and practice of pharmacy，第21版，lippincott williams&wilkins,2005(通过引用整体并入本文)。
[0349]
在一些实施方案中，将免疫组合物施用给人类、人类患者或受试者。出于本公开的目的，短语“活性成分”通常是指rna疫苗或其中所含的多核苷酸，例如编码抗原的rna多核苷酸(例如mrna多核苷酸)。
[0350]
本文所阐述疫苗组合物的制剂可通过药理学领域中已知或以后开发的任何方法来制备。一般来说，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分(例如mrna多核苷酸)与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后在必要时和/或需要时，将产品分割、成型和/或包装成期望的单剂量或多剂量单元。
[0351]
根据本公开的药物组合物中的活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量将取决于所治疗受试者的身份、体型和/或疾患并且进一步取决于待施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含介于0.1％与100％之间、例如介于0.5％与50％之间、介于1％至30％之间、介于5％至80％之间、至少80％(w/w)的活性成分。
[0352]
在一些实施方案中，使用一种或多种赋形剂配制rna，以：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染；(3)允许持续或延迟释放(例如来自储积制剂)；(4)改变生物分布(例如靶向至特定组织或细胞类型)；(5)增加所编码蛋白质在体内的翻译；和/或(6)改变所编码蛋白质(抗原)在体内的释放曲线。除传统赋形剂如任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂以外，赋形剂还可包括(但不限于)类脂质、脂质粒、脂质纳米颗粒、聚合物、脂质复合物(lipoplex)、核-壳纳米颗粒、肽、蛋白质、经rna转染的细胞(例如用于移植至受试者中)、玻尿酸酶、纳米颗粒模拟物和它们的组合。
[0353]
给药/施用
[0354]
本文提供了用于预防和/或治疗人类和其他哺乳动物中的冠状病毒感染的免疫组合物(例如rna疫苗)、方法、试剂盒和试剂。免疫组合物可用作治疗剂或预防剂。在一些实施方案中，免疫组合物用于提供针对冠状病毒感染的预防性保护。在一些实施方案中，免疫组合物用于治疗冠状病毒感染。在一些实施方案中，免疫组合物用于启动免疫效应细胞，例如使外周血单核细胞(pbmc)离体活化，然后将其输注(再输注)至受试者中。
[0355]
受试者可为任何哺乳动物，包括非人类灵长类动物和人类受试者。通常，受试者是人类受试者。
[0356]
在一些实施方案中，将免疫组合物(例如rna疫苗)以有效量施用给受试者(例如哺乳动物受试者，例如人类受试者)，以诱导抗原特异性免疫反应。使编码冠状病毒抗原的rna在体内表达并翻译以产生抗原，其随后刺激受试者中的免疫反应。
[0357]
在施用本公开的免疫组合物(例如rna疫苗)后，可实现针对冠状病毒的预防性保护。可将免疫组合物施用一次、两次、三次、四次或更多次，但有可能施用一次疫苗(任选地后接单一加强剂)即为足够的。尽管不太合意，但可将免疫组合物施用给受感染个体以实现治疗性反应。可能需要相应地调整给药。
[0358]
本公开的方面中提供了在受试者中引发针对冠状病毒抗原(或多种抗原)的免疫反应的方法。在一些实施方案中，方法涉及向受试者施用包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的rna(例如mrna)的免疫组合物，由此在所述受试者中诱导特异性针对所述冠状病毒抗原的免疫反应，其中在疫苗接种后，所述受试者中的抗抗原抗体滴度相对于接种预防有效剂量的针对所述抗原的传统疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度有所增加。“抗抗原抗体”是特异性地结合至抗原的血清抗体。
[0359]
预防有效剂量是以临床上可接受的水平防止病毒感染的有效剂量。在一些实施方案中，有效剂量是在疫苗的包装插页中所列示的剂量。如本文所用，传统疫苗是指除本公开的mrna疫苗以外的疫苗。例如，传统疫苗包括(但不限于)活微生物疫苗、杀灭的微生物疫苗、亚单位疫苗、蛋白质抗原疫苗、dna疫苗、病毒样颗粒(vlp)疫苗等。在示例性实施方案中，传统疫苗是已取得监管批准和/或由国家药品管理机构(例如美国食品药品管理局(food and drug administration,fda)或欧洲药物管理局(european medicines agency,ema))注册的疫苗。
[0360]
在一些实施方案中，在疫苗接种后，受试者中的抗抗原抗体滴度相对于接种预防有效剂量的针对冠状病毒的传统疫苗的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log至10log。在一些实施方案中，在疫苗接种后，受试者中的抗抗原抗体滴度相对于接种预防有效剂量的针对冠状病毒的传统疫苗的受试者或未接种疫苗的受试者中的抗抗原抗体滴度增加1log、2log、3log、4log、5log或10log。
[0361]
本公开的其他方面中提供了在受试者中引发针对冠状病毒的免疫反应的方法。所述方法涉及向受试者施用包含rna多核苷酸(其包含编码冠状病毒抗原的开放阅读框)的免疫组合物(例如rna疫苗)，由此在所述受试者中诱导特异性针对所述冠状病毒的免疫反应，其中所述受试者中的免疫反应等同于以相对于所述免疫组合物2倍至100倍的剂量水平接种针对冠状病毒的传统疫苗的受试者中的免疫反应。
[0362]
在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物两倍的剂量水平接种传统疫苗的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物三倍的剂量水平接种传统疫苗的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物4倍、5倍、10倍、50倍或100倍的剂量水平接种传统疫苗的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物10倍至1000倍的剂量水平接种传统疫苗的受试者中的免疫反应。在一些实施方案中，受试者中的免疫反应等同于以相对于本公开的免疫组合物100倍至1000倍的剂量水平接种传统疫苗的受试者中的免疫反应。
[0363]
在其他实施方案中，通过测定受试者中的[蛋白质]抗体滴度来评价免疫反应。在其他实施方案中，测试来自经免疫受试者的血清或抗体能够中和病毒摄取或减少人类b淋巴细胞的冠状病毒转化的能力。在其他实施方案中，使用业内公认的技术测量促进稳固t细胞反应的能力。
[0364]
本公开的其他方面提供了在受试者中引发针对冠状病毒的免疫反应的方法，其是通过向所述受试者施用包含具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的rna的免疫组合物(例如rna疫苗)来实施，由此在所述受试者中诱导特异性针对所述冠状病毒抗原的免疫反应，
其中相对于在接种预防有效剂量的针对冠状病毒的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中的免疫反应提前诱导2天至10周。在一些实施方案中，在以相对于本公开的免疫组合物2倍至100倍的剂量水平接种预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导出所述受试者中的免疫反应。
[0365]
在一些实施方案中，相对于在接种预防有效剂量的传统疫苗的受试者中诱导的免疫反应，所述受试者中的免疫反应提前诱导2天、3天、1周、2周、3周、5周或10周。
[0366]
本文还提供了在受试者中引发针对冠状病毒的免疫反应的方法，其是通过向所述受试者施用具有编码第一抗原的开放阅读框的rna来实施，其中所述rna不包括稳定化元件，并且其中佐剂不与疫苗共配制或共施用。
[0367]
