涉及治疗疾病的组合物和方法与流程

涉及治疗疾病的组合物和方法
发明领域
1.本发明涉及预防或治疗病毒感染的组合物和方法，适当地降低病毒活性，如细胞病变效应或斑块形成，特别是冠状病毒感染。本发明延伸到用于预防或治疗严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒感染的组合物-2(sars-cov-2或covid19)。本发明进一步延伸到组合物以及本发明组合物用于人和兽医疗法中治疗和/或预防冠状病毒感染的用途。
2.发明背景
3.冠状病毒(cov)是一大类病毒，可导致哺乳动物和鸟类疾病。在人中，冠状病毒会导致呼吸道感染，从普通感冒到更严重的疾病，如严重急性呼吸综合征(sars)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征(mers)和严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。冠状病毒属于单链rna病毒家族(冠状病毒科)，其具有布满了棒状突起的脂质包膜。冠状病毒感染可引起呼吸系统和肠道系统的严重疾病。
4.sars人冠状病毒(sars
–
cov-1)是第一种经常在人中引起严重疾病的冠状病毒。中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2或covid19)也可导致人中的严重疾病。sars-cov-2(covid19)已成为人冠状病毒中最具传染性的一种，因为它很容易在人与人之间传播。sars-cov-2的症状包括咳嗽、发烧和呼吸急促。这些病毒可导致感染者出现严重的肺炎样症状，在最严重的病例中会发生死亡。
5.已经对感染sars-cov-1和sars-cov-2的人施用了各种抗病毒治疗，包括一般抗病毒药物、抑制病毒细胞进入或复制的治疗以及免疫刺激剂。利巴韦林(ribavirin)是一种基于嘌呤核苷类似物的广谱抗病毒剂，是丙型肝炎的标准治疗方案。已知利巴韦林对各种rna病毒具有活性，并且已知对动物冠状病毒显示抗病毒活性。然而，该药物对sars-cov-1疗效的体外试验产生了一系列阴性结果，并且还报告了不良反应。
6.没有针对sars-cov-2的特定治疗。研究人员目前正在考虑抗病毒药物(如法维拉韦(favilavir)、瑞德西韦(remdesivir)、洛匹那韦(lopinavir)和利托那韦(ritonavir))对冠状病毒的有效性。然而，尚未阐明一种经过验证的sars-cov-2治疗。
7.在体外诱导不同的干扰素-α(ifn-α)亚型，并且ifn-α亚型具有不同的抗病毒、抗增殖和免疫调节活性。仍然只是部分了解ifn-α的作用机制，特别是个体ifn-α亚型的作用机制。已显示经由多种途径的感染可诱导不同的亚型谱。ifn-亚型与相同的受体结合，激活共同的信号传导通路，并预计具有相似的免疫功能。根据定义，所有ifn-亚型都具有抗病毒活性，尽管它们在这种上下文中的绝对功效可能有很大差异。此外，已经描述了许多其他生物学特性，但其具有不同的效力，包括免疫调节和抗增殖活性。多效性效应似乎是由于与受体链的不同相互作用以及通过不同的细胞内途径向一系列效应分子发出信号传导。i型ifn受体由两条链，即ifnr1和ifnr2组成。12种ifn-α亚型中的每一种与不同的受体链都有一定范围的结合亲和力。ifnα-14对两种干扰素受体都具有最高的亲和力之一，这就是它与其他11种亚型相比如此活跃的原因。
8.仅由ifnα2亚型组成的重组干扰素目前在抗病毒适应症市场占主导。有两种主要的重组αifn产品，来自schering plough的intron a
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(ifn-α2b)和来自roche的roferon
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(ifn-α2a)。与这些单个亚型产品相比，有几种αifn制剂由不同亚型的混合物组成。这些多亚型ifnα产物由人白细胞响应病毒(如viragen,inc或其子公司的multiferon
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，或interferon sciences/hemispherix的alferon-n
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)刺激产生或在培养自患有burkitt淋巴瘤的患者的人淋巴母细胞产生细胞(如来自sumitomo的sumiferon
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)中产生。
9.目前，对于感染冠状病毒，特别是感染sars-cov-1、mers-cov或sars-cov-2的人，尚无完全有效的治疗或预防性治疗方法。因此，对于人冠状病毒感染的安全、有效治疗，特别是对sars、mers和sars-cov-2的治疗和/或预防，存在显著未满足的需求。
发明概要
10.本发明人提出，希望开发病毒感染，特别是人冠状病毒感染的治疗，特别是治疗和/或预防sars、mers和sars-cov-2。本发明延伸到通过诱导nk和t细胞反应性来预防或治疗病毒感染引起的感染的组合物。本发明进一步延伸至组合物以及本发明的组合物用于人和兽医疗法中治疗和/或预防病毒感染的用途。
11.本发明涉及用于预防或治疗由病毒感染引起的病况的组合物和方法，特别是冠状病毒感染，如来自严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。本发明进一步延伸至本发明的组合物在治疗和/或预防sars、mers或sars-cov-2中的用途。本发明进一步延伸至将治疗有用量的本发明干扰素连同治疗有效量的合适的抗病毒化合物一起施用于需要治疗的受试者。
12.适当地，本发明可用于治疗病毒病况，如呼吸道病毒病、胃肠病毒病、发疹性病毒病、肝病毒病、皮肤病毒病、出血性病毒病、特别是神经性病毒病、严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。在没有针对特定病毒，特别是新出现的病毒的疫苗的情况下，有效的抗病毒药物将特别有利，适用于sar、流感(特别是h5n1)、寨卡病毒、wnv和ebov的爆发。适当地，本发明可用于治疗rsv(呼吸道合胞病毒)。
13.经过广泛的实验，本发明的发明人惊奇地发现，施用ifn-α14，例如seq id no：1或其变体或片段、hybrid 1，例如seq id no：2或其变体或片段或hybrid 2，例如本文所述的seq id no：3或其变体或片段导致抑制或抑止冠状病毒感染的影响。发明人出人意料地确定了ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2可以直接抑止冠状病毒感染引起的细胞病变效应。细胞病变效应(cytopathic effect)或细胞致病效应(cytopathogenic effect)是指由病毒入侵引起的宿主细胞的结构变化。发明人证明了ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2也抑止与冠状病毒感染相关的斑块形成。令人惊讶的是，这种效应在ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2舌下施用时得到证实。发明人出乎意料地确定hybrid 2可以直接抑止病毒感染引起的细胞病变效应。细胞病变效应或细胞致病效应是指由病毒入侵引起的宿主细胞的结构变化。本发明人证明hybrid 2也抑止与病毒感染有关的斑块形成。hybrid 2的活性似乎特别适合提供抗病毒活性。
14.本发明人检验了合成的α-干扰素、干扰素-α-14(seq id no：1)抑止由sars-cov-1
和sars-cov-2感染引起的细胞病变效应和斑块形成的能力。本发明人已经检查了与抗病毒化合物利巴韦林和多亚型干扰素multiferon
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相比，对细胞病变作用的抑止。令人惊讶的是，干扰素-α14(seq id no:1)对sars-cov-1和sars-cov-2有活性，而利巴韦林和多亚型干扰素multiferon
tm
显示出低得多的抑制活性。
