抗新型冠状病毒感染的mRNA疫苗的组合物和方法与流程

抗新型冠状病毒感染的mrna疫苗的组合物和方法
1.本技术要求于2020年2月7日提交的美国临时申请62/971,834号、2020年7月29日提交的63/058,463号和2020年12月24日提交的63/130,581号的优先权，其中每个申请的内容通过引用整体并入本文中。
技术领域
2.提供了用于2019-ncov感染的疫苗接种、预防和治疗的预防和治疗剂，及它们的使用方法。


背景技术：

3.新型冠状病毒（2019-ncov）感染：生物学和病理学冠状病毒（cov）已多次跨越物种壁垒且有些已成为重要的人类病原体。在过去的20年里，两种感染动物的冠状病毒已经进化并在人类中引起了爆发：sars-cov（2002年，乙型冠状病毒属（betacoronavirus），沙贝冠状病毒（sarbecovirus）亚属）和mers-cov（2012年，乙型冠状病毒属，梅贝冠状病毒（merbecovirus）亚属）[drosten et al., new engl j med. 2003; 348: 1967-1976; zaki et al.,. new engl j med. 2012; 367: 1814-1820]。2019-ncov是一种新的冠状病毒毒株，此前未在人类中发现[zhu et al., n engl j med. 382:727-733 (2020)]。疫情已迅速蔓延至影响到中国其他地区及国外。现在已经在亚洲的几个国家中检测到了病例，而且在澳大利亚、欧洲和北美也检测到了病例。2019-ncov似乎可以通过呼吸道飞沫在人与人之间的接触中传播[li et al., n engl j med. 2020; 382:1199-1207]。
[0004]
遗传分析显示，2019-ncov与sars-cov密切相关并在遗传学上聚集在乙型冠状病毒属中，与两个蝙蝠衍生的sars样毒株一起形成了沙贝冠状病毒亚属b线的独特支系。该病毒基因组由冠状病毒共有的六个主要开放阅读框（orf）和其他一些附属基因组成。进一步的分析表明，2019-ncov基因中的一些与sars-cov的序列同一性低于80%。然而，用于cov物种分类的orf1ab中的七个保守复制酶（rdrp）结构域在2019-ncov和sars-cov之间有94.6%的aa序列相同，这意味着两者属于同一物种。血管紧张素转换酶ii（ace2）是一种膜外肽酶，以sars
‑ꢀ
cov的细胞受体为人所知。该受体也已被证明可被 2019-ncov 用于进入人体细胞。结构域266-330（根据成熟蛋白的序列编号）已被证明是2019-ncov与ace2相互作用所必需的[veljkovic et al., f1000research. 2020; 9: 52.]。
[0005]
目前对新型冠状病毒（2019-ncov）的预防和治疗目前，中国cdc等已在gisaid上提交了2019-ncov的287,543个全基因组序列[gisaid, newly discovered betacoronavirus, wuhan 2019-2020 (2019); https://www.gisaid.org/. ]，其中一个已在genbank上发布（accession: mn908947.3）[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/.] 。目前，只有两种紧急使用授权的疫苗而没有用于预防冠状病毒感染（包括2019-ncov感染）的许可疫苗。
[0006]
mrna疫苗的优势
接种疫苗是预防和控制疾病的最成功的医疗途径。疫苗的成功开发和使用挽救了成千上万的生命及节省了大量的金钱。rna疫苗的关键优势是rna可以在实验室里用现成的材料从dna模板中生产出来，与传统的疫苗生产相比，成本更低且速度更快，而传统的疫苗生产可能需要使用鸡卵或其他哺乳动物细胞。此外，mrna疫苗具有简化疫苗的发现和开发的潜能，并促进对新出现的传染病的快速反应[maruggi et al., mol ther.2019; 27(4):757-772。
[0007]
临床前和临床试验表明，mrna疫苗在动物模型和人类中提供了安全和持久的免疫反应。针对传染病的mrna疫苗可被开发为预防或治疗手段。表达感染性病原体抗原的mrna疫苗已被证明可诱导有效的t细胞和体液免疫反应[pardi et al.,nat rev drug discov. 2018; 17: 261
–