免疫组合物(例如rna疫苗)可通过产生治疗有效结果的任何途径来施用。这些途径包括(但不限于)真皮内、肌内、鼻内和/或皮下施用。本公开提供了包括向有需要的受试者施用rna疫苗的方法。所需的确切量将因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄和一般状况、疾病的严重程度、特定组合物、其施用模式、其活性模式等。通常以剂量单位形式配制rna以便于施用和统一剂量。然而，应理解，rna的总日用量可由主治医师在合理的医学判断范围内决定。用于任何特定患者的具体治疗有效、预防有效或适当成像剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所采用的具体化合物组合或同时使用的药物；和医学领域中众所周知的类似因素。
[0368]
如本文所提供的rna的有效量可低至20μg，例如作为单一剂量或作为两个10μg剂量施用。在一些实施方案中，有效量为20μg-300μg或25μg-300μg的总剂量。例如，有效量可为20μg、25μg、30μg、35μg、40μg、45μg、50μg、55μg、60μg、65μg、70μg、75μg、80μg、85μg、90μg、95μg、100μg、110μg、120μg、130μg、140μg、150μg、160μg、170μg、180μg、190μg、200μg、250μg或300μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为20μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为25μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为75μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为150μg的总剂量。在一些实施方案中，有效量为300μg的总剂量。
[0369]
可将本文所阐述的rna配制成本文所阐述的剂型，例如鼻内、气管内或可注射的(例如静脉内、眼内、玻璃体内、肌内、真皮内、心内、腹膜内和皮下)。
[0370]
疫苗功效
[0371]
本公开的一些方面提供了免疫组合物(例如rna疫苗)的制剂，其中rna是以有效量配制，以在受试者中产生抗原特异性免疫反应(例如产生对冠状病毒抗原具有特异性的抗体)。“有效量”是有效产生抗原特异性免疫反应的rna剂量。本文还提供了在受试者中诱导抗原特异性免疫反应的方法。
[0372]
如本文所用，对本公开的疫苗或lnp的免疫反应是受试者对疫苗中所存在的(一种或多种)冠状病毒蛋白产生体液性和/或细胞性免疫反应。出于本公开的目的，“体液性”免疫反应是指由包括例如分泌性(iga)或igg分子在内的抗体分子介导的免疫反应，而“细胞性”免疫反应是由t淋巴细胞(例如cd4+辅助性和/或cd8+t细胞(例如ctl))和/或其他白细胞介导的免疫反应。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞溶解性t细胞(ctl)的抗原特异性反应。ctl对与由主要组织相容性复合体(mhc)编码的蛋白质一起呈递并在细胞表面上表达的
肽抗原具有特异性。ctl有助于诱导并促进细胞内微生物的破坏或感染此类微生物的细胞的溶解。细胞免疫的另一方面涉及辅助性t细胞的抗原特异性反应。辅助性t细胞起帮助刺激功能的作用，并且将非特异性效应细胞的活性集中于对抗在表面上展示与mhc分子缔合的肽抗原的细胞。细胞性免疫反应也导致产生细胞因子、趋化因子和由经活化的t细胞和/或其他白细胞(包括源自cd4+和cd8+t细胞的那些细胞)产生的其他此类分子。
[0373]
在一些实施方案中，通过测量在施用如本文所提供的免疫组合物的受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度来表征抗原特异性免疫反应。抗体滴度是受试者体内抗体量的测量值，所述抗体是例如对特定抗原或抗原的表位具有特异性的抗体。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(elisa)是用于测定抗体滴度的常用测定。
[0374]
在一些实施方案中，使用抗体滴度来评价受试者是否已感染或确定是否需要实施免疫。在一些实施方案中，使用抗体滴度来确定自身免疫反应的强度、确定是否需要加强免疫、确定先前疫苗是否有效并鉴定任何近期或先前的感染。根据本公开，可使用抗体滴度来确定免疫组合物(例如rna疫苗)在受试者中所诱导的免疫反应的强度。
[0375]
在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加至少1.5log、至少2log、至少2.5log或至少3log。在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1log、1.5log、2log、2.5log或3log。在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加1-3log。例如，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加1-1.5log、1-2log、1-2.5log、1-3log、1.5-2log、1.5-2.5log、1.5-3log、2-2.5log、2-3log或2.5-3log。
[0376]
在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍。在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加2-10倍。例如，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加2-10倍、2-9倍、2-8倍、2-7倍、2-6倍、2-5倍、2-4倍、2-3倍、3-10倍、3-9倍、3-8倍、3-7倍、3-6倍、3-5倍、3-4倍、4-10倍、4-9倍、4-8倍、4-7倍、4-6倍、4-5倍、5-10倍、5-9倍、5-8倍、5-7倍、5-6倍、6-10倍、6-9倍、6-8倍、6-7倍、7-10倍、7-9倍、7-8倍、8-10倍、8-9倍或9-10倍。
[0377]
在一些实施方案中，将抗原特异性免疫反应测量为血清中和抗体滴度对冠状病毒的几何平均滴度(gmt)比率，称为几何平均比率(gmr)。几何平均滴度(gmt)是一组受试者的平均抗体滴度，其是通过将所有值相乘并取所述数值的n次方根来计算，其中n是具有可用数据的受试者数量。
[0378]
在一些实施方案中，对照是未施用免疫组合物(例如rna疫苗)的受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度。在一些实施方案中，对照是施用重组或经纯化蛋白质疫苗的受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度。重组蛋白疫苗通常包括在异源表达系统(例如细菌或酵母)中产生或从大量致病性生物体纯化的蛋白质抗原。
[0379]
在一些实施方案中，在鼠类模型中测量免疫组合物(例如rna疫苗)有效的能力。例
如，可将免疫组合物施用给鼠类模型并测定所述鼠类模型对中和抗体滴度的诱导。还可使用病毒攻击研究来评价本公开的疫苗的功效。例如，可将免疫组合物施用给鼠类模型，利用病毒攻击所述鼠类模型，并测定所述鼠类模型的存活和/或免疫反应(例如中和抗体反应、t细胞反应(例如细胞因子反应))。
[0380]
在一些实施方案中，免疫组合物(例如rna疫苗)的有效量是与重组蛋白疫苗的照护标准剂量相比降低的剂量。如本文所提供的“照护标准”是指医学或心理学治疗指南，并且可为一般性的或特定性的。“照护标准”指定基于科学证据和参与治疗既定疾患的医学专业人士之间的合作的适当治疗。其是医师/临床医师对某一类型的患者、疾病或临床情况应遵循的诊断和治疗过程。如本文所提供的“照护标准剂量”是指医师/临床医师或其他医学专业人士在遵循用于治疗或预防冠状病毒感染或相关疾患的照护标准指南的同时将施用给受试者以治疗或预防冠状病毒感染或相关疾患的重组或经纯化蛋白质疫苗、或减毒活疫苗或灭活疫苗、或vlp疫苗的剂量。
[0381]
在一些实施方案中，施用有效量的免疫组合物的受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度等同于施用照护标准剂量的重组或经纯化蛋白质疫苗、或减毒活疫苗或灭活疫苗、或vlp疫苗的对照受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度。
[0382]
