生物假体装置用胶原基组织的加工方法与流程

1.本发明涉及一种新的组织加工技术，其处理生物组织(包括但不限于心包组织)用于生物假体心脏瓣膜(bhv)和心血管或其它组织修复。本发明的组织处理技术旨在通过减少残余戊二醛并去除不能单独被戊二醛掩盖(mask)的脂质/脂肪和抗原材料来消除或减少小叶组织钙化并减轻针对生物假体的其它宿主反应。


背景技术：

2.戊二醛固定的牛或猪心包自20世纪80年代以来被用作bhv的小叶材料，并被证明具有相当好的临床结果。除了外科手术植入的心包bhv外，经导管递送心脏瓣膜(thv)也使用心包作为小叶材料，并且已经成为非手术高危患者和患有主动脉狭窄的中等风险患者的标准治疗。然而，由于两个主要原因，所有bhv在植入患者后的寿命有限：(i)与原生活体心脏瓣膜不同，bhv缺乏对磨损造成的损伤的自我修复；(ii)生物假体小叶组织钙化相关的结构性瓣膜衰败(svd)和其他非钙化svd可以显著缩短装置寿命。事实上，不管品牌、型号或制造商如何，小叶组织钙化相关的svd仍然是bhv的头号慢性失效模式。虽然生物假体钙化的详细机制尚未完全理解，但据信用于保存小叶组织的化学物质，特别是戊二醛是导致组织钙化的主要因素之一。
3.心脏瓣膜生产商为减轻由于组织钙化引起的与戊二醛毒性相关的svd做出了巨大努力。几乎所有新一代的bhv都声称已经加入了某些类型的抗钙化处理，主要是通过尝试降低戊二醛的毒性。然而，这些努力似乎仅具有一些有限的临床效果，因为小叶组织钙化仍然是主要的慢性失效模式。这些临床观察结果提出了一个问题，即所谓的“残余戊二醛”在生物假体心脏瓣膜植入后钙化中的作用。事实上，绝大多数组织钙化发生在植入后数年，提示钙化可能与患者的生物学因素有关。这是因为，如果残余的戊二醛是触发生物假体小叶组织钙化的主要因素，那么可以预期植入患者体内的所有心脏瓣膜都会更快地钙化，这应该发生在所有植入物中。不幸的是，临床数据显示生物假体心脏瓣膜钙化的发生范围可以从数月到超过十年，这表明残余戊二醛既不是患者生物假体心脏瓣膜钙化的主要贡献者，也不是引发者。同时，存在于bhv中的与装置在含戊二醛的溶液中的存储有关的残余和游离戊二醛可在植入物上触发炎症反应，这可有助于宿主组织过度生长。
4.尽管使用戊二醛固定生物假体组织存在所有上述缺点，但戊二醛实际上是生物假体心脏瓣膜史上最重要的发现，因为戊二醛通过交联掩盖异种组织中的抗原，在减少宿主对生物假体的免疫应答方面发挥了关键作用，并通过提供组织的优异保存显著提高了生物假体的寿命。另一方面，积累的信息表明，戊二醛固定并没有完全掩盖异种组织的抗原性。这可能解释了为什么从抗小叶组织钙化的角度来看仅关注戊二醛解毒的策略临床疗效有限。因此，看来在bhv中观察到的钙化和其他失效模式可能归因于宿主对那些非活性材料的反应，特别是用于构建心脏瓣膜的组织的免疫原性。迄今为止，大多数抗钙化策略都集中在降低戊二醛的毒性上。很少有人努力有效地解决小叶组织本身(即，用于构建bhv的动物组织)的抗原性，特别是小叶组织固定后。
5.因此，本发明涉及的目的如下：(i)在戊二醛固定后去除组织抗原性；以及(ii)用可逆组织脱水技术处理心脏瓣膜并以非液体形式储存心脏瓣膜。


技术实现要素：

6.为了实现本发明的目的，提供了一种制备用于生物假体心脏瓣膜组件的心包组织的方法。根据该方法，从宿主动物采集心包组织，然后清洗。然后用戊二醛固定清洗过的组织。在固定组织之后，除去脂质/脂肪和残留的抗原组分，然后减少组织生物负荷。