279.]。与生产整个微生物、减毒活疫苗和亚单位疫苗相比，产生mrna疫苗的生产程序是不需要细胞、简单和快速的。这种快速和简单的生产过程使mrna成为一种有可能填补新出现的传染病和对有效疫苗的迫切需求之间的差距的有前途的生物产品。


技术实现要素：

[0008]
提供了组合物，其含有配制在药学上可接受的载体中的有效量的信使核糖核酸（mrna），该信使核糖核酸含有编码2019-ncov蛋白或蛋白片段的开放阅读框（orf），其中mrna和载体形成聚合物纳米颗粒。2019-ncov蛋白可以是刺突（spike）（s）蛋白或刺突（s）亚单位。该orf可以是编码肽的mrna，所述肽例如是具有选自seq id 14至31或50-66的序列的肽。orf可以包含例如具有seq id no. 32至49或seq id no. 91至107中所示的序列的mrna。该orf可以选自编码seq id no. 11、13、68、70、72、74和90的氨基酸序列的mrna分子。所述orf可以具有例如seq id no. 1-4、10、12、67、69、71、73或89的序列。
[0009]
这些组合物还可以包含含有orf1a和/或orf1b的全部或一部分的mrna，其中所述mrna编码2019-ncov非结构蛋白聚合酶和/或rdrp。该orf可以是具有例如seq id no: 5或6的序列的mrna。该orf可以编码2019 ncov的全部或一部分，其编码包膜（e）、膜（m）和/或核衣壳（n）蛋白。这些组合物还可以含有一个或多个编码2019 ncov的全部或一部分的mrna序列，其编码包膜（e）、膜（m）和/或核衣壳（n）蛋白。该orf可选自具有如seq id no. 7、8或9所示序列的mrna分子。
[0010]
在这些组合物的任意一个中，可以用一个或多个n1-甲基假尿苷和/或假尿苷残基对mrna进行化学修饰。mrna中的尿苷残基可以全部为n1-甲基假尿苷或假尿苷。
[0011]
在这些组合物的任意一个中，mrna分子可进一步包含3'-utr、5'-utr并且任选地进一步含有额外的元件，所述额外的元件（a）稳定该组合物和（b）增强由orf编码的多肽的表达。5'-utr可以含有m7g帽（cap）结构和起始密码子和/或3'-utr可以含有终止密码子和多a尾（polya tail）。
[0012]
该组合物可以含有一个以上的orf并且可以编码至少两种多肽。
[0013]
该组合物可含有聚合物纳米颗粒载体，所述载体含有组氨酸-赖氨酸共聚物（hkp）。合适的hkp的例子包括但不限于具有选自seq id no: 75-88的侧链的聚合物。
[0014]
还提供了通过在线性体外转录（ivt）系统中或通过质粒dna（pdna）载体递送系统表达orf来制备上述组合物的方法。
[0015]
上述组合物可通过将含有orf的组合物与hkp接触而制备，其中mrna和hkp自组装
immunol.2005; 174(8): 4908-4915] 。这表明，含有rbd的重组蛋白和包括编码rbd序列的mrna的载体可用于开发安全有效的2019-cov疫苗。
[0034]
如本文所述，一种新型的mrna疫苗（mrna-1273）已经被开发出来，其使用含有信使核糖核酸（mrna）的免疫原性组合物，该信使核糖核酸含有编码来自2019-ncov的一种或多种蛋白质的一个或多个表位的开放阅读框（orf）。该mrna被配制在含有聚合物纳米颗粒和/或脂质体纳米颗粒的药学上可接受的载体中。该组合物可以以在对象中有效诱导针对2019-ncov的特异性免疫反应的量向该对象施用。该组合物可以含有一种以上的mrna分子。每个额外的拷贝增强组合物的免疫刺激活性。所有的mrna编码的抗原都具有高度的免疫原性，并且是2019-ncov进入上皮细胞（这是2019-ncov感染的第一个步骤）所必需的。
[0035]
在一个实施方案中，该组合物含有一个或多个编码2019-ncov的整个刺突（s）蛋白的mrna（图3）。s蛋白被病毒用来附着在宿主细胞受体上。编码刺突蛋白的mrna序列很长，因此为了提高mrna表达系统的制备效率，将其分为四个区域，当在刺突蛋白结构域的框架中表达时，这些区域中的一个、一些或全部可以用作针对刺突蛋白结构的mrna抗原（seq id no.1至4）。作为潜在表位的24个短肽片段被选为靶标（seq id no. 14至31）。所选择的短肽小于20个氨基酸，有利地小于15个氨基酸。使用本领域众所周知的方法设计编码短肽序列的mrna序列（seq id no.32至49）。
[0036]