15.认为使用ifn-α14(seq id no:1)、hybrid 1(seq id no:2)或hybrid 2(seq id no:3)或其变体或片段对sars-cov-2(covid19)的治疗，递送方式可能是通过直接注射或通过气溶胶直接进入肺。每次施用可以使用104至107iu范围内的合适剂量。使用ifn-α14(seq id no:1)、hybrid 1(seq id no:2)或hybrid 2(seq id no:3)作为舌下治疗也可能存在一些相关性。本发明人惊奇地发现，与之前的抗病毒药物相比，作为舌下治疗施用ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2特别是seq id no:1、2或3或其变体或片段可导致冠状病毒活性的更大降低或抑止。此外，发明人已经确定可以使用非常低剂量的ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2，例如每天高达104至5x106iu。
16.这导致发明人鉴定了改进的治疗组合物，其可用于治疗和/或预防冠状病毒感染，特别是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。
17.因此，本发明的第一方面提供了用于治疗和/或预防冠状病毒感染的方法，所述方法包括以下步骤：
18.(i)向有需要的受试者施用治疗有效量的干扰素α亚型，其中干扰素α亚型是ifn-α14、hybrid 1、hybrid 2或ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2中任一种的组合，例如ifn-α14和hybrid 1或ifn-α14和hybrid 2或hybrid 1和hybrid 2。
19.在实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)或严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。
20.在实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)。
21.在实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。
22.适当地，病毒感染可以选自选自黄病毒科成员的病毒(例如，黄病毒、瘟病毒和肝炎病毒属的成员)，其中包括丙型肝炎病毒、黄热病病毒；蜱传病毒，如加德格兹谷(gadgets gully)病毒、卡达姆病毒、萨努尔森林病病毒、langat病毒、鄂木斯克出血热病毒、波瓦森病毒、royal farn1病毒、卡尔西病毒、蜱传脑炎病毒、纽多佛病毒、sofjin病毒、跳跃病(louping-ill)病毒和根岸病毒；海鸟蜱传病毒，如米班病毒、索马里兹珊瑚礁病毒和秋列尼病毒；蚊媒病毒，如阿纳病毒、登革热病毒、凯杜古病毒、卡西帕科利病毒、库坦戈病毒、日本脑炎病毒、默里谷脑炎病毒、圣路易斯脑炎病毒、乌苏图病毒、西尼罗河病毒、yammde病毒、拉病毒病毒、巴加扎病毒、伊列乌斯病毒、以色列火鸡脑膜脑脊髓炎病毒、恩塔亚病毒、坦布苏病毒、寨卡病毒、barizi病毒、博博衣病毒、边山病毒、朱格拉病毒、saboya病毒、塞皮克病毒、乌干达s病毒、韦塞尔斯布朗病毒、黄热病病毒；恩得培蝙蝠病毒、横濑病毒、apoi病毒、牛骨脊病毒(cowbone ridge virus)、胡蒂亚帕病毒、莫多克病毒、萨尔别霍病毒、圣帕利塔病毒、布卡拉沙蝙蝠病毒、凯里岛病毒、达喀尔蝙蝠病毒、蒙大拿鼠耳蝙蝠白质脑炎病
毒、金边蝙蝠病毒、里约布拉沃病毒、玉名蝙蝠病毒和细胞融合剂病毒。
23.在另一个实施方案中，病毒选自沙粒病毒科成员，其包括伊皮病毒、拉沙病毒(例如约西亚、lp或ga391株)、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)、mobala病毒、莫佩亚病毒、amapari病毒、flexal病毒、瓜纳里多病毒、胡宁病毒、拉丁病毒、马秋波病毒、奥利韦罗斯病毒、巴拉那病毒、皮秦德病毒、pirital病毒、萨比亚病毒、塔卡里伯病毒、塔米亚米病毒、白水阿罗约病毒、chapare病毒和路约病毒。
24.在其他实施方案中，病毒可以选自布尼亚病毒科的成员(例如hantavirus、内罗病毒(nairovirus)、orthobunyavirus和白蛇病毒(phlebovirus)属的成员)，其中包括hantaan病毒、辛农布雷病毒、道格比病毒、布尼奥罗病毒、裂谷热病毒(rift valley fever virus)、拉克罗斯病毒、punta toro病毒(ptv)、加利福尼亚脑炎病毒和克里米亚-刚果出血热(cchf)病毒，来自丝状病毒科的病毒，包括埃博拉病毒(例如，扎伊尔、苏丹、科特迪瓦、雷斯顿和乌干达毒株)和马尔堡病毒(例如，安哥拉、ci67、莫索克、波普、ravn和维多利亚湖菌株)。
25.在实施方案中，病毒可以选自披膜病毒科的成员(例如，甲病毒属的成员)，其包括委内瑞拉马脑炎病毒(vee)、东部马脑炎病毒(eee)、西部马脑炎病毒(wee)、辛德毕斯病毒、风疹病毒、利基森林病毒、罗斯河病毒、巴马森林病毒、o'nyong'nyong病毒和chiklmgunya病毒；痘病毒科的成员(例如正痘病毒属的成员)，其包括天花病毒、牛痘、猴痘病毒和牛痘病毒；疱疹病毒科的成员，包括单纯疱疹病毒(hsv；1、2和6型)、人疱疹病毒(例如7和8型)、巨细胞病毒(cmv)、epstein-barr virus病毒(ebv)、水痘带状疱疹病毒和卡波西肉瘤相关疱疹病毒(kshv)。
26.在另一个实施方案中，病毒可以选自正粘病毒科的成员，其包括流感病毒(a、b和c)，如h5n1禽流感病毒或h1n1猪流感；冠状病毒科的成员，包括严重急性呼吸综合征(sars)病毒；弹状病毒科的成员，包括狂犬病病毒和水疱性口炎病毒(vsv)；副粘病毒科的成员，包括人呼吸道合胞病毒(rsv)、新城疫病毒、亨德拉病毒、尼帕病毒、麻疹病毒、牛瘟病毒、犬瘟热病毒、仙台病毒、人副流感病毒(例如，1、2、3和4)、鼻病毒和腮腺炎病毒。
27.在实施方案中，病毒可以选自小核糖核酸病毒科的成员，其包括脊髓灰质炎病毒、人肠道病毒(a、b、c和d)、甲型肝炎病毒和柯萨奇病毒；肝炎病毒科的成员，其包括乙型肝炎病毒。
28.在实施方案中，病毒可以选自乳头状病毒科的成员，其包括人乳头状瘤病毒；细小病毒科的成员，包括腺相关病毒；星状病毒科的成员，包括星状病毒；多瘤病毒科的成员，包括jc病毒、bk病毒和sv 40病毒；
29.在实施方案中，病毒可以选自包括诺沃克病毒在内的杯状病毒科成员。
30.在实施方案中，病毒可以选自呼肠孤病毒科的成员，其包括轮状病毒。
31.在实施方案中，病毒可以选自逆转录病毒科的成员，其包括人免疫缺陷病毒(hiv；例如1型和2型)和人t淋巴细胞病毒i型和ii型(分别为htlv-1和htlv-2)。
32.在实施方案中，病毒可以选自ateri病毒、乳多空病毒和回声病毒。
33.适当地，病毒可以选自编码已知拮抗1型ifn反应的蛋白质的病毒：
34.基孔肯雅病毒(chikv)
35.柯萨奇病毒
36.登革热病毒(denv)
37.埃博拉病毒(ebov)
38.epstein-barr病毒(ebv)
39.乙型肝炎病毒(hbv)
40.丙型肝炎病毒(hcv)
41.人巨细胞病毒(hcmv)
42.人免疫缺陷病毒(hiv)
43.人副流感病毒(hpiv)
44.人乳头瘤病毒(hpv)
45.人呼吸道合胞病毒(hrsv)
46.人鼻病毒(hrv)
47.单纯疱疹病毒(hsv)
48.甲型流感病毒(iav)
49.乙型流感病毒(ibv)
50.拉沙病毒(lasv)
51.麻疹病毒(mev)
52.中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)
53.腮腺炎病毒(muv)
54.尼帕病毒(niv)
55.脊髓灰质炎病毒(pv)
56.狂犬病病毒(rabv)
57.轮状病毒(rv)nsp1增强
58.严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)
59.牛痘病毒(vacv)
60.西尼罗河病毒(wnv)
61.黄热病病毒(yfv)
62.寨卡病毒(zikv)。
63.适当地，病毒可以选自由包膜病毒引起的病毒性疾病，优选地选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒1(hiv-1)、人免疫缺陷病毒2(hiv-2)、疱疹1病毒(hsv-l)、疱疹2病毒(hsv-2)、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、巨细胞病毒(cmv)、寨卡病毒(zkv)、登革热病毒、西尼罗河病毒、拉沙病毒、埃博拉病毒、lloviu病毒、本迪布焦病毒、雷斯顿病毒、苏丹病毒、泰森林病毒、马尔堡病毒、ravn病毒(raw)、肺炎病毒、胡宁病毒、裂谷热病毒、拉克罗斯病毒、猪生殖和呼吸综合征病毒、痘病毒、牛病毒性腹泻诺如病毒、sars冠状病毒、基孔肯雅病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、施马伦贝格病毒、非洲猪瘟病毒、东方马脑炎病毒、牛痘病毒、西方马脑炎病毒、尼帕病毒、鄂木斯克出血热病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、人副流感病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、俄罗斯春夏脑炎(rsse)病毒、黄热病病毒、新城疫病毒、病毒(bvdv)、5型副流感病毒(piv5)、绵羊边界病病毒(bdv)、经典猪瘟病毒(csfv)、水疱性口炎病毒(vsv)和hsv-2阿昔洛韦抗性(hsv-2acy r)，更优选地，包膜病毒选自由以下组成的组：hiv-1、hsv-1、hsv-2、hcmv、rsv、vsv、h1n1、denv-2和zkv。