可使用标准分析来评价疫苗功效(参见例如weinberg等人,j infect dis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。例如，可通过双盲、随机化的临床对照试验来测量疫苗功效。疫苗功效可表示为未接种疫苗(aru)与接种疫苗(arv)研究群组之间的疾病发作率(ar)的成比例降低，并且可使用以下公式从接种疫苗组中的疾病相对风险(rr)进行计算：
[0383]
功效＝(aru-arv)/aru
×
100；和
[0384]
功效＝(1-rr)
×
100。
[0385]
同样，可使用标准分析来评价疫苗有效性(参见例如weinberg等人,j infect dis.2010年6月1日；201(11):1607-10)。疫苗有效性是对疫苗(其可能已证明具有高疫苗功效)如何减少群体疾病的评价。此量度可评价疫苗接种计划(不仅仅是疫苗自身)在自然现场条件下而非在受控临床试验中的益处与不良效应的净平衡。疫苗有效性与疫苗功效(效力)成正比，但也受群体中目标组的免疫程度的影响，以及受影响住院、门诊就诊或费用的
‘
现实世界’结果的其他非疫苗相关因素的影响。例如，可使用回溯性病例对照分析，其中比较一组感染病例与适当对照之间的疫苗接种率。疫苗有效性可表示为率差，其中使用针对疫苗接种后发生感染的优势比(or)：
[0386]
有效性＝(1-or)
×
100。
[0387]
在一些实施方案中，相对于未接种疫苗的对照受试者，免疫组合物(例如rna疫苗)的功效为至少60％。例如，相对于未接种疫苗的对照受试者，免疫组合物的功效可为至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少95％、至少98％或100％。
[0388]
消除性免疫。消除性免疫是指防止有效病原体感染进入至宿主中的独特免疫状态。在一些实施方案中，本公开的免疫组合物的有效量足以在受试者中提供至少1年的消除性免疫。例如，本公开的免疫组合物的有效量足以在受试者中提供至少2年、至少3年、至少4年或至少5年的消除性免疫。在一些实施方案中，本公开的免疫组合物的有效量足以在受试者中以相对于对照低至少5倍的剂量提供消除性免疫。例如，有效量可足以在受试者中以相对于对照低至少10倍、低15倍或低20倍的剂量提供消除性免疫。
[0389]
可检测抗原。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者血清中所测量，本公开的免疫组合物的有效量足以产生可检测水平的冠状病毒抗原。
[0390]
滴度。抗体滴度是受试者体内抗体量的量度，所述抗体是例如对特定抗原(例如抗冠状病毒抗原)具有特异性的抗体。抗体滴度通常表示为提供阳性结果的最大稀释度的倒数。例如，酶联免疫吸附测定(elisa)是用于测定抗体滴度的常用测定。
[0391]
在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者血清中所测量，本公开的免疫组合物的有效量足以产生1,000-10,000个中和抗体滴度，所述滴度是由针对冠状病毒抗原的中和抗体产生。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者血清中所测量，有效量足以产生1,000-5,000个中和抗体滴度，所述滴度是由针对冠状病毒抗原的中和抗体产生。在一些实施方案中，如在施用后1-72小时在受试者血清中所测量，有效量足以产生5,000-10,000个中和抗体滴度，所述滴度是由针对冠状病毒抗原的中和抗体产生。
[0392]
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100nt
50
。例如，中和抗体滴度可为至少200、300、400、500、600、700、800、900或1000nt
50
。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000nt
50
。
[0393]
在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少100个中和单位/毫升(nu/ml)。例如，中和抗体滴度可为至少200nu/ml、300nu/ml、400nu/ml、500nu/ml、600nu/ml、700nu/ml、800nu/ml、900nu/ml或1000nu/ml。在一些实施方案中，中和抗体滴度为至少10,000nu/ml。
[0394]
在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少1log。例如，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照可增加至少2log、3log、4log、5log、6log、7log、8log、9log或10log。
[0395]
在一些实施方案中，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少2倍。例如，受试者中所产生的抗冠状病毒抗原抗体滴度相对于对照增加至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。
[0396]
在一些实施方案中，通常使用几何平均值(其是n个数的乘积的n次方根)来描述成比例增长。在一些实施方案中，使用几何平均值来表征在受试者中产生的抗体滴度。
[0397]
对照可为例如未接种疫苗的受试者，或施用减毒活病毒疫苗、灭活的病毒疫苗或蛋白质亚单位疫苗的受试者。
[0398]
实施例
[0399]
实施例1：ncov体外表达-dna
[0400]
此实验中测试的构建体是与t7聚合酶质粒共转染的norwood dna，以反式激活来自norwood的2019-ncov质粒上的启动子。使用sars作为阳性对照dna。测定条件如下：
[0401]
dna构建体：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
sars-cov-2变体6-10
[0402]
细胞类型：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
hek293t细胞
[0403]
板格式：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
12孔，600,000个细胞/孔
[0404]
每孔的dna：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
2.5μg/孔(构建体:t7＝1:1)
[0405]
温育时间：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
24小时、72小时
[0406]
细胞外染色：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
单色
[0407]
仪器：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
lsr fortessa
[0408]
ace2-flag,his:
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
200μg储备液，10μg/ml facs浓度
[0409]
抗flag-fitc：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1mg，5μg/ml facs浓度
[0410]
实施例2：ncov体外表达
–
mrna
[0411]
测试实施例1中构建体的mrna。测定条件如下：
[0412]
mrna构建体：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
sars-cov-2变体6-10
[0413]
细胞类型：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
hek293t细胞
[0414]
板格式：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
24孔，300,000个细胞/孔
[0415]
每孔的mrna：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
0.5μg，0.1μg/孔
[0416]
温育时间：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