此外，与其他冠状病毒相比，2019-ncov在刺突蛋白中有一些独特的插入点。2019-ncov的s蛋白的那些插入位点的氨基酸残基与人类免疫缺陷病毒1型（hiv-1）的复制蛋白gp120或gag中的氨基酸残基相同或相似。在另一个实施方案中，设计了一系列编码2019-ncov和hiv-1之间相同的氨基酸残基的mrna序列（seq id no.50至66），这些氨基酸残基能够被人类免疫系统识别。
[0037]
在另一个实施方案中，mrna编码刺突蛋白的orf的d614g变体。由sars-cov-2引起的2019年冠状病毒病（covid-19）爆发已迅速扩大为全球大流行。随着时间的推移，在病毒刺突（s）蛋白中编码 d614g 突变的 sars-cov-2 分离株在发现它的地方逐渐占主导地位，这意味着这种变化会增强病毒的传播。在614残基上带有天冬氨酸（d614）和甘氨酸（g614）的s蛋白具有不同的功能特性。具体来说，发现了相比于野生型（d614）的逆转录病毒，以g614为假型的逆转录病毒感染ace2表达细胞的效率高得多。这种更大的感染性与更少的s1脱落和更多的s蛋白融入假病毒相关。用sars-cov-2的m、n、e和s蛋白产生的病毒样颗粒也得到了类似的结果。在相关分析中，带有d614g突变的刺突蛋白与死亡率呈明显的正相关（r = 0.43，p = 0.022）。这些结果表明，带有d614g突变的刺突蛋白比野生型更稳定，这与流行病学数据一致，表明带有刺突蛋白d614g突变的病毒传播效率更高（seq id no.10）。生产了带有包含d614g突变的orf的疫苗，因为它能更有效地防止sars-cov-2的优势菌株。
[0038]
在另一个实施方案中，mrna编码具有seq id no:89的orf，其编码d614g刺突蛋白前体s2p。
[0039]
在另一个实施方案中，mrna编码具有seq id no.67的orf，其结合了已经确定的刺突蛋白的其他突变。这些包括hv 69-70缺失的刺突蛋白、y144缺失的刺突蛋白、n501y突变的刺突蛋白、a570d突变的刺突蛋白、p681h突变的刺突蛋白、t716i突变的刺突蛋白、f817p修饰的刺突蛋白、a892p修饰的刺突蛋白、a899p修饰的刺突蛋白、a942p修饰的刺突蛋白、s982a突变的刺突蛋白，以及d1118h突变的刺突蛋白。可以用本文所述方法制备含有编码这
et al, mol. ther. 2019, 27, 824
–
836.）。这些顺式结构元件被进一步优化，以实现更好的mrna特征，包括半衰期和表达水平。在本文中提供的5'-utr包括起始的，但不编码多肽（即它是非编码的）。在一些实施方案中，本公开的5'-utr包含具有7-甲基鸟苷（7mg）序列的帽结构。3'-utr位于终止密码子（代表终止信号的mrna转录物的密码子）的直接下游（3'），且不编码多肽（是非编码的）。多a尾是mrna的特殊区域，位于3'-utr的下游并且含有多个连续的单磷酸腺苷；它是高效生产mrna所需要的。mrna体外转录模板不仅用于mrna生产的效率，而且还用于随后的蛋白质或肽生产。
[0045]
在一些实施方案中，通过使用rna聚合酶（t7、t3或sp6）和不同核苷的混合物，从含有噬菌体启动子、优化的utr和密码子优化序列的线性dna模板体外转录（ivt）产生mrna。在其他实施方案中，线性dna模板可以被克隆到质粒dna（pdna）中作为递送载体。质粒载体可以适用于mrna疫苗的生产。常用的质粒包括psfv1、pcdna3和ptk126，它们都是市售的。一个独特的mrna表达系统是pevl（参见grier et al. mol ther nucleic acids. 19;5:e306 (2016)。
[0046]
在一些实施方案中，该mrna是经修饰的mrna，其中所有的尿苷残基都在体外转录过程中被假尿苷取代。这种修饰使mrna稳定，防止细胞内的酶降解，从而提高mrna的翻译效率。所用的假尿苷可以是n1-甲基假尿苷或本领域内众所周知的其他修饰，例如n6-甲基腺苷（m6a）、肌苷、假尿苷、5-甲基胞苷（m5c）、5-羟甲基胞苷（hm5c）和n1-甲基腺苷（m1a）。该修饰任选地在整个mrna中进行，包括orf、5'utr和3'utr。本领域技术人员将认识到，其他修饰的rna残基可被用于稳定蛋白质的三维结构和增加蛋白质的翻译。
[0047]
为了测试效率水平，进行了实施例3、4和5中描述的实验。
[0048]