64.适当地，病毒感染可以选自冠状病毒感染，特别是来自严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)和严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)的感染。
65.在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 2包含氨基酸序列seq id no：3或其功能活性片段或变体或由其组成。功能活性可以通过使用本文所述的测定通过表征抗病毒活性来确定，例如通过以下的一项或多项：细胞病变效应、斑块形成、对il 17f产生的影响、对人白细胞产生cxcl 10的影响、对干扰素γ产生的影响、对tnfα分泌的影响、对细胞凋亡的诱导、对nk细胞聚集的影响。可以将功能变体和片段与hybrid 2的活性进行比较，以确定那些显示出相似活性的变体，适当地为几种测定提供相似的活性范围。
66.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14包含氨基酸序列seq id no：1或其功能活性片段或变体或由其组成。
67.在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 1包含氨基酸序列seq id no：2或其功能活性片段或变体或由其组成。
68.在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 2包含氨基酸序列seq id no：3或其功能活性片段或变体或由其组成。
69.在实施方案中，施用方法是舌下施用。在实施方案中，施用方法是口服施用。在实施方案中，施用方法是注射。在实施方案中，施用方法是通过气溶胶递送至肺。
70.在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 2通过舌下施用来施用。在实施方案中，干扰素α亚型可以每天一次、每天两次、每天三次或每天四次施用。适当地，在舌下施用中，可以每天提供单次剂量。
71.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量是低剂量。在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量在104至5x106iu单位/ml之间。在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量低于当前对冠状病毒感染的全身治疗。
72.以5iu/ml、10iu/ml、50iu/ml、1x102iu/ml、1x103iu/ml、1x104iu/ml、1x105iu/ml、1x106iu/ml或1x107iu/ml的剂量施用干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2。
73.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2以0.1mg至1mg之间、适当地以1ng-50微克之间的剂量施用。例如，在人应用中，可以使用5x104iu/ml单位或更少。
74.在实施方案中，通过舌下施用来施用干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2。在实施方案中，干扰素α亚型可以每天一次、每天两次、每天三次或每天四次施用。适当地，在舌下施用中，可以每天提供单次剂量。
75.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2中断冠状病毒的病毒活性。在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2抑止冠状病毒的细胞病变效应或斑块形成。
76.在某些实施方案中，受试者可能患有由冠状病毒引起的病况。在实施方案中，受试者可能患有呼吸道感染或肺炎，或急性呼吸窘迫综合征(ards)。
77.通常，受试者是哺乳动物，特别是人。在实施方案中，受试者可以是鸟。在实施方案中，受试者可以是动物。
78.在某些实施方案中，该方法包括施用治疗有用量的合适的抗病毒化合物的步骤。
在实施方案中，抗病毒化合物是利巴韦林。在与干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2组合的实施方案中，进一步的治疗可以选自瑞德西韦、lam-002a(阿匹莫德(apilimod)——选择性pikfyve激酶抑制剂)、地塞米松和avigan(法维拉韦)。
79.根据本发明的第二方面，提供了干扰素α亚型，其中该干扰素α亚型是ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2或ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2中任一种的组合，例如ifn-α14和hybrid 1或ifn-α14和hybrid 2或hybrid 1和hybrid 2，其用于治疗和/或预防病毒感染，特别是冠状病毒感染。
80.在实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)或严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。
81.在实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)。
82.在实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。
83.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14包含氨基酸序列seq id no：1或其功能活性片段或变体或由其组成。
84.在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 1包含氨基酸序列seq id no：2或其功能活性片段或变体或由其组成。
85.在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 2包含氨基酸序列seq id no：3或其功能活性片段或变体或由其组成。
86.根据本发明的第二方面，提供了用于治疗和/或预防病毒感染的干扰素α亚型hybrid 2。
87.在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 2包含氨基酸序列seq id no：3或其功能活性片段或变体或由其组成。
88.在实施方案中，hybrid 2的治疗有效量是低剂量。在实施方案中，干扰素α亚型hybrid 2的治疗有效量在104至5x106iu单位/ml之间。在实施方案中，hybrid 2的治疗有效量低于当前对冠状病毒感染的全身治疗。
89.在实施方案中，以5iu/ml、10iu/ml、50iu/ml、1x102iu/ml、1x103iu/ml、1x104iu/ml、1x105iu/ml、1x106iu/ml或1x107iu/ml的剂量施用hybrid 2。
90.在实施方案中，以0.1mg至1mg之间、适当地以1ng-50微克之间的剂量施用hybrid 2。例如，在人应用中，可以使用5x104iu/ml单位或更少。在动物，例如狗中，舌下使用可以是104iu/kg，例如在1ml pbs中。
91.在某些实施方案中，干扰素α亚型可以舌下施用。在实施方案中，施用方法是口服施用。在实施方案中，施用方法是注射。
92.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量是低剂量。在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量在104至5x106iu单位/ml之间。在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量低于当前对冠状病毒感染的全身治疗。