24小时、48小时
[0417]
细胞外染色：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
单色
[0418]
仪器：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
lsr fortessa
[0419]
ace2-flag,his:
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
200μg储备液，10μg/ml facs浓度
[0420]
抗flag-fitc：
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1mg，5μg/ml facs浓度
[0421]
在所有构建体中，与其他低剂量的构建体相比，sars-cov-2变体5显示最佳表达。参见图2和图3。
[0422]
实施例3：免疫原性研究
[0423]
本研究经设计以测试候选冠状病毒疫苗在小鼠和/或兔中的免疫原性，所述候选冠状病毒疫苗包含表1中的编码例如sars-cov-2抗原的冠状病毒抗原(例如刺突(s)蛋白、刺突蛋白的s1亚基(s1)或刺突蛋白的s2亚基(s2))的mrna。
[0424]
在第0周和第3周经由静脉内(iv)、肌内(im)或真皮内(id)途径对动物接种疫苗。作为对照，一组保持不接种疫苗，并且一组施用灭活的冠状病毒。在第1周、第3周(给药前)和第5周从每个动物收集血清。经由所有三个时间点的病毒中和测定来测试个别出血的抗s、抗s1或抗s2活性，并使用灭活的冠状病毒通过蛋白质印迹(western blot)对仅来自第5周的合并样品进行测试。
[0425]
在使用脂质纳米颗粒(lnp)制剂的实验中，所述制剂可包括0.5-15％peg修饰的脂质；5-25％非阳离子脂质；25-55％固醇；和20-60％可电离的阳离子脂质。例如，所述peg修饰的脂质可为1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)，所述非阳离子脂质可为1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，所述固醇可为胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质可具有化合物1的结构。
[0426]
实施例4：冠状病毒攻击
[0427]
本研究经设计以测试候选冠状病毒疫苗在小鼠和/或兔中对抗冠状病毒的致死性攻击的功效，所述候选冠状病毒疫苗包含表1中的编码例如sars-cov-2抗原的冠状病毒抗原(例如刺突(s)蛋白、刺突蛋白的s1亚基(s1)或刺突蛋白的s2亚基(s2))的mrna。动物经致死性剂量(10
×
ld90；约100个噬斑形成单位；pfu)的冠状病毒攻击。
[0428]
所用动物为6-8周龄的雌性动物，每组10只。动物在第0周和第3周经由im、id或iv施用途径接种疫苗。候选疫苗经化学修饰或未经修饰。测试动物血清的微量中和(参见实施例14)。然后在第7周用约1ld90的冠状病毒经由in、im、id或iv施用途径攻击动物。终点为感染后第13天、死亡或安乐死。对如通过体重减轻》30％、极度嗜睡或瘫痪所确定的展示严重疾病的动物实施安乐死。每天评价并记录体温和体重。
[0429]
实施例5
–
sars-cov-2变体9在小鼠中的免疫原性(一个剂量)
[0430]
利用各种剂量的sars-cov-2变体9mrna疫苗(“变体9”)于50μl 1x pbs中肌内注射至右后腿中对c3b6、c57/bl6和balb/c小鼠实施免疫。免疫后两周，收集血清并使其经受elisa，以评价抗体与sars-cov-2稳定化的融合前刺突蛋白(sars-cov-2pre-s)的结合。
[0431]
变体9的数据示于图4a至图4b中。小鼠品系之间无显著差异。如图4a中所示，接受1μg变体9的c3b6小鼠相较于接受0.1μg或0.01μg剂量的c3b6小鼠具有显著更高的抗体反应(p值《0.05)。图4b显示，接受10μg变体9的balb/c小鼠相较于接受1μg剂量(p值《0.05)或0.1μg剂量(p值《0.0001)的balb/c小鼠具有显著更高的抗体反应。
[0432]
如图5a至图5c中所示，以上文所阐述的方式测试其他mrna候选者。图5a展示，在施用一个剂量后，sars-cov-2变体5mrna疫苗(“变体5”)在c3b6和balb/c小鼠中引发类似的抗体反应。与接受0.1μg或0.01μg剂量的balb/c小鼠相比，接受1μg变体9或变体5的balb/c小鼠具有显著更高的抗体反应(p值《0.05)(图5b)。在0.1μg下，变体9对mrna递送的各种其他sars-cov-2疫苗抗原引发类似的反应。此外，在0.1μg剂量下，sars-cov-2变体8mrna疫苗(“变体8”)和sars-cov-2变体6mrna疫苗(“变体6”)相较于可溶性刺突蛋白(s)序列引发显著更高的抗体反应(*＝p值《0.05；**＝p值《0.01)。
[0433]
时程性分析
[0434]
利用通过临床代表性过程制造的各种剂量的变体9于50μl 1x pbs中肌内注射至右后腿中对balb/c小鼠实施免疫。每两周收集初免后血清并使其经受elisa，以评价抗体与sars-cov-2稳定化的融合前刺突蛋白(sars-cov-2pre-s)的结合。结果示于图6中。每个符号代表几何平均滴度(gmt)并且误差条指示几何标准偏差(sd)。使用双因素方差分析(two-way anova)来比较随时间和每个剂量而变的抗体反应。发现10μg剂量的变体9相较于所有其他剂量引发显著更高的抗体反应(p值《0.0001)并且在初免后4周内显著衰减(p值《0.001)。
[0435]
实施例6-变体9在小鼠中的免疫原性(两个剂量)
[0436]
小鼠品系的比较
[0437]
在第0周和第3周，利用各种剂量的变体9于50μl 1x pbs中肌内注射至右后腿中对小鼠(balb/c、c57bl/6和c3b6)实施免疫(图7)。在初免后和加强后两周(例如第2周和第5周)，收集血清并使其经受elisa，以评价抗体与sars-cov-2稳定化的融合前刺突蛋白(sars-cov-2pre-s)的结合。
[0438]
结果示于图8a至图8c中。每个符号代表个别小鼠，条形代表几何平均滴度(gmt)，并且误差条指示几何标准偏差(sd)。使用双因素方差分析来比较初免后和加强后的反应。在1μg剂量下，用变体9免疫的balb/c(图8a)和c57/bl6(图8b)小鼠在加强后具有显著更高的抗体反应(p值《0.0001)。
[0439]
sars-cov-2 mrna疫苗构建体的比较
[0440]
在第0周和第3周，利用各种剂量的变体9、变体5或sars-cov-2野生型刺突蛋白mrna于50μl 1x pbs中肌内注射至右后腿中对小鼠(balb/c和c3b6)实施免疫(图7)。在初免后和加强后两周(例如第2周和第5周)，收集血清并使其经受elisa，以评价抗体与sars-cov-2稳定化的融合前刺突蛋白(sars-cov-2pre-s)的结合。
[0441]
结果示于图9a至图9e中。每个符号代表个别小鼠，条形代表几何平均滴度(gmt)，并且误差条指示几何标准偏差(sd)。使用双因素方差分析来比较初免后和加强后的反应。
在1μg剂量下，用变体5和刺突野生型序列(s wt)免疫的小鼠在加强后具有显著更高的抗体反应(p值《0.0001)(图9a至图9c)。此外，在1μg剂量下，用变体9免疫的balb/c小鼠相较于用gmp备份序列(p值《0.01)和s wt(p值《0.05)免疫的小鼠具有显著更高的抗体反应(图9d)。在c3b6小鼠中，由任一构建体引发的抗体反应之间无显著差异(图9e)。对于所测试的所有三个序列，存在显著的时程性反应(例如初免后剂量对加强后剂量)。
[0442]
对其他研究序列进行测定。在第0周和第3周，利用各种剂量的编码变体9或其他研究序列的mrna于50μl 1x pbs中肌内注射至右后腿中对balb/c小鼠实施免疫(图7)。在加强后两周(例如第5周)，收集血清并使其经受elisa，以评价抗体与sars-cov-2稳定化的融合前刺突蛋白(sars-cov-2pre-s)的结合。
[0443]
结果示于图10中。每个符号代表个别小鼠，条形代表几何平均滴度(gmt)，并且误差条指示几何标准偏差(sd)。使用单因素方差分析来比较所有免疫原。用变体8、变体7和变体6免疫的小鼠相较于用变体9和s wt免疫的小鼠具有显著更高的抗体滴度(*＝p值《0.05；**＝p值《0.01；****＝p值《0.0001)。