组氨酸-赖氨酸（hk）多肽作为mrna疫苗递送系统无论是在基础研究环境还是在临床应用中，将核酸转移到目标细胞中的有效手段都是重要的工具。目前需要多样化的核酸载体，因为特定载体的有效性取决于被转染的核酸的特性[blakney et al. biomacromolecules 2018, 19: 2870-2879. goncalves et al. mol pharm 2016; 13: 3153-3163. kauffman et al. biomacromolecules 2018; 19: 3861-3873. peng et al. biomacromolecules 2019; 20: 3613-3626. scholz et al. j control release 2012; 161: 554-565.]。在各种载体中，非病毒传递系统已经被开发出来，并被报道出在许多方面比病毒递送系统更有优势[brito et al. adv genet. 2015; 89: 179-233]。例如，大分子量的支链聚乙二醇（pei，25 kda）是质粒dna的优秀载体，但对mrna来说不是。然而，通过降低pei的分子量至2 kda，它成为mrna的更有效的载体[bettinger et al. nucleic acids res 2001; 29: 3882-3891.]。
[0049]
四支链组氨酸-赖氨酸（hk）肽聚合物h2k4b已被证明是大分子量dna质粒的良好载体[leng et al. nucleic acids res 2005; 33: e40.]，但是是相对低分子量sirna的较差载体 [leng et al. j gene med 2005; 7: 977-986.]。h2k4b的两种富含组氨酸的肽类似物，即h3k4b和h3k(+h)4b，被证明是sirna的有效载体[leng et al. j gene med 2005; 7: 977-986.chou et al. biomaterials 2014; 35: 846-855.]，尽管h3k(+h)4b似乎略微地更有效[leng et al. mol ther 2012; 20: 2282-2290.]。此外，sirna的h3k4b载体在体外和体内诱导细胞因子的程度明显高于h3k(+h)4b sirna多聚物[leng et al. mol ther 2012; 20: 2282-2290. ]。wo/2001/047496、wo/2003/090719和 wo/2006/060182中描述了
合适的hk多肽，其各自的内容整体并入本文。这些多肽具有赖氨酸骨架（三个赖氨酸残基），其中赖氨酸侧链的ε-氨基和n端与各种hk序列相连接。hk多肽载体可以通过本领域内众所周知的方法合成，包括例如固相合成。
[0050]
发现这种组氨酸-赖氨酸肽聚合物（“hk聚合物”）作为mrna载体令人惊讶地有效，并且它们可以单独使用或与脂质体结合使用以提供mrna进入靶细胞的有效递送。与pei和其他载体类似，初步结果表明hk聚合物在携带和释放核酸的能力上有所不同。然而，由于hk聚合物可以在肽合成器上被重复地制造，其氨基酸序列可以很容易地被改变，从而可以精细控制mrna的结合和释放以及含有hk聚合物和mrna的多聚物的稳定性[chou et al. biomaterials 2014; 35: 846-855. midoux et al. bioconjug chem 1999; 10: 406-411. henig et al. journal of american chemical society 1999; 121: 5123-5126.]。当mrna分子与一个或多个hkp载体混合时，这些成分会自组装成纳米颗粒。
[0051]
如本文所述，有利的是，hk聚合物包含与三赖氨酸氨基酸核心相连的四个短肽分支。肽分支由组氨酸和赖氨酸氨基酸以不同的配置组成。这些组氨酸-赖氨酸肽聚合物（hk聚合物）的一般结构如式i所示，其中r代表肽分支，k是氨基酸l-赖氨酸。
[0052]
在式i中，其中k是l-赖氨酸且r1、r2、r3和r4中的每一个独立地是组氨酸-赖氨酸肽。在本发明的hk聚合物中，r
1-4
分支可以相同或不同。当r分支是
ꢀ“
不同的”时，该分支的氨基酸序列与聚合物中的其他每个r分支不同。在式i所示的本发明的hk聚合物中使用的合适的r分支包括但不限于以下r分支r
a-r-j
：r
a = khkhhkhhkhhkhhkhhkhk
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b = khhhkhhhkhhhkhhhk