93.以5iu/ml、10iu/ml、50iu/ml、1x102iu/ml、1x103iu/ml、1x104iu/ml、1x105iu/ml、1x106iu/ml或1x107iu/ml的剂量施用干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2ml。
94.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2以0.1mg至1mg之间、适当地1ng-50微克之间的剂量施用。例如，在人应用中，可以使用5x104iu/ml单位或更少。在动物，例如狗中，舌下使用可以是104iu/kg，例如在1ml pbs中。
95.在实施方案中，干扰素α亚型可以每天一次、每天两次、每天三次或每天四次施用。适当地，在舌下施用中，可以每天提供单次剂量。
96.在与干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2组合的实施方案中，进一步的治疗可以选自瑞德西韦、lam-002a(阿匹莫德(apilimod)——选择性pikfyve激酶抑制剂)、地塞米松和avigan(法维拉韦)。
97.根据本发明的第三方面，提供干扰素α亚型在制备用于治疗和/或预防病毒感染，特别是冠状病毒感染的药物中的用途，其中干扰素α亚型是ifn-α14、hybrid 1、hybrid 2或ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2中任一种的组合，例如ifn-α14和hybrid 1或ifn-α14和hybrid 2或hybrid 1和hybrid 2。
98.根据本发明的进一步面，提供了包含干扰素α亚型的组合物用于治疗和/或预防病毒感染，特别是冠状病毒感染，其中干扰素α亚型是ifn-α14、hybrid 1、hybrid 2或ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2中任一种的组合，例如ifn-α14和hybrid 1或ifn-α14和hybrid 2或hybrid 1和hybrid 2。
99.根据本发明的进一步方面，提供了包含干扰素α亚型的药物组合物用于治疗和/或预防病毒感染，特别是冠状病毒感染，其中干扰素α亚型是ifn-α14、hybrid 1、hybrid 2或ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2中任一种的组合，例如ifn-α14和hybrid 1或ifn-α14和hybrid 2或hybrid 1和hybrid 2。
100.在实施方案中，药物组合物可以提供与进一步治疗组合的干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2，其中进一步治疗可以选自瑞德西韦、lam-002a(阿匹莫德(apilimod)——选择性pikfyve激酶抑制剂)、地塞米松和avigan(法维拉韦)。
101.根据本发明的进一步方面，提供了干扰素α亚型用于调节免疫反应，其中干扰素亚型是ifn-α14、hybrid 1、hybrid 2或ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2中任一种的组合，例如ifn-α14和hybrid 1或ifn-α14和hybrid 2或hybrid 1和hybrid 2。
102.根据本发明的进一步方面，提供了用于调节免疫反应的hybrid 2。
103.在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2与选自瑞德西韦、lam-002a(阿匹莫德(apilimod)——选择性pikfyve激酶抑制剂)、地塞米松和avigan(法维拉韦)的进一步治疗的组合可用于调节免疫反应。
104.根据本发明的进一步方面，提供了干扰素α亚型以及抗病毒化合物用于治疗或预防病毒，特别是冠状病毒，特别是严重急性呼吸系统(sars)冠状病毒-1(sars-cov)或严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)感染的用途，其中干扰素α亚型是ifn-α14、hybrid 1、hybrid 2或ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2中任一种的组合，例如ifn-α14和hybrid 1或ifn-α14和hybrid 2或hybrid 1和hybrid 2。
105.根据本发明的进一步方面，提供了hybrid 2或其组合和抗病毒化合物用于治疗或预防病毒，特别是严重急性呼吸系统(sars)冠状病毒-1(sars-cov-1)或严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)感染的用途。适当地，病毒可以选自：
106.基孔肯雅病毒(chikv)
107.柯萨奇病毒
108.登革热病毒(denv)
109.埃博拉病毒(ebov)
110.epstein-barr病毒(ebv)
111.乙型肝炎病毒(hbv)
112.丙型肝炎病毒(hcv)
113.人巨细胞病毒(hcmv)
114.人免疫缺陷病毒(hiv)
115.人副流感病毒(hpiv)
116.人乳头瘤病毒(hpv)
117.人呼吸道合胞病毒(hrsv)
118.人鼻病毒(hrv)
119.单纯疱疹病毒(hsv)
120.甲型流感病毒(iav)
121.乙型流感病毒(ibv)
122.拉沙病毒(lasv)
123.麻疹病毒(mev)
124.中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)
125.腮腺炎病毒(muv)
126.尼帕病毒(niv)
127.脊髓灰质炎病毒(pv)
128.狂犬病病毒(rabv)
129.轮状病毒(rv)nsp1增强
130.严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)
131.牛痘病毒(vacv)
132.西尼罗河病毒(wnv)
133.黄热病病毒(yfv)
134.寨卡病毒(zikv)。
135.在上述本发明方面的实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)或严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。
136.在上述本发明方面的实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)。
137.在上述本发明方面的实施方案中，冠状病毒是严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)。
138.在上述本发明方面的实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14包含氨基酸序列seq id no：1或其功能活性片段或变体或由其组成。
139.在上述本发明方面的实施方案中，干扰素α亚型hybrid 1包含氨基酸序列seq id no：2或其功能活性片段或变体或由其组成。
140.在上述本发明方面的实施方案中，干扰素α亚型hybrid 2包含氨基酸序列seq id no：3或其功能活性片段或变体或由其组成。
141.在上述本发明方面的实施方案中，组合物或药物组合物是舌下施用的。这对于兽医治疗可能特别有利。在实施方案中，施用方法是口服施用。在实施方案中，施用方法是注射。
142.在上述本发明方面的实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量是低剂量。在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量在104至5x106iu单位/ml之间。在实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2的治疗有效量低于当前对冠状病毒感染的全身治疗。
143.在上述本发明方面的实施方案中，以5iu/ml、10iu/ml、50iu/ml、1x102iu/ml、1x103iu/ml、1x104iu/ml、1x105iu/ml、1x106iu/ml或1x107iu/ml的剂量施用干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2。
144.在上述本发明方面的实施方案中，干扰素α亚型ifn-α14、hybrid 1和hybrid 2以0.1mg至1mg之间、适当地以1ng-50微克之间的剂量施用。例如，在人应用中，可以使用5x104iu/ml单位或更少。