7.根据本发明的一个实施方案，除去脂质/脂肪和残留抗原组分的步骤包括用乙醇(20％至70％)和吐温20(0.1％至1％)组成的溶液在缓冲盐水(ph 7.0-7.5)中在30℃至60℃下处理所述组织1至24小时，并进一步包括用含有一种或多种以下去污剂的去污剂溶液(0.1％至1％)处理所述组织：脱氧胆酸钠(sdc)、十二烷基硫酸钠(sds)、3-[n，n-二甲基(3-肉豆蔻酰氨丙基)氨]丙磺酸盐、氨基磺基甜菜碱-14(asb-14)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)]-1-丙磺酸内盐)(chaps)。此外，减少组织生物负荷的步骤使用65％至75％的乙醇来减少组织生物负荷。
[0008]
通过该方法制备的心包组织可用于制造生物假体心脏瓣膜组件。在根据该方法制备了组织之后，可以组装心脏瓣膜。作为组件的一部分，从处理过的小叶组织中解毒戊二醛，可逆组织脱水(rtd)是通过使用60％至95％的乙醇在25℃至55℃下脱水组织1至8小时进行的，然后用甘油(80％至95％)、乙醇(5％至10％)和去离子水(3％至10％)组成的混合物溶液在室温下处理组织30分钟至24小时。
附图说明
[0009]
图1是示出根据本发明的一个实施例的加工的流程图。
[0010]
图2是通过dsc(差示扫描量热法)说明戊二醛浓度和固定时间对组织交联的影响的图表。
[0011]
图3是说明戊二醛和乙醇对组织含水量的影响的图表。
[0012]
图4是说明乙醇(70％)对组织柔韧性的影响的图表。
[0013]
图5是说明rtd(可逆组织脱水)处理在再水合之前和之后对组织含水量的影响的图表。
[0014]
图6是说明rtd处理组织中组织变性温度变化的图表。
[0015]
图7是说明rtd处理对组织柔韧性的影响的图表。
具体实施方式
[0016]
下面的详细描述是目前考虑的实施本发明的最佳模式。该描述不是限制性的，而仅为了说明本发明实施例的一般原理。本发明的范围由所附权利要求书最好地限定。
[0017]
在图1的流程图中示出了根据本发明的一个实施例的本发明的组织加工。即使结合生物假体心脏瓣膜描述了该加工，也可以将该加工应用于其它瓣膜和生物假体装置。
[0018]
组织采集
[0019]
心包组织是一种包在心脏周围的富含胶原的纤维结缔组织。在组织采集步骤(步骤1)过程中，通过将心包囊(像“半个足球”(“half-football”)一样的袋子)从心脏基底
(base of the heart)的大血管分离，从而将心包囊从宿主动物的心脏去除。在剥离外层的脂肪/脂肪组织之后，用水，优选用冷的生理盐水(0.9％氯化钠)冲洗心包囊的纤维膜。然后将囊收集在含有冷盐水的塑料袋中，并运送到制造商进行进一步加工。通常，应在采集后72小时内加工组织。
[0020]
组织清洗
[0021]
在步骤2中，接收到后开始制造中的组织清洗加工(在组织加工中心)。首先切开心包囊并使之变平。检查组织是否有病理缺陷。然后将组织修剪成通常为矩形的相对规则的小块(patch)，并小心地去除表面上的额外脂肪或其他松散组织。然后用冷的生理盐水洗涤/冲洗组织，以除去任何残留的血液或组织碎片。
[0022]
组织固定
[0023]
然后在步骤3中固定组织。使用戊二醛(以下也称为“glut”)固定生物假体心脏瓣膜(bhv)的异种组织可能是心血管外科史上的主要创新之一。glut最初用于固定组织样本以进行病理学分析。大约50年前，glut被用于保存/固定bhv应用的生物假体组织，并且已经被证明是bhv历史上最有效的组织固定剂。许多其他的固定剂，如edc和京尼平(genipin)已经被尝试过，到目前为止，没有比glut更好的方法来保护bhv。
[0024]