[0444]
实施例7
–
sars-cov-2 mrna疫苗构建体的体内表达
[0445]
向6-8周龄雌性balb/c小鼠的每个后腿中肌内施用2μg或10μg的covid-19构建体或tris缓冲液(作为对照)。所述构建体包含于阳离子脂质纳米颗粒中的变体9、10.7mm乙酸钠、8.7％蔗糖、20mm tris(ph 7.5)。测试三种构建体：变体9、变体5和变体6。将构建体储存在-70℃下(变体9)或-20℃下(其他构建体)。一天后，收集脾和淋巴结以使用流式细胞术检测蛋白质表达。
[0446]
图11a至图11b显示使用5653-118(“118”)抗体的结果，所述抗体对sars-cov-1 s1亚基的n末端结构域具有特异性。所测试的所有构建体均具有良好表达，并且观察到表达呈剂量依赖性下降。在淋巴结(图11a)和脾(图11b)中，变体5相较于任一其他构建体显示显著更高的表达(α＝0.05)。在较低剂量(2μg)下，变体9相较于变体6具有显著更高的表达(α＝0.05)。
[0447]
图12a至图12b显示使用5652-109(“109”)抗体的结果，所述抗体对sars-cov-1 s蛋白的受体结合结构域具有特异性。所测试的所有构建体均具有良好表达，并且观察到表达呈剂量依赖性下降。在淋巴结或脾中，变体9和变体5在10μg剂量下无显著差异。在2μg剂量下，在淋巴结(图12a)和脾(图12b)中，变体9相较于另两种构建体具有显著更高的表达(α＝0.05)。
[0448]
实施例8
–
sars-cov-2 mrna疫苗构建体的体外表达
[0449]
在体外测试六种sars-cov-2 mrna疫苗构建体。将hek293t细胞平铺(30,000个细胞/孔)在96孔板上。将200ng构建体添加至每个孔中，并且将板温育24小时。然后，将细胞用“118”抗体(稀释度为1:100、1:300或1:600)、“109”抗体(稀释度为1:100、1:300或1:600)或sars-103(结合来自sars-cov-1的rbd，稀释度为1:100；作为对照)染色。然后利用抗人类fc al647以1:500的稀释度实施染色，并使用lsr fortessa读取样品。结果示于图13a至图13c中。变体9的结果提供于图14中。
[0450]
实施例9
–
体外效力测定开发
[0451]
开发测定以检查不同构建体的效力。测试两种抗体，即118(对sars-cov-1 s1亚基的n末端结构域具有特异性)和109(对sars-cov-1 s蛋白的受体结合结构域具有特异性)。
如图15中所示，在不同浓度和剂量下仅118抗体结合sars-cov-2抗原。
[0452]
实施例10
–
sars-cov-2变体9mrna疫苗小鼠免疫原性研究
[0453]
起始研究以评估低剂量的sars-cov-2变体9mrna疫苗(“变体9”)在balb/c小鼠中的免疫原性和功效。在第0周和第3周向balb/c小鼠接种1μg、0.1μg或0.01μg的变体9。在第2周和第5周对稳定化的s-2p蛋白的结合抗体进行量化。在单一剂量后两周，在接受1μg变体9的小鼠中，通过elisa测量存在大量的s-2p蛋白结合抗体(图16a)。在接受1μg或0.1μg变体9的小鼠中，第二剂量的变体9显著地增加结合抗体的水平(图16a)。使用假型慢病毒报告基因中和测定评价针对sars-cov-2的中和活性。与接受0.1μg变体9的小鼠相比，变体9在1μg剂量下引发显著的中和活性(图16b)。
[0454]
在第0周和第3周，利用1μg或0.1μg的变体9、变体5或不含2个脯氨酸突变的野生型(wt)对balb/c小鼠实施免疫。在加强后两周，收集血清并通过针对同源性sars-cov-2的假型慢病毒报告基因中和测定进行分析。在每个血清稀释度下取一式三份的平均值，从相对荧光素酶单位(rlu)读数生成s形曲线，并且将未感染的细胞视为代表100％中和并将仅经病毒转导的细胞视为代表0％中和，计算50％(ic
50
)(图21a、图21c、图21e、图21g)和80％(ic
80
)(图21b、图21d、图21f、图21h)中和活性。如图21a至图21f中所示，用1μg sars-cov-2 s mrna免疫的小鼠相较于用0.1μg免疫的小鼠具有显著更高的中和抗体反应(***＝p值《0.001，****＝p值《0.0001)。此外，用0.1μg剂量免疫的小鼠不具有可检测到的中和活性，这表明亚保护性抗体水平。此外，具有2p突变的稳定化的sars-cov-2 s(变体5和变体9)相较于wt s诱导更强效的ic
50
中和活性(*p值《0.05)。纳入天然s1/s2弗林蛋白酶(furin)切割位点或用gs接头代替弗林蛋白酶切割位点以产生单链构建体对免疫原性不具有显著影响(图21g、图21h)。
[0455]
在第0周和第3周，利用1μg、0.1μg或0.01μg的变体9于50μl 1x pbs中肌内注射至右后腿中对balb/c小鼠实施免疫，并且在第9周利用1
×
105pfu的小鼠适应性sars-cov-2进行鼻内攻击，所述sars-cov-2在受体结合结构域中含有两个靶向氨基酸变化以消除与小鼠ace-2受体的冲突(关于时间表参见图19)。在攻击后第2天，对小鼠肺和鼻进行均质化并通过噬斑测定评价病毒负荷。一个肺叶(图17a)和鼻甲(图17b)中的噬斑形成单位显示，1μg剂量组受到完全保护，其中与对照组相比滴度降低60倍。相比之下，未经免疫的攻击小鼠的病毒负荷为约106pfu/肺叶。观察到如下剂量效应：0.1μg变体9剂量使肺病毒负荷降低大约2log并且0.01μg变体9剂量使肺病毒负荷降低大约0.5log。
[0456]
在另一个研究中，向小鼠一次性接种10μg、μg或0.1μg于50μl 1x pbs中肌内注射至右后腿中的变体9(第0周)，并且在第7周利用1
×
105pfu的小鼠适应性sars-cov-2进行鼻内攻击，所述sars-cov-2在受体结合结构域中含有两个靶向氨基酸变化以消除与小鼠ace-2受体的冲突。在攻击后第2天，对小鼠肺(图18a)和鼻(图18b)进行均质化并通过噬斑测定评价病毒负荷。如图18a中可见，在攻击后，10μg剂量和1μg剂量组受到完全保护免于肺中的病毒复制，其中与对照组相比滴度降低60倍。体重百分比示于图18c中。
[0457]
在另一个研究中，在第0周和第4周向小鼠接种1μg、0.1μg或0.01μg的变体9，并且在第7周利用小鼠适应性sars-cov-2进行攻击，所述sars-cov-2在受体结合结构域中含有两个靶向氨基酸变化以消除与小鼠ace-2受体的冲突。在攻击后第二天，一个肺叶(图20a)和鼻甲(图20b)中的噬斑形成单位显示，1μg剂量组和0.1μg剂量组受到完全保护，其中与对
照组相比滴度降低大约60倍。体重百分比示于图20c中。
[0458]
实施例11-sars-cov-2变体9mrna疫苗与替代序列的比较
[0459]
该实施例提供了关于利用替代性刺突抗原设计进行低剂量mrna免疫后的结合和中和抗体反应的数据。利用0.1μg编码不同sars-cov-2 s-2p变体的mrna对balb/c小鼠实施免疫。在第0周和第3周对小鼠实施两次免疫。在加强后两周，收集血清并通过针对同源性sars-cov-2稳定化刺突的折叠竞争elisa(图22a)和假型慢病毒报告基因中和测定(图22b)进行分析。图22a显示血清终点结合滴度，其是通过在每个血清稀释度下取一式两份的平均值而得到，并且计算为背景光学密度的4倍。此外，在每个血清稀释度下取一式三份的平均值，从相对荧光素酶单位(rlu)读数生成s形曲线，并且将未感染的细胞视为代表100％中和并将仅经病毒转导的细胞视为代表0％中和，计算50％(ic
50
)中和活性(图22b)。另外，通过斯皮尔曼相关性比较抗体结合和中和滴度(图22c)。已发现，编码含有胞质尾突变的序列的mrna引发最强效的抗体反应。另外，在适用情况下，结合抗体滴度与中和抗体滴度之间存在强相关性。
[0460]
方法
[0461]
sars-cov-2 elisa
[0462]
为测量抗体结合，实施elisa。在4℃下将sars-cov-2 pre-s于100μl 1x pbs中涂布在96孔nunc maxisorp
tm
平底板(thermofisher，目录号：44-2401-21)上持续16小时。将板用250μl pbs-tween(pbst)(medicago ab，目录号：09-9410-100)洗涤3次。为防止非特异性结合，用200μl补充有5％脱脂乳(bd difco
tm