145.在上述本发明方面的实施方案中，干扰素α亚型可以每天一次、每天两次、每天三次或每天四次施用。适当地，在舌下施用中，可以每天提供单次剂量。
146.在上文概述的本发明方面的某些实施方案中，ifn-α亚型包含ifn-α14、由其组成或为ifn-α14，如融合蛋白或重组蛋白等，特别是其包含氨基酸序列seq id no：1或其变体或片段或由其组成。在实施方案中，可以将ifn-α14或hybrid 1或hybrid 2糖基化。
147.在上文概述的本发明方面的某些实施方案中，ifn-α亚型包含hybrid 1、由其组成或为hybrid 1，如融合蛋白或重组蛋白等，特别是其包含氨基酸序列seq id no:2或其变体或片段或由其组成。
148.在上文概述的本发明方面的某些实施方案中，ifn-α亚型包含hybrid 2、由其组成或为hybrid 2，如融合蛋白或重组蛋白等，特别是其包含氨基酸序列seq id no:3或其变体或片段或由其组成。
149.在本发明的进一步方面，提供了包含seq id no：1或其片段或变体或由其组成组成的重组多肽。本发明延伸至衍生自氨基酸序列seq id no：1的核酸序列。
150.在本发明的进一步方面，提供了包含seq id no：2或其片段或变体或由其组成的重组多肽。本发明延伸至衍生自氨基酸序列seq id no：2的核酸序列。
151.在本发明的进一步方面，提供了包含seq id no：3或其片段或变体或由其组成的重组多肽。本发明延伸至衍生自氨基酸序列seq id no：3的核酸序列。
152.发明详述
153.本发明的发明人惊奇地发现施用ifn-α14，例如seq id no：1或其变体或片段、ifn-α14/ifn-α10杂合体，如hybrid 1，例如seq id no：2或其变体或片段或hybrid 2，例如seq id no：3或其变体或片段，如本文所述，导致抑制或抑止与冠状病毒感染中的免疫反应相关的病毒活性。适当地施用ifn-α14，例如seq id no：1或其变体或片段、ifn-α14/ifn-α10杂合体，如hybrid 1，例如seq id no：2或其变体或片段或hybrid 2，例如seq id no：3或其变体或片段，如本文所述，可用于治疗冠状病毒感染，特别是严重急性呼吸综合征冠状病
毒-2(sars-cov-2或covid19)。令人惊讶的是，当ifn-α14、hybrid 1或hybrid 2舌下施用时这种效应可能会增强。
154.seq id no：1是ifnα-14并且可以定义如下：
155.cnlsqthslnnrrtlmlma qmrrispfsclkdrhdfefp
156.qeefdgnqfqkaqaisvlhe mmqqtfnlfstknssaawde
157.tllekfyielfqqmndleac viqevgveetplmnedsila
158.vkkyfqritlylmekkyspc awevvraeimrslsfstnlq krlrrkd
159.seq id no：2是hybrid 1，可以定义如下：
160.cdlpqthslgnrralillgqmgrispfsclkdrhdfripqeefdgnqfqkaqaisvlhemmqqtfnlfstenssaaweqtllekfsielfqqmndleacviqevgveetplmnedsilavrkyfqritlylierkyspcawevvraeimrslsfstnlqkrlrrkd
161.seq id no：3是hybrid2，可以定义如下：
162.cdlpqthslgnrralillgqmgrispfsclkdrhdfripqeefdgnqfqkaqaisvlhemmqqtfnlfstknssaawdetllekfyielfqqmndleacviqevgveetplmnedsilavkkyfqritlylierkyspcawevvraeimrslsfstnlqkrlrrkd
163.特别是，发明人发现ifnα-14，特别是seq id no：1、hybrid1(seq id no:2)或hybrid 2(seq id no:3)或其变体或片段，抑止冠状病毒感染导致的细胞病变效应和斑块形成。细胞病变效应或细胞致病效应是指由病毒入侵引起的宿主细胞的结构变化。
164.特别是，发明人发现hybrid 2(seq id no:3)或其变体或片段，抑止细胞病变效应和斑块形成。细胞病变效应或细胞致病效应是指由病毒入侵引起的宿主细胞的结构变化。
165.本发明人还确定了重组ifn-杂合分子hybrid 2(seq id no：3)对干扰素受体具有高结合亲和力。
166.发明人已经证明天然分子ifnα-14，特别是seq id no：1、seq id no：2、seq id no：3或其变体或片段，在非常低的剂量下阻断或抑止冠状病毒的作用。这些发现可用于提供用于治疗和/或预防冠状病毒感染，特别是严重急性呼吸综合征冠状病毒-1(sars-cov-1)、人冠状病毒nl63、人冠状病毒hku1、中东部呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)或严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2或covid19)的感染，的改善方法和改善组合物。
167.pct公开号wo2014/037717和pct公开号wo2015/136287中讨论了干扰素亚型ifn-α10和ifn-α14及其杂合体。尤其是，公开了ifn-α10-ifn-α14杂合体，其含有基于所有12种α-干扰素的共有主链序列的ifn-α10和ifn-α14亚型结合位点的序列特征。干扰素亚型ifn-α10和ifn-α14及其杂合体也在pct公开号wo2017/046583中进行了讨论。尤其是，公开了ifn-α10-ifn-α14杂合体，其具有衍生自ifn-α10和ifn-α14亚型的高亲和力结合位点，这些亚型并非基于所有12种ifn-α亚型的共有序列。杂合体获得了ifn-α10和ifn-α14亚型的序列特征，而没有其他10种干扰素-α亚型的序列特征。
168.本发明人还确定了本文称为hybrid 1(seq id:2)和hybrid 2的重组ifn-杂合分子(seq id no：3)对干扰素受体也具有高结合亲和力。
169.尽管不希望受理论束缚，但本发明人认为包含ifn-α10氨基酸序列的蛋白质对干扰素受体2(ifnr2)具有更大的亲和力，而包含ifn-α14氨基酸序列的蛋白质对干扰素受体1(ifnr1)具有更大的亲和力。因此，认为用允许结合干扰素受体1的ifn-α14氨基酸取代包含
ifn-α10氨基酸序列的蛋白质或用允许结合干扰素受体2的ifn-α10氨基酸取代包含ifn-α14氨基酸序列的蛋白质提供了ifn-α10 ifn-α14杂合蛋白，该杂合蛋白与干扰素受体1和2两者的结合亲和力应当比其与ifn-α10或ifn-α14单独的结合亲和力更高。包括ifn-α10和ifn-α14的主要干扰素受体结合位点是指杂合体包含选自ifn-α10的氨基酸并将其取代到ifn-α14氨基酸序列中以改善ifn-α亚型结合干扰素受体2的能力和/或杂合体包含选自ifn-α14的氨基酸并将其取代到ifn-α10氨基酸序列中以改善ifn-α10亚型结合干扰素受体1的能力。
170.适当地，确定涉及与干扰素受体1的结合的包含ifn-α10氨基酸序列和ifn-α14的氨基酸的蛋白质的多个氨基酸取代可增强蛋白质与干扰素受体1的结合。适当地，确定涉及与干扰素受体2的结合的包含ifn-α14的氨基酸序列和ifn-α10的氨基酸的蛋白质的氨基酸取代可增强蛋白质与干扰素受体2的结合。
171.在实施方案中，ifn-α10-ifn-α14杂合体可基本上具有ifn-α10的氨基酸序列，但在氨基残基80至150之间或适当地在氨基酸残基84至144之间或适当地在氨基酸残基92至115之间或适当地在氨基酸残基90至110之间的区域进行修饰，(利用ifn-α10序列的编号)以提供由ifn-α14序列提供的氨基酸。认为这些区域或这些区域的部分中的氨基酸残基提供了ifn-α14与干扰素受体1的结合。特别地，杂合序列可以包括对ifn-α10序列的至少一个、至少两个、至少三个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少11个修饰以提供ifn-α14序列的相应残基或其保守突变。在实施方案中，提供了十一个修饰，如粗体标注的氨基酸所示。
[0172][0173]
(hybrid 2:seq id no:3)。
[0174]