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(seq id no:80)r
c = khhhkhhhkhhhhkhhhk
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(seq id no:81)r
d = khhhkhhhkhhhhkhhhk
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(seq id no:82)r
e = hkhhhkhhhkhhhhkhhhk
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(seq id no:83)r
f = hhkhhhkhhhkhhhhkhhhk
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(seq id no:84)r
g = khhhhkhhhhkhhhhkhhhhk
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(seq id no:85)r
h = khhhkhhhkhhhkhhhhk
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(seq id no:86)r
i = khhhkhhhhkhhhkhhhk
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(seq id no:87)r
j = khhhkhhhhkhhhkhhhhk
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(seq id no:88)可用于mrna组合物的特定的hk聚合物包括但不限于这样的hk聚合物，其中r1、r2、r3和r4中的每一个是相同的并选自raꢀ‑ꢀrj
（表1）。这些hk聚合物分别称为h2k4b、h3k4b、h3k(+h)4b、h3k(+h)4b、h-h3k(+h)4b、hh-h3k(+h)4b、h4k4b、h3k(1+h)4b、h3k(3+h)4b和h3k(1,3+h)4b。在这10个例子的每一个中，大写“k”代表l-赖氨酸，小写“k”代表d-赖氨酸。与h3k4b相比，额外的组氨酸残基在分支序列内用下划线表示。hk聚合物的命名方法如下：
1）对于h3k4b，分支中的主要重复序列是-hhhk-，因此“h3k”是名称的一部分；“4b”是指分支的数量；2）h3k4b和类似物的每个分支中都有四个-hhhk-基序；第一个-hhhk-基序（“1”）最接近赖氨酸核心；3）h3k(+h)4b是h3k4b的类似物，其中一个额外的组氨酸被插入h3k4b的第二个-hhhk-基序（基序2）；4）对于h3k(1+h)4b和h3k(3+h)4b肽，在第一（基序1）和第三（基序3）基序中分别有额外的组氨酸；5）对于h3k(1,3+h)4b，在分支的第一和第三基序中都有两个额外的组氨酸。
[0053]
表1本领域众所周知的方法，包括凝胶迟滞试验、肝素置换试验和流式细胞术，可以被用来评估含有hk聚合物加脂质体的不同配置在成功递送mrna方面的性能。合适的方法描述于，例如gujrati et al, | mol.pharmaceutics 11:2734-2744 (2014), p
ä
rnaste et al., mol ther nucleic acids.7: 1-10 (2017)。
[0054]
使用smartflare
®
技术（millipore sigma）也可以实现对细胞内mrna吸收的检测。这些智能信号弹是附有序列的珠子，当识别到细胞中的rna序列时，产生增加的荧光，所述荧光可以用荧光显微镜进行分析。
[0055]
其他方法包括测量来自mrna的蛋白质表达——例如，可以使用本领域众所周知的方法，用编码荧光素酶的mrna来测量转染的效率。参见，例如，这些是在最新的出版物中用荧光素酶mrna完成的（he et al, j gene med. 2021 feb;23(2):e3295），以证明使用hkp和脂质体制剂递送mrna的功效。
[0056]