，目录号：232100)的pbst(封闭缓冲液)将板在室温(rt)下封闭1小时。将板用250μl pbst洗涤3次。将血清连续稀释(1:100，4倍，8次)于100μl封闭缓冲液中，并且使其在室温下以一式两份与抗原结合1小时。将板用250μl pbst洗涤3次。在室温下添加100ml于封闭缓冲液中稀释的与hrp缀合的山羊抗小鼠igg(h+l)交叉吸附的二级抗体(thermofisher，目录号：g-21040)持续1小时。将板用250μl pbst洗涤3次。利用100μl kpl sureblue 1-组分tmb微孔过氧化酶底物(sure blue，目录号：5120-0077)使酶联反应显色10分钟，并用100μl 1n硫酸(thermofisher，目录号：sa 212-1)终止。使用spectramax paradigm(molecular devices)来检测od
450
。血清终点滴度计算为非特异性二级抗体与抗原结合的4倍。
[0463]
其他实施方案
[0464]
1.一种核糖核酸(rna)，所述核糖核酸(rna)包含编码冠状病毒抗原的开放阅读框(orf)，所述冠状病毒抗原能够诱导对sars-cov-2的免疫反应、例如中和抗体反应，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
[0465]
2.一种化学修饰的核糖核酸(rna)，所述化学修饰的核糖核酸(rna)包含开放阅读框(orf)，所述开放阅读框(orf)包含与编码sars-cov-2抗原的野生型rna具有至少80％同一性的序列，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
[0466]
3.一种密码子优化的核糖核酸(rna)，所述密码子优化的核糖核酸(rna)包含开放阅读框(orf)，所述开放阅读框(orf)包含与编码sars-cov-2抗原的野生型rna具有至少80％同一性的序列，任选地其中所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
[0467]
4.如段落2或3所述的rna，其中由所述野生型rna编码的所述sars-cov-2抗原包含seq id no:31的序列。
[0468]
5.一种核糖核酸(rna)，所述核糖核酸(rna)包含开放阅读框(orf)，所述开放阅读框(orf)包含与seq id no:3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、48、50、52、54、56、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82或84中的任一者的序列具有至少80％同一性的序列。
[0469]
6.如段落5所述的rna，其中所述orf包含与seq id no:3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、48、50、52、54、56、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82或84中的任一者的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0470]
7.如段落5或6所述的rna，所述rna还包含5'utr，任选地其中所述5'utr包含seq id no:2或seq id no:36的序列。
[0471]
8.如前述段落中任一项所述的rna，所述rna还包含3'utr，任选地其中所述3'utr包含seq id no:4或seq id no:37的序列。
[0472]
9.如前述段落中任一项所述的rna，所述rna还包含5'帽类似物、任选地7mg(5')ppp(5')nlmpnp帽。
[0473]
10.如前述段落中任一项所述的rna，所述rna还包含多聚(a)尾，任选地长度为50至150个核苷酸。
[0474]
11.如段落5-10中任一项所述的rna，其中所述orf编码sars-cov-2抗原。
[0475]
12.如段落11所述的rna，其中所述冠状病毒抗原是结构蛋白。
[0476]
13.如段落12所述的rna，其中所述结构蛋白是刺突蛋白。
[0477]
14.如段落11-13中任一项所述的rna，其中所述冠状病毒抗原包含与seq id no:5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、33、34、35、47、49、59、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或85中的任一者的序列具有至少80％同一性的序列。
[0478]
15.如段落14所述的rna，其中所述冠状病毒抗原包含与seq id no:5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、33、34、35、47、49、59、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或85中的任一者的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0479]
16.如段落1-13中任一项所述的rna，其中所述orf包含seq id no:3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、48、50、52、54、56、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82或84中的任一者的序列。
[0480]
17.如段落1-13中任一项所述的rna，其中所述rna包含与seq id no:1、6、9、12、15、18、21、24、27、30、51、53、55、57-58、60或86-97中的任一者的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0481]
18.如段落1-13中任一项所述的rna，其中所述rna包含seq id no:1、6、9、12、15、18、21、24、27、30、51、53、55、57-58、60或86-97中的任一者的序列。
[0482]
19.如前述段落中任一项所述的rna，其中所述rna包含化学修饰并且任选地是完全化学修饰的。
[0483]
20.如段落19所述的rna，其中所述化学修饰是1-甲基假尿苷并且任选地每个尿苷是1-甲基假尿苷。
[0484]
21.如段落19所述的rna，其中每个尿苷是1-甲基假尿苷。
[0485]
22.如前述段落中任一项所述的rna，所述rna配制在脂质纳米颗粒中。
[0486]
23.如段落22所述的rna，其中所述脂质纳米颗粒包含peg修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离的阳离子脂质或其任何组合。
[0487]
24.如段落23所述的rna，其中所述脂质纳米颗粒包含0.5-15mol％peg修饰的脂质；5-25mol％非阳离子脂质；25-55mol％固醇；和20-60mol％可电离的阳离子脂质。
[0488]
25.如段落24所述的rna，其中所述peg修饰的脂质是1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)，所述非阳离子脂质是1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质具有化合物1的结构：
[0489][0490]
26.一种组合物，所述组合物包含段落1-21中任一项所述的rna和脂质混合物。
[0491]
27.如段落26所述的组合物，其中所述脂质混合物包含peg修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离的阳离子脂质或其任何组合。
[0492]
28.如段落27所述的组合物，其中所述脂质混合物包含0.5-15mol％peg修饰的脂质；5-25mol％非阳离子脂质；25-55mol％固醇；和20-60mol％可电离的阳离子脂质。
[0493]
29.如段落28所述的组合物，其中所述peg修饰的脂质是1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)，所述非阳离子脂质是1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，所述固醇是胆固醇；并且所述可电离的阳离子脂质具有化合物1的结构：