在实施方案中，ifn-α10-ifn-α14杂合体序列可包括至少一个选自第94、101、102、109或144位氨基酸的突变，优选至少两个选自第94、101、102或144位氨基酸的突变，更优选至少三个选自第94、101、102、109或144位氨基酸的突变，更优选至少四个选自第94、101、102、109或144位氨基酸的突变或更优选至少五个选自第94、101、102、109或144位氨基酸的突变。在替代实施方案中，ifn-α14可以用作杂合体的主链结构，并且如在ifn-α10序列中存在的那些一样，可以在该杂合体序列中提供在序列的n和c末端区域的ifn-α10和ifn-α14序列之间不同的残基。适当地，可以产生ifn-α14n-末端序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少11个取代以在氨基酸在ifn-α10和ifn-α14之间不共享/共同的那些氨基酸位置处提供来自ifn-α10的残基。适当地，在ifn-α14c末端序列提供至少1个、2个或3个取代以在ifn-α10和ifn-α14之间不共享/共同的那些氨基酸位置处提供从ifn-α10到杂合序列的残基。在实施方案中，产生了来自ifn-α14的n末端序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或至少11个取代和产生了来自ifn-α14的c末端序列的至少1个、至少2个或3个取代以在ifn-α10和ifn-α14之间不共享/共同的那些氨基酸位置处提供从ifn-α10到杂合体的残基。
[0175]
功能活性是指包含ifn-α10和ifn-α14的主要干扰素结合位点的ifn-α10-ifn-α14
杂合多肽，其中向受试者施用肽或在受试者中表达肽促进对冠状病毒感染的免疫反应的抑制。此外，功能活性可以通过杂合肽抑制对冠状病毒感染的免疫反应的能力来指示。
[0176]
片段可包含来自seq id no：1、2或3的至少50个、优选100个、更优选150个或更多的连续氨基酸并且其具有功能活性。适当地，可以使用例如cdna的c-末端连续缺失来确定片段。然后可以将所述缺失构建体克隆到合适的质粒中。然后可以如本文所述测试这些缺失突变体的活性的生物活性。
[0177]
变体是指与seq id no：1、2或3至少70％同源，更优选与seq id no：1、2或3至少80％同源，更优选与seq id no：1、2或3至少90％同源，甚至更优选与seq id no:1、2或3至少95％同源，甚至更优选与seq id no:1、2或3至少96％同源，甚至更优选与seq id no：1、2或3至少97％同源，最优选与seq id no：1、2或3至少98％同源，与seq id no：1、2或3至少99％同源的氨基酸序列。变体涵盖seq id no:1、2或3的多肽序列，其包括氨基酸取代，尤其是已知具有高概率不会导致蛋白质的生物活性或构造或折叠的任何显著修饰的取代。这些取代，通常称为保守取代，是本领域已知的。例如精氨酸、赖氨酸和组氨酸的组是已知的可互换的碱性氨基酸。适当地，在实施方案中，具有相同电荷、大小或疏水性的氨基酸可以彼此取代。适当地，可以基于干扰素α亚型的氨基酸序列比对分析来选择任何取代，以在序列比对时提供对存在于其他α亚型中相似或相同位置的氨基酸的氨基酸取代。可以使用本领域已知的合适的分子生物学方法产生杂合体及其变体和片段。适当地，同源性可以通过序列同一性来描述。序列同一性可以通过本领域已知的方法确定，例如blast。
[0178]
本领域中ifnα的重组形式与多亚型形式之间存在许多差异。最明显的区别是每个拥有的ifnα亚型的数量。重组形式仅包含α2亚型——intron a
tm
(schering plough)的α2b形式和roferon
tm
(roche)的α2a形式。ifnα的多亚型形式包含ifnα的许多亚型。ifnα的多亚型形式是广谱药物，没有迹象表明任何一种ifnα亚型或多或少具有抗病毒活性。多亚型和重组形式的另一个区别是多亚型形式的制造过程中人细胞产生的ifnα2是糖基化的，而重组形式是非糖基化的，因为多亚型形式是通过细菌发酵产生的。糖基化在蛋白质产物的许多功能中起主要作用，如半衰期、生物活性及其免疫原性。因此，在开发治疗性或预防性治疗时，产品的糖基化是重要的考虑因素，因为它可能会影响施用后在体内的持续时间、治疗适当量的活性和对产品本身的耐受性。
[0179]
发明人已经发现施用ifn-α14，特别是seq id no:1、hybrid 1(seq id no:2)或hybrid 2(seq id no:3)或其变体或片段，与对照相比(没有对其施用ifn-α14，特别是seq id no:1、hybrid 1(seq id no:2)或hybrid2(seq id no:3)或其变体或片段)导致10％，优选20％，优选30％，优选40％，优选50％，优选60％，优选70％，优选80％，更优选90％更大地降低病毒活性，如细胞病变效应或斑块形成。
[0180]
发明人已经发现施用ifn-α14，特别是seq id no:1、hybrid 1(seq id no:2)或hybrid 2(seq id no:3)或其变体或片段，与以前的抗病毒药物相比导致10％，优选20％，优选30％，优选40％，优选50％，优选60％，优选70％，优选80％，更优选90％更大地降低病毒活性，如细胞病变效应或斑块形成。
[0181]
发明人已经发现施用hybrid 2(seq id no：3)或其变体或片段，与对照相比(没有对其施用hybrid 2(seq id no:3)或其变体或片段)导致10％，优选20％，优选30％，优选40％，优选50％，优选60％，优选70％，优选80％，更优选90％更大地降低病毒活性，如细胞
no：3或其变体或片段在冠状病毒感染的治疗中优于现有的抗病毒治疗的潜在优势。
[0192]
定义
[0193]
片段
[0194]
片段可以包含来自seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的至少50个，优选100个，更优选150个或更多的连续氨基酸，并且该片段有功能活性。适当地，可以使用例如cdna的c-末端连续缺失来确定片段。然后可以将所述缺失构建体克隆到合适的质粒中。然后可以如本文所述测试这些缺失突变体的活性的生物活性。可以使用本领域已知的合适的分子生物学方法产生片段。
[0195]
变体
[0196]
变体是指与seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3至少70％同源，更优选与seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3至少80％同源，更优选与seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3至少90％同源，更优选与seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3至少95％同源，更优选与seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3至少96％同源，更优选与seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3至少97％同源，更优选与seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3至少98％同源的氨基酸序列。变体涵盖seq id no：1、seq id no：2或seq id no：3的多肽序列，其包括氨基酸取代，尤其是已知具有高概率不导致任何蛋白质的生物活性或构造或折叠的显著修饰的取代。这些取代，通常称为保守取代，是本领域已知的。例如精氨酸、赖氨酸和组氨酸的组是已知的可互换的碱性氨基酸。适当地，在实施方案中，具有相同电荷、大小或疏水性的氨基酸可以彼此取代。适当地，可以基于干扰素α亚型的氨基酸序列比对分析来选择任何取代，以在序列比对时提供对存在于其他α亚型中相似或相同位置的氨基酸的氨基酸取代。可以使用本领域已知的合适的分子生物学方法产生变体。
[0197]
受试者
[0198]
如本文所定义，“受试者”包括并涵盖哺乳动物，如人、灵长类动物和家畜(例如羊、猪、牛、马、驴)；实验室试验动物，如小鼠、兔、大鼠和豚鼠；和伴侣动物，如狗和猫。
[0199]
治疗/疗法
[0200]
本文使用的术语“治疗”是指可以使人或非人动物受益的任何方案。治疗可以针对冠状病毒感染并且治疗可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可能包括治疗或缓解效用。本文提及的“治疗性”和“预防性”治疗应在其最广泛的范围内考虑。术语“治疗”并不一定意味着对受试者进行治疗直到完全康复。类似地，“预防性”并不一定意味着受试者最终不会感染疾病病况。因此，治疗性和/或预防性治疗包括改善冠状病毒感染的症状或预防或以其他方式降低发生冠状病毒感染的风险。可认为术语“预防性”是降低特定病况的严重性或发作。“治疗性”还可以降低现有病况的严重程度。
[0201]
施用
[0202]