戊二醛由两个醛基组成，具有高活性。通过以不可逆方式交联氨基酸的氨基来固定glut组织。glut可以在很宽的浓度范围(从0.1％到超过2％)内工作。大多数bhv制造商使用0.25％至0.625％的在缓冲磷酸盐盐水(pbs)溶液中的glut。若干因素决定了组织交联的效果，包括glut浓度、固定时间、温度、溶液ph和glut的纯度。由于用glut直接测量组织交联不可行，因此采用组织收缩温度和差示扫描量热法(dsc)等间接方法来确定组织交联状态。通常，有效的交联组织(心包)的初始变性温度约为84
±
3℃(采用dsc)，而未固定的新鲜(心包)组织约为64℃。据信，使用较高浓度是不可取的，这是由于担心所谓的“墙离(walling-off)”效应，即组织的边缘交联得太快，并可能阻止glut渗入组织的内部部位。本发明人的工作还证明，在室温下从0.25％至5％的glut溶液固定高达20小时的组织交联没有明显的差异(见图2)。虽然通过dsc进行的组织变性温度显示与组织(猪心包)固定30分钟存在浓度依赖性，但是对于0.25％或更高的浓度，该浓度依赖性差异在固定20小时后减小，如变性温度达到稳定水平所证明的。因此，如果固定时间从组织固定/保存时间起超过24小时，则使用0.25％至1％之间的glut浓度是足够的。
[0025]
去除脂质和抗原
[0026]
在步骤4中除去脂质和抗原。众所周知，由于免疫排斥，任何异种组织都不能直接植入人体。glut固定已显示通过暴露(unmask)组织中呈现的抗原而显著降低对含异种组织的装置(例如bhv)的免疫应答。如前所述，glut固定的bhv的寿命的主要挑战之一是钙化性和非钙化性svd。以前认为glut的毒性是导致bhv小叶组织钙化的主要因素。然而，现在已经很清楚，仅仅减少或消除glut毒性可能是不够的。未被glut固定充分暴露的其它潜在因素如脂质/脂肪和抗原可在与钙化和非钙化方式相关的svd中起重要作用。事实上，已经开发出许多方法来在固定之前从异种组织去除细胞和抗原。然而，所有这些方法都具有一个主要缺点，即组织加工可能损坏/改变组织结构。去细胞的组织通常由于松弛的胶原纤维而变厚，并且典型的纤维结构在某些情况下变得有些无定形。这些结构变化可能对组织完整性和长期耐久性产生影响。
[0027]
事实上，目前市场上还没有已知的由上述去细胞或去除抗原处理制成的生物假体心脏瓣膜。这是因为这些组织通常在固定之前直接对新鲜组织进行处理，导致永久性结构组织损伤，例如微观或宏观组织划界(tissue delimitation)、组织降解、胶原束松弛等。这些不希望的结构变化使得所得组织不能用作bhv小叶材料。
[0028]
相反，本发明在初始不可逆glut固定之后除去脂质/脂肪和残留抗原组分。具体地，利用由乙醇(20％至70％)和去污剂(如吐温20(0.1％至1％))组成的溶液在缓冲盐水(ph7.0-7.5)中在30℃至60℃下处理组织1至24小时。优选地，该溶液由30％乙醇或异丙醇和0.25％吐温20组成，在45+2℃下处理2小时。随后，用含有一种或多种去污剂的去污剂溶液(0.1％至1％)处理组织，所述去污剂包括但不限于脱氧胆酸钠(sdc)、十二烷基硫酸钠(sds)、3-[n，n-二甲基(3-肉豆蔻酰氨丙基)氨]丙磺酸盐、氨基磺基甜菜碱-14(asb-14)、3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基丙基)]-1-丙磺酸内盐)(chaps)。优选地，用0.5％sdc和0.25％asb-14的组合处理组织。由于在除去脂质和抗原性之前将用glut溶液固定组织，因此将保持组织的结构完整性，从而使组织更加生物相容，同时保持机械性能以获得持久的性能。
[0029]
减少生物负荷
[0030]