[0494][0495]
30.如段落26-29中任一项所述的组合物，其中所述脂质混合物形成脂质纳米颗粒。
[0496]
31.如段落30所述的组合物，其中所述rna配制在所述脂质纳米颗粒中。
[0497]
32.如段落1-13中任一项所述的rna，其中所述orf包含与seq id no:28的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的核苷酸序列。
[0498]
33.如段落1-13中任一项所述的rna，其中所述冠状病毒抗原包含与seq id no:29的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的氨基酸序列。
[0499]
33.如段落1-13中任一项所述的rna，其中所述rna包含与seq id no:27的序列具有至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的核苷酸序列。
[0500]
34.一种方法，所述方法包括向受试者施用前述段落中任一项所述的rna或组合物，其量有效诱导所述受试者中针对冠状病毒的中和抗体反应。
[0501]
35.一种方法，所述方法包括向受试者施用前述段落中任一项所述的rna或组合物，其量有效诱导所述受试者中针对冠状病毒的中和抗体反应和/或t细胞免疫反应、任选地cd4
+
和/或cd8
+
t细胞免疫反应。
[0502]
36.如段落34和35所述的方法，其中所述冠状病毒是sars-cov-2。
[0503]
37.如前述方法段落中任一项所述的方法，其中所述受试者是免疫受损的。
[0504]
38.如前述方法段落中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肺病。
[0505]
39.如前述方法段落中任一项所述的方法，其中所述受试者为5岁或更小、或65岁或更大。
[0506]
40.如前述方法段落中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少两个剂量的所述组合物。
[0507]
41.如前述方法段落中任一项所述的方法，其中在施用所述rna或包含所述rna的组合物后1-72小时，在所述受试者的血清中产生可检测水平的所述冠状病毒抗原。
[0508]
42.如前述方法段落中任一项所述的方法，其中在施用所述rna或包含所述rna的组合物后1-72小时，在所述受试者的血清中产生至少100nu/ml、至少500nu/ml或至少1000nu/ml的中和抗体滴度。
[0509]
43.一种免疫组合物，所述免疫组合物包含：脂质纳米颗粒，其包含(a)信使rna，所述信使rna包含与seq id no:28的序列具有至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的开放阅读框(orf)，和(b)脂质混合物，所述脂质混合物包含0.5-15mol％peg修饰的脂质、5-25mol％非阳离子脂质、25-55mol％固醇和20-60mol％可电离的阳离子脂质。
[0510]
44.一种免疫组合物，所述免疫组合物包含：脂质纳米颗粒，其包含(a)信使rna，所述信使rna包含与seq id no:27的序列具有至少90％、至少95％、至少98％或100％同一性的序列，和(b)脂质混合物，所述脂质混合物包含0.5-15mol％peg修饰的脂质、5-25mol％非阳离子脂质、25-55mol％固醇和20-60mol％可电离的阳离子脂质。
[0511]
45.一种免疫组合物，所述免疫组合物包含：
[0512]
(a)第一核糖核酸(rna)，其包含编码能够诱导对sars-cov-2的免疫反应、例如中和抗体反应的冠状病毒抗原的开放阅读框(orf)；和
[0513]
(b)第二核糖核酸(rna)，其包含编码能够诱导对sars-cov-2的免疫反应、例如中和抗体反应的冠状病毒抗原的开放阅读框(orf)，其中所述第一rna的orf不同于所述第二rna的orf。
[0514]
46.如段落45所述的免疫组合物，所述免疫组合物还包含含有脂质混合物的脂质纳米颗粒。
[0515]
47.如段落46所述的免疫组合物，其中所述脂质混合物包含peg修饰的脂质、非阳离子脂质、固醇、可电离的阳离子脂质或其任何组合。
[0516]
48.如段落47所述的免疫组合物，其中所述脂质混合物包含0.5-15mol％peg修饰的脂质；5-25mol％非阳离子脂质；25-55mol％固醇；和20-60mol％可电离的阳离子脂质。
[0517]
49.如段落46或47所述的免疫组合物，其中所述peg修饰的脂质是1,2二肉豆蔻酰基-sn-甘油,甲氧基聚乙二醇(peg2000 dmg)，所述非阳离子脂质是1,2二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)，所述固醇是胆固醇，并且所述可电离的阳离子脂质具有化合物1的结构：
[0518][0519]
50.如段落45-49中任一项所述的免疫组合物，其中由所述第一rna的所述orf编码的冠状病毒抗原包含与seq id no:5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、33、34、35、47、49、59、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83和85中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的氨基酸序列。
[0520]
51.如段落45-49中任一项所述的免疫组合物，其中所述第一rna的所述orf包含与seq id no:3、7、10、13、16、19、22、25、28、31、48、50、52、54、56、61、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82和84中的任一者的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％同一性的核苷酸序列。
[0521]
52.如段落1-13中任一项所述的rna，其中所述orf编码sars-cov-2抗原。
[0522]
53.如段落52所述的rna，其中所述sars-cov-2抗原是结构蛋白。
[0523]
54.如段落53所述的rna，其中所述结构蛋白选自由以下组成的组：刺突(s)蛋白、膜(m)蛋白、包膜(e)蛋白和(nc)核壳体蛋白。
[0524]
55.如段落54所述的rna，其中所述结构蛋白是s蛋白，任选地s蛋白的稳定化融合前形式。
[0525]
56.如段落55所述的rna，其中所述s蛋白是s蛋白变体，其相对于s蛋白包含seq id no:32的氨基酸序列。
[0526]
57.如段落56所述的rna，其中所述s蛋白变体包含多碱基切割位点回复为单碱基切割位点。
[0527]
58.如段落56所述的rna，其中所述s蛋白变体包含在所述s蛋白变体的羧基尾处的多碱基er/高尔基体信号序列(kxhxx-cooh)的缺失。
[0528]
59.如段落57-58所述的rna，其中所述s蛋白包含双脯氨酸稳定化突变。
[0529]
60.如段落57-58所述的rna，其中所述s蛋白包含修饰的蛋白酶切割位点以稳定化所述蛋白。
[0530]
61.如段落57-60所述的rna，其中所述s蛋白包含胞质尾的缺失。
[0531]
62.如段落57-61所述的rna，其中所述s蛋白包含折叠子支架。
[0532]
63.如段落57所述的rna，其中所述s蛋白包含与seq id no:5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、33、34、35、47、49、59、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83或85中的任一者的序列具有至少80％同一性的序列。
[0533]
64.如段落58所述的rna，其中所述结构蛋白是m蛋白。
[0534]
65.如段落64所述的rna，其中所述m蛋白包含与seq id no:81的序列具有至少80％同一性的序列。
[0535]
66.如段落65所述的rna，其中所述m蛋白包含与seq id no:81的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0536]
67.如段落57-66中任一项所述的rna，其中所述orf包含seq id no:80的序列。