用于本发明的活性成分，特别是干扰素亚型ifn-α14，例如本文所述的seq id no:1、hybrid 1(seq id no:2)或hybrid 2(seq id no:3)可以作为药物或免疫原性组合物单独地施用给同一受试者，任选地依次施用，或者同时共同施用。
[0203]
本发明的干扰素和用于本发明的干扰素可以单独施用，或与另一种药剂联合施用，但优选作为药物组合物施用。药物组合物通常包含根据预期施用途径选择的合适的药
物赋形剂、稀释剂或载体。
[0204]
活性成分可以经由任何合适的途径施用于需要治疗的患者。精确剂量将取决于许多因素，如下文更详细讨论的。
[0205]
一些合适的施用途径包括(但不限于)口服、直肠、鼻、局部(包括颊和舌下)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外)施用，或经由口服或鼻吸入施用。
[0206]
该组合物可作为可注射组合物递送、口服施用、作为气溶胶经由口服或鼻吸入施用至肺。
[0207]
一种合适的施用途径是舌下，例如在受试者的舌下应用。
[0208]
对于经由口服或鼻吸入途径施用，优选活性成分将在合适的药物制剂中并且可以使用机械形式递送，包括但不限于吸入器或雾化器装置。
[0209]
进一步，在使用口服或鼻吸入途径的情况下，可以使用通过spag(小颗粒气溶胶发生器)施用。
[0210]
对于静脉内注射，活性成分将是肠胃外可接受的水溶液形式，该水溶液无热原并具有合适的ph、等渗性和稳定性。本领域相关技术人员能够很好地使用例如等渗媒介物，如氯化钠注射液、林格注射液、乳酸林格注射液来制备合适的溶液。根据需要，可以包括防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
[0211]
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊、粉末或液体形式。片剂可以包含固体载体，如明胶或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。可以包括生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖类溶液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0212]
该组合物还可以经由微球体、脂质体、其他微粒递送系统或置于某些组织(包括血液)中的持续释放制剂来施用。持续释放载体的合适实例包括共享物品形式的半透性聚合物基质，例如栓剂或微胶囊。可植入或微胶囊缓释基质包括l-谷氨酸和γ-l-谷氨酸乙酯、聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)或乙烯醋酸乙烯酯的聚丙交酯共聚物。
[0213]
上述技术和方案的实例以及可以根据本发明使用的其他技术和方案可以在remington's pharmaceutical sciences,16th edition,oslo,a.(ed),1980中找到。
[0214]
药物组合物
[0215]
如上所述，本发明延伸至用于治疗冠状病毒感染的药物组合物。
[0216]
根据本发明以及根据本发明使用的药物组合物，除了活性成分之外，还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲稳定剂或本领域技术人员熟知的其他材料。此列材料应该是无毒的并且不应该干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，例如，可以是口服、静脉内、鼻内或经由口服或鼻吸入。制剂可以是液体，例如含有ph 6.8-7.6的非磷酸盐缓冲液的生理盐溶液，或冻干或冷冻干燥粉末。
[0217]
剂量
[0218]
组合物优选以“治疗有效量”或“所需量”施用于个体，这足以显示对个体的益处。如本文所定义，术语“有效量”是指至少部分地获得所需反应或延迟发作或抑止进展或完全停止所治疗的特定病况的发作或进展所必需的量。该量取决于接受治疗的受试者的健康和身体状况、接受治疗的受试者的分类群、所需的保护程度、组合物的配方、医疗状况的评估
和其他相关因素。预计该量会落在比较宽的范围内，这可以通过常规试验来确定。治疗处方，例如剂量决定等，最终由全科医生、内科医生或其他医生负责并由其自行决定，并且通常会考虑要治疗的疾病、个体患者的病况、递送位点、施用方法和医师已知的其他因素。最佳剂量可以由医生根据许多参数确定，包括例如年龄、性别、体重、所治疗病况的严重程度、所施用的活性成分和施用途径。可以应用广泛的剂量范围。考虑到对人患者的口服施用，例如，可以施用每人剂量约10μg至约1000μg的药剂，任选3至4次剂量。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应并减少副作用。例如，可以每天、每周、每月或其他合适的时间间隔施用几个分开的剂量，或者可以根据情况的紧急状态按比例减少剂量。
[0219]
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语均具有本发明领域的本领域技术人员通常理解的含义。
[0220]
附图描述
[0221]
图1显示了ifnα-14对sars-cov-1冠状病毒感染后细胞病变效应的影响。
[0222]
图2显示了图表表明了ifnα-14对sars-cov-1冠状病毒感染后斑块形成的影响。
[0223]
图3显示了使用sars-cov-2抑止斑块测定的vero细胞进行斑块抑止测定的结果，其中将ifnα2a(市售亚型)与ifnα14进行比较并显示ic50-这表明α-14对抗covid 19病毒的效力比α-2a高20x。
[0224]
图4显示了比较5种干扰素(干扰素-α14、hybrid 2、hybrid 1、干扰素-β1a、干扰素-α2a)的研究中使用vero细胞的斑块抑止测定的结果，这再次基于其他4种“干扰素”的α-2a进行比较，其效力比α-2a高20x、10x、5x。
[0225]
图5显示了干扰素-α14对人内皮细胞合成cxcl-10的影响。cxcl-10是抗病毒nk细胞的引诱剂。
[0226]
图6显示了干扰素α14对颗粒酶b的快速诱导。颗粒酶b导致释放以杀死有病毒的细胞。
[0227]
图7显示了hybrid 2对il-17a合成的抑制。干扰素α14非常强地抑止17a和f。认为il17炎症是ards中的重要问题。
[0228]
图8显示了hybrid 2对il 17f的抑制。
[0229]
图9显示了hybrid 2对人白细胞产生cxcl 10的影响。
[0230]
图10显示了干扰素γ的产生。
[0231]
图11显示了tnfα的分泌。
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图12显示了来自免疫细胞和hybrid 2的图像。
[0233]
图13显示了hybrid 2可以诱导细胞凋亡。
[0234]
图14显示了nk细胞聚集。
[0235]
图15显示了hybrid 2对nk细胞的直接激活。
[0236]
图16显示了hybrid 2对人rsv斑块测定的抑止。
[0237]
实验数据
[0238]
本发明人使用基于由sars-cov-1和sars-cov-2感染引起的细胞病变效应和斑块形成的模型系统检验了合成α-干扰素hybrid 2抑止病毒感染的能力。本发明人还研究了与抗病毒化合物利巴韦林和多亚型干扰素multiferon
tm
相比对细胞病变作用的抑止。此外，本发明人利用rsv来证明hybrid 2的抗病毒作用。
[0239]
rsv感染是婴儿住院的最重要原因，也是婴儿死亡的主要原因之一。作为呼吸道病毒之一，与流感、鼻病毒和冠状病毒一样，它本身就很有趣，并提供了指示性模型。
[0240]
实验1：ifnα-14对sars-cov-1冠状病毒感染后细胞病变效应的影响。
[0241]
在细胞病变终点测定中测试了干扰素α亚型ifn-α14抑止sars-cov-1感染后细胞病变效应的有效性。所有终点测定均使用多亚型multiferon和ifn-α14以及抗病毒利巴韦林进行比较。
[0242]
准备抗病毒治疗
[0243]
测试了广泛的浓度范围(通过十倍稀释获得)，该浓度涵盖了通常用于其他病毒宿主组合的抑制剂量。将化合物溶解在hank的缓冲盐溶液中。
[0244]