生物负荷减少处理是第5步。动物组织中的生物负荷定义为任何病原体，如细菌、真菌、病毒或存在于组织中的其他有机体。因为组织(如心包)是从健康动物身上采集的，这些动物被屠宰用作人类食用的肉，所以在采集之前的组织应该是干净的。在大多数情况下，病原体源自屠宰、组织采集、组织运输和组织加工期间的污染。采集后，组织应保存、储存和运输在冷生理盐水中，以尽量减少病原体的生长并防止组织降解。生物负荷的减少从用干净的生理盐水清洗组织开始，然后用glut溶液固定。由于病原体是活的有机体，可以通过交联它们的蛋白质和核酸而使它们被固定剂如glut灭活。因此，除了组织保存，glut也被用作消毒剂。然而，用于固定生物假体组织的典型浓度不足以消毒组织。采取附加的步骤来减少生物负荷。最常见的方法包括使用甲醛、去污剂和乙醇的组合，或glut和乙醇的组合，以进一步减少生物负荷。然而，甲醛被认为是具有致癌风险的高度危险材料，而glut和乙醇可能会引发化学反应，从而损害其功效。
[0031]
因此，本发明使用高浓度的乙醇来减少组织生物负荷。具体地，本发明使用65％至75％的乙醇来减少生物负荷。使用更高浓度的乙醇的普遍担忧是，它可能导致组织脱水，这可能导致组织特性的永久变化。
[0032]
本发明人最近的实验证明，通过上述乙醇浓度脱水是可逆的；这通过组织含水量(参见图3)和组织柔性测试(图4)证明。众所周知，glut固定的心包组织含有约80重量％的水。从含水量的角度来看，心包组织可以被认为是“海绵”一样的材料。水含量对于保持一些重要的机械性能(例如压缩性(对于瓣膜卷曲(crimping)期间的thv很重要)、柔韧性等)起着至关重要的作用。本发明人的实验证明，乙醇处理没有损害组织再水合，这表明通过乙醇处理的脱水是可逆的，如图3所示。同时，作为功能测量，乙醇处理的组织的组织柔韧性与处理前的组织相当，这表明乙醇处理对组织柔韧性没有有害影响，组织柔韧性是作为瓣膜小叶材料的最重要机械特征之一(图4)。因此，使用上述乙醇浓度范围对于生物负荷减少是可行的。乙醇的消毒/杀菌效果已经很好地确立。典型浓度为70％至75％。原理是，适当浓度的乙醇可以固定/沉淀蛋白质，同时使生物体/组织脱水。固定可能不如其他固定剂(如glut)
稳定。然而，如果新鲜组织在用glut固定之前用乙醇处理，则可能发生永久性组织损伤，
[0033]
在步骤5(减少生物负荷)之后，本发明的方法被分成两个可能的路径：
[0034]
a.湿式组装过程，其在液体中加工组织，包括心脏瓣膜组装。将在心脏瓣膜组装后应用glut解毒(步骤9)和可逆组织脱水(rtd：reversible tissue dehydration)处理(步骤10)。根据该路径，小叶组织应保持在溶液中或具有足够的水分以防止小叶永久干燥。
[0035]
b.干式组装过程，其在组装心脏瓣膜之前首先用glut解毒(步骤9)和rtd技术(步骤10)处理组织。根据该路径，心脏瓣膜将保持在脱水形式。
[0036]
在这两条路径中使用的步骤是相似的，但是以不同的顺序应用。主要区别在于：(1)对于湿式瓣膜组装(路径a)，在步骤10中，在水溶液中处理组织或保持组织充分水合直到rtd处理。通常，在任何给定的单个步骤中，组织不得暴露在空气中超过10分钟，以防止组织永久脱水；(2)对于干式组装过程(路径b)，在组织用rtd加工处理后，组织必须在空气中以“干燥”形式处理(不能再次暴露于任何水基水溶液)。从此开始，从切割小叶、瓣膜组装、到包装，组织可以像“布”料一样处理。
[0037]
切割小叶
[0038]
步骤6：心包的生物假体心脏瓣叶可以用模切机或激光机器切割。在本发明中，可以在路径a的湿组织上切出小叶，或者在路径b的脱水组织上切出小叶。
[0039]
瓣膜组装
[0040]
步骤7：心脏瓣膜可使用湿小叶组织(路径a)组装或在脱水组织上切割(路径b)。
[0041]
瓣膜检查和测试
[0042]