[0537]
68.如段落57-67中任一项所述的rna，其中所述rna包含与seq id no:95的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0538]
69.如段落68所述的rna，其中所述rna包含seq id no:95的序列。
[0539]
70.如段落54所述的rna，其中所述结构蛋白是e蛋白。
[0540]
71.如段落70所述的rna，其中所述e蛋白包含与seq id no:83的序列具有至少80％同一性的序列。
[0541]
72.如段落71所述的rna，其中所述e蛋白包含与seq id no:83的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0542]
73.如段落70-72中任一项所述的rna，其中所述orf包含seq id no:82的序列。
[0543]
74.如段落70-73中任一项所述的rna，其中所述rna包含与seq id no:96的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0544]
75.如段落74所述的rna，其中所述rna包含seq id no:96的序列。
[0545]
76.如段落54所述的rna，其中所述结构蛋白是nc蛋白。
[0546]
77.如段落76所述的rna，其中所述nc蛋白包含与seq id no:85的序列具有至少80％同一性的序列。
[0547]
78.如段落77所述的rna，其中所述nc蛋白包含与seq id no:85的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0548]
79.如段落76-78中任一项所述的rna，其中所述orf包含seq id no:84的序列。
[0549]
80.如段落76-78中任一项所述的rna，其中所述rna包含与seq id no:97的序列具有至少85％、至少90％、至少95％或至少98％同一性的序列。
[0550]
81.如段落80所述的rna，其中所述rna包含seq id no:97的序列。
[0551]
82.如段落53所述的rna，其中所述sars-cov-2抗原是融合蛋白。
[0552]
83.如段落82所述的rna，其中所述融合蛋白包含sars-cov-2多肽和来自不同病毒的多肽。
[0553]
84.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含开放阅读框(orf)，所述开放阅读框(orf)包含与seq id no 106的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
[0554]
85.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含与seq id no 105的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。
[0555]
86.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含开放阅读框(orf)，所述开放阅读框(orf)包含与seq id no 106的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。
[0556]
87一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含与seq id no 105的核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列。
[0557]
88.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含开放阅读框(orf)，所述开放阅读框(orf)包含与seq id no 106的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
[0558]
89.一种信使核糖核酸(mrna)，所述信使核糖核酸(mrna)包含与seq id no 105的核苷酸序列具有至少99％同一性的核苷酸序列。
[0559]
序列表
[0560]
应理解，本文所阐述的任何mrna序列可包括5
′
utr和/或3
′
utr。utr序列可选自以下序列，或者可使用其他已知utr序列。还应理解，本文所阐述的任何mrna构建体还可包含多聚(a)尾和/或帽(例如7mg(5')ppp(5')nlmpnp)。此外，尽管本文所阐述的许多mrna和所编码的抗原序列包括信号肽和/或肽标签(例如c末端his标签)，但应理解，所指示的信号肽和/或肽标签可取代不同信号肽和/或肽标签，或者可省略信号肽和/或肽标签。
[0561]
5'utr:gggaaauaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagagccacc(seq id no:36)
[0562]
5'utr:gggaaauaagagagaaaagaagaguaagaagaaauauaagaccccggcgccgccacc(seq id no:2)
[0563]
3'utr:ugauaauaggcuggagccucgguggccaugcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggc(seq id no:37)
[0564]
3'utr:ugauaauaggcuggagccucgguggccuagcuucuugccccuugggccuccccccagccccuccuccccuuccugcacccguacccccguggucuuugaauaaagucugagugggcggc(seq id no:4)
[0565]
表1.
[0566]
[0567]
[0568]
[0569]
[0570]
[0571]
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[0573]
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[0673]
[0674]
[0675]
[0676]
[0677]
[0678]
[0679][0680]
*应理解，表1中所阐述的任一开放阅读框和/或相应氨基酸序列可包括或不包括信号序列。还应理解，信号序列可由不同信号序列(例如seq id no:38-43中的任一者)代替。
[0681]
等同形式
[0682]
本文所公开的所有参考文献、专利和专利申请都关于其各自所列举的主题通过引用并入，其在一些情况下可涵盖整个文件。
[0683]
除非明确指示相反情形，否则如本文在说明书和在权利要求书中所用的不定冠词“一个”和“一种”应理解为意指“至少一个/种”。还应理解，除非明确指示相反情形，否则在本文所要求的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作次序不一定受限于所述方法中所列举的步骤或动作次序。
[0684]
在权利要求书以及在上文说明书中，所有过渡性短语(例如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由......构成”等)应理解为是开放式的，即意指包括但不限于。如美国专利局专利审查程序手册(united states patent office manual of patent examining procedures)第2111.03节中所陈述，仅过渡性短语“由......组成”和“基本上由......组成”应分别为封闭式或半封闭式过渡性短语。
[0685]
数值前的术语“约”和“基本上”意指所列举数值的
±
10％。
[0686]
在提供值范围的情形下，本文明确考虑并描述所述范围的上限与下限之间的每个值。
[0687]
国际申请第pct/us2015/02740号、第pct/us2016/043348号、第pct/us2016/043332号、第pct/us2016/058327号、第pct/us2016/058324号、第pct/us2016/058314号、第pct/us2016/058310号、第pct/us2016/058321号、第pct/us2016/058297号、第pct/us2016/058319号和第pct/us2016/058314号的全部内容通过引用并入本文。