对于斑块测定，使用如下指定的生长培养基制备5倍药物稀释液。sars-cov-1产生和感染非洲绿猴(vero e6)细胞(美国菌种保藏中心(american type culture collection),manassas,va,usa)在75cm细胞培养瓶中繁殖，该培养瓶含有补充有10％胎牛血清(fcs；biological industries,israel)的由培养基199(sigma,st louis,usa)组成的生长培养基。sars-hcov2003va2774(来自新加坡一名sars患者的分离物)在vero e6细胞中繁殖。简而言之，将2ml原种病毒添加到vero e6细胞的汇合单层中，并在37℃、5％co2中孵育一小时。然后添加补充有5％fcs的13ml的培养基199。将培养物在5％co2中于37℃孵育，并通过倒置显微镜观察每个孔来测量细胞病变效应的抑止。在48小时后观察到75％或更高的抑止作用时，收集上清液。上清液以2500rpm澄清，然后分装到冷冻管中并储存在-80℃直至使用。
[0245]
病毒处理和滴定
[0246]
使用一式两份进行的斑块测定确定冷冻培养上清液中的病毒滴度。简而言之，将100微升10倍系列稀释的病毒添加到24孔板中的单层vero e6细胞中。在37℃、5％co2中孵育一小时后，加入补充有5％fcs的病毒培养基199。细胞用10％(v/v)福尔马林固定并用2％(w/v)结晶紫染色。肉眼计数斑块并计算以每毫升斑块形成单位(pfu/ml)为单位的病毒滴度。
[0247]
细胞病变终点测定
[0248]
一式四份测试每种抗病毒治疗的效果。简而言之，将每次处理的100微升连续10倍稀释液与100微升vero e6细胞一起孵育，在96孔板中得到每孔20,000个细胞的最终细胞计数。对于干扰素制剂，在37℃在5％co2中孵育过夜，对于感染(moi)(每个细胞的病毒颗粒)为0.5时孵育一小时。将板在37℃在5％co2中孵育3天，每天观察板的细胞病变效应。终点是在所有四种设置中抑止细胞病变效应的稀释浓度。
[0249]
为了确定细胞毒性，将每次处理的100微升连续10倍稀释液与100微升vero e6细胞一起孵育，在96孔板中得到每孔20,000个细胞的最终细胞计数，无需病毒攻击。然后将板在5％co2中在37℃孵育三天，并使用倒置显微镜观察毒性作用。
[0250]
然后将浓度为10,000pfu/孔的10微升病毒添加到每个测试孔中。这相当于感染(moi)(每个细胞的病毒颗粒)为0.5的复数。将板在37℃在5％co2中孵育三天，每天观察板的细胞病变效应。终点是在所有四种设置(cia100)中抑止细胞病变效应的稀释浓度。
[0251]
为了确定细胞毒性，将每次处理的100微升连续10倍稀释液与100微升vero e6细胞一起孵育，在96孔板中得到每孔20,000个细胞的最终细胞计数，无需病毒攻击。然后将板
在5％co2中在37℃孵育三天，并使用倒置显微镜观察毒性作用。在103和102pfu/孔的较低病毒滴度下进一步测试显示完全抑制的干扰素。
[0252]
实验2：ifnα-14对sars-cov-1冠状病毒感染后斑块形成的影响。
[0253]
在斑块减少测定中测试了干扰素α亚型ifn-α14抑止sars-cov-1感染后斑块形成的有效性。
[0254]
使用10倍稀释的病毒原液进行斑块测定，并将0.1ml等分试样接种到易感细胞单层上。在允许病毒附着在细胞上的孵育期之后，单层被含有物质(通常是琼脂)的营养培养基覆盖，这种物质会导致凝胶的形成。铺板孵育后，原始感染细胞释放出病毒后代。新病毒的传播被凝胶限制在邻近的细胞中。因此，每个感染性颗粒都会产生圆形的感染细胞区域，称为斑块。最终，斑块变得大到肉眼可见。染色活细胞的染料用于增强活细胞和斑块之间的对比度。只有对细胞造成可见损伤的病毒才能以这种方式进行测定，即sars-cov-1。
[0255]
这些结果清楚地表明了合成的α-干扰素、干扰素-α-14(seq id no:1)能够抑止由sars-cov-1感染引起的细胞病变效应和斑块形成。结果表明，与抗病毒化合物利巴韦林和多亚型干扰素multiferon
tm
相比，细胞病变效应得到抑制。令人惊讶的是，干扰素-α14(seq id no:1)对sars-cov-1具有活性，而利巴韦林和多亚型干扰素multiferon
tm
显示的抑止活性要低得多。hybrid 1和hybrid 2显示出相似的功能效应。这些结果清楚地表明了ifnα-14，特别是seq id no:1、hybrid 1，特别是seq id no：2或hybrid 2，特别是seq id no：3或其变体或片段在冠状病毒感染的治疗中优于现有的抗病毒治疗的潜在优势。
[0256]
实验3：ifnα-14对sars-cov-2冠状病毒感染后斑块形成的影响。
[0257]
在斑块减少测定中测试了干扰素α亚型ifn-α14抑止sars-cov-2感染后斑块形成的有效性。
[0258]
使用10倍稀释的病毒原液进行斑块测定，并将0.1ml等分试样接种到易感细胞单层上。在允许病毒附着在细胞上的孵育期之后，单层被含有物质(通常是琼脂)的营养培养基覆盖，这种物质会导致凝胶的形成。铺板孵育后，原始感染细胞释放出病毒后代。新病毒的传播被凝胶限制在邻近的细胞中。因此，每个感染性颗粒都会产生圆形的感染细胞区域，称为斑块。最终，斑块变得大到肉眼可见。染色活细胞的染料用于增强活细胞和斑块之间的对比度。只有对细胞造成可见损伤的病毒才能以这种方式进行测定，即sars-cov-2。
[0259]
这些结果(图3和图4)清楚地表明了合成的α-干扰素、干扰素-α-14(seq id no：1)能够抑止由sars-cov-2感染引起的细胞病变效应和斑块形成。结果表明，与其他干扰素相比，细胞病变效应得到抑制。干扰素-α14(seq id no:1)、hybrid 1和hybrid 2对sars-cov-2具有活性。这些结果清楚地表明了ifnα-14，特别是seq id no:1、hybrid 1，特别是seq id no：2或hybrid 2，特别是seq id no：3或其变体或片段在冠状病毒感染的治疗中优于现有的抗病毒治疗的潜在优势。
[0260]
与il-17、颗粒酶b、干扰素γ、干扰素α、nk细胞相关的测定
[0261]
如本领域所理解的，进行了利用干扰素α14和杂合体2与关键免疫调节子相关的测定。
[0262]
hybrid 2对免疫细胞杀伤的影响
[0263]
在incucyte zoom平台上的免疫细胞杀伤活细胞成像测定中测试了杂合重组干扰素的效果。
[0264]
具有红色标记细胞核的sk-ov-3卵巢癌细胞(sk-ov-3 nuclight red)在研究中用作靶细胞。对于免疫细胞杀伤，细胞与自然杀伤(nk)细胞共培养，阳性对照由用il-2和il-12处理的细胞组成。细胞凋亡通过染色caspase 3/7阳性对象检测，细胞数通过红核计数确定。将共培养模型的结果与仅由sk-ov-3 nuclight red细胞组成的单培养模型的结果进行了比较。
[0265]
进行了初始优化实验，测试了靶细胞和效应细胞的4种比例。这些结果确定96孔板的每孔5,000个自然杀伤细胞和2,000个sk-ov-3 nuclight red细胞为检测免疫细胞杀伤提供了合适的测定窗口。
[0266]
测试了从10iu/ml到3x106iu/ml的8种剂量的杂合重组干扰素对免疫细胞杀伤的影响。将结果与未处理对照、媒介物处理的对照和il-2/il-12处理的细胞进行比较。所有条件均使用共培养(sk-ov-3 nuclight和nk细胞)和单培养(sk-ov-3 nuclight red)中的细胞进行测试。
[0267]
使用incucyte zoom监测细胞4天，并使用incucyte软件随时间测量绿色(细胞凋亡)和红色(细胞数)对象计数。曲线下面积(auc)分析用于定量随时间进程的细胞凋亡和细胞数量。
[0268]
已确定il-17、il-6、ccl-5和免疫反应在covid-19感染后受到调节，特别是covid-19诱导的急性呼吸窘迫综合征，其中认为il-17炎症是显著的。
[0269]
杂合重组干扰素在共培养模型中引起细胞凋亡的强诱导，auc从媒介物对照中的200增加到杂合重组干扰素最高剂量的1174。诱导细胞凋亡的ec
50
为1.5x106iu/ml。相比之下，单培养中的细胞对杂合rifn仅表现出微弱的反应。
[0270]
杂合重组干扰素也导致细胞数量减少。细胞数的auc值从媒介物对照中的39921下降到杂合rifn最高剂量的19501。确定细胞数量减少的ic
50
值为1.3x106iu/ml。
[0271]
有证据表明杂合rifn对自然杀伤细胞的直接激活非常强，在nk细胞单培养模型中观察到响应杂合重组干扰素处理的nk细胞的细胞聚集。
[0272]
如图5至15所示，已证明ifnα14，尤其是hybrid 2可调节il-17(非常强烈地抑止17a和f)、il-6、ccl-5和ccl-2，并提供抗病毒nk反应。
[0273]
在不脱离本发明的范围的情况下，对本发明的所述实施方案的各种修饰和变化对于本领域技术人员来说将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但应当理解，所要求保护的本发明不应被过度地限制于这些具体的实施方案。实际上，对本领域技术人员来说显而易见的实施本发明的所述模式的各种修饰旨在覆盖在本发明中。