步骤8：在完成心脏瓣膜组装之后，检查心脏瓣膜组件的小叶接合或任何其它缺陷。理想情况下，应进行功能测试以评估即时功能(immediate functionality)，包括小叶打开/关闭、接合等。
[0043]
glut解毒
[0044]
步骤9：长期以来，glut的潜在毒性被认为是bhv小叶组织钙化的主要原因。因此，大多数当前的抗钙化策略集中在glut的解毒上，例如所谓的封端化学品(capping chemical)(例如硼氢化钠处理)，或使用动物酸中和游离glut。然而，关于这些解毒处理效果的声明主要基于动物植入物，需要通过长期的临床研究来证实。然而，最终装置中的游离glut可能是有问题的，因为glut是高度活性的，并且可以触发局部炎症反应，特别是由于当前大多数bhv存储在含有glut或甲醛的溶液中。因此，在本发明中，用生理盐水在室温下搅拌(30至70rpm)30分钟至60分钟以充分洗涤组织/心脏瓣膜，所述生理盐水优选含有0.5％至1％的甘氨酸或其它含氨基酸的胺，其体积比为1：10倍(瓣膜：溶液)。该步骤优选重复两至三次。虽然如上所述用盐水强烈洗涤组织可能足以除去组织中的游离残余glut，但添加氨基酸可减少任何游离残余glut并中和未交联的醛末端。
[0045]
rtd组织处理
[0046]
步骤10：根据本发明的可逆组织脱水(rtd)通过使用乙醇使预先固定的组织脱水来实现，然后用甘油溶液保存。具体来说，组织将在25℃至55℃下使用60％至95％的乙醇脱水1至8小时，优选在40℃下使用75％乙醇脱水2小时。然后将组织用由甘油(80％至95％)、乙醇(5％至10％)和去离子水(3％至10％)组成的混合物溶液在室温下处理30分钟至24小时。优选地，用90％甘油、7％乙醇和3％去离子水的混合物在室温下处理组织2小时。然后，
将通过手动使用非纤维布和/或结合使用定制的夹具来移除瓣膜上的过量化学品，以在手动过程之前移除瓣膜上的过量化学品。本发明人的实验结果表明，用上述溶液处理的组织可以基本上使组织脱水，并且在室温下用生理盐水再水合时组织是完全可逆的。见图5，其显示在glut固定之后，用本发明的rtd方法处理，然后在盐水中再水合之后，相同组织块中的水含量。在用本发明的rtd方法处理组织之后，与处理之前或再水合之后的组织相比，设计/预期的组织水含量显著更低(p《0.05)，证明rtd处理在组织含水量方面是完全可逆的。此外，在用本发明的rtd技术处理的预固定的猪心包中，组织交联(通过使用dsc变性温度)或组织柔韧性没有显著变化(参见图6和7)。这些实验结果证明，除了可防止组织再次暴露于基于化学的液体储存的可逆脱水之外，本发明的rtd组织处理的额外益处是减少组织中由较高浓度的乙醇引起的生物负荷，并且可能进一步减少组织中的任何残留脂质/脂肪。
[0047]
与先前存在的方法不同，本发明在初始组织固定之后去除残留的抗原组分，以保持组织结构的完整性，以用于其长期性能。此外，本发明使用较高浓度的乙醇来减少组织生物负荷，同时使组织脱水，然后用甘油保存组织，从而减轻生物假体心脏瓣膜的glut-储存相关问题。
[0048]
由于所提出的方法解决了市场上当前生物假体遇到的最具挑战性的问题，因此本发明中的全面组织加工方法预期将当前生物假体心脏瓣膜提高到下一水平。这些挑战包括与宿主免疫应答相关的组织钙化，残余的细胞和细胞外脂质/脂肪，以及glut毒性。同时，本发明最小化微观和宏观组织结构损伤，从而最大化瓣膜小叶和生物假体心脏瓣膜的机械耐久性。
[0049]
虽然以上描述涉及本发明的特定实施例，但是应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可以进行许多修改。所附权利要求旨在覆盖落入本发明的真实范围和精神内的这种修改。