dotap和hk载体在mrna递送中的协同活性h3k(+h)4b和dotap（阳离子脂质）的组合在携带mrna进入mda-mb-231细胞的能力上出人意料地有协同作用（h3k(+h)4b/脂质体vs脂质体，p《0.0001）。该组合作为mrna的载体比单独的聚合物和阳离子脂质载体分别更有效约3倍和8倍。并非所有的hk肽都表现出与dotap脂质的协同活性。例如，h3k4b和dotap的组合作为荧光素酶mrna的载体的效果就不如dotap脂质体。除了dotap，其他可与hk肽一起使用的阳离子脂质包括lipofectin（thermofisher）、lipofectamine（thermofisher）和dosper（图22）。
[0057]
h3k(+h)4b的d-异构体，其中分支中的l-赖氨酸被d-赖氨酸取代，是最有效的聚合物载体（h3k(+h)4b vs. h3k(+h)4b，p《0.05）。与单独的h3k(+h)4b和脂质体载体相比，mrna
的d-异构体/脂质体载体分别更有效近4倍和10倍。尽管d-h3k(+h)4b/脂质体组合比l-h3k(+h)4b/脂质组合略微更有效，但这种比较没有统计学差异（图23）。
[0058]
h3k(+h)4b作为hk聚合物中用于mrna的载体h3k4b和h3k(+h)4b都可以作为体外核酸的载体[len et al. j gene med 2005; 7: 977-986. chou et al., cancer gene ther 2011; 18: 707-716.]。尽管之前有这些发现，但与其他类似的类似物相比，h3k(+h)4b作为mrna的载体明显更好（表2）。
[0059]
表2
特别地，在各种重量：重量（hk:mrna）的比率下，它具有比h3k4b更高的mrna转染效率。在4:1的比率下，在mda-mb-231细胞中的h3k(+h)4b的荧光素酶表达量比h3k4b高10倍，而没有明显的细胞毒性。此外，缓冲能力似乎不是它们转染差异的必需因素，因为h3k4b和h3k(+h)4b中组氨酸的百分比（按重量计）分别为68.9%和70.6%。
[0060]
凝胶延迟试验展示了hk聚合物延迟了mrna的电泳迁移率。滞后效应随着肽与mrna重量比的增加而增加。然而，在h3k(+h)4b的2:1比率下，mrna被完全延迟，而h3k4b则不完全延迟。这表明h3k(+h)4b可以形成更稳定的多聚物，这对其成为mrna递送的合适载体的能力是有利的。
[0061]
使用肝素置换试验进一步证实了h3k(+h)4b肽与mrna结合得更紧密。将不同浓度
的肝素加入到mrna和hk形成的多聚物中，观察到特别是在低浓度的肝素下，比起h3k(+h)4b聚合物，mrna更容易被h3k4b聚合物释放。这些数据表明h3k(+h)4b可以与mrna结合并形成比h3k4b更稳定的多聚物。
[0062]
使用花青素-5标记mrna，使用流式细胞术比较h3k4b和h3k(+h)4b多聚物进入mda-mb-231细胞的摄取情况。在不同的时间点（1、2和4h），h3k(+h)4b多聚物比h3k4b多聚物更有效地导入细胞（数据未显示）。与这些结果类似的，荧光显微镜显示了h3k(+h)4b多聚物在酸性内体小泡（endosomal vesicles）内的定位明显高于h3k4b多聚体（h3k4b vs. h3k(+h)4b，p《0.001）。有趣的是，没有与细胞内小泡（endocytic vesicle）重叠的形状不规则的h3k4b多聚体可能是细胞外的，且没有观察到h3k(+h)4b多聚体。
[0063]
众所周知，hk聚合物和阳离子脂质（即dotap）明显地、独立地增加质粒的转染 [chen et al. gene ther 2000; 7: 1698-1705. ]。因此，研究了这些脂质与hk聚合物一起是否能增强mrna的转染。值得注意的是，比起dotap脂质体，h3k(+h)4b和h3k(+h)4b载体明显是更好的mrna的载体。h3k(+h)4b和dotap脂质的组合在携带mrna进入mda-mb-231细胞的能力上有协同作用。该组合作为mrna的载体分别比单独的聚合物和脂质体载体更有效约3倍和8倍（h3k(+h)4b/脂质 vs. 脂质体或h3k(+h)4b）。值得注意的是，并不是所有的hk肽都表现出对dotap脂质的改善活性。h3k4b和dotap载体的组合作为荧光素酶mrna的载体不如dotap脂质有效。发现dotap和h3k(+h)4b载体的组合在携带mrna进入细胞的能力上有协同作用[he et al. j gene med. 2020 nov 10:e3295]。
[0064]
mrna疫苗的给药本文所述的疫苗制剂可通过任何常规用于施用疫苗的施用方式施用至对象，包括人类对象。因此，这些组合物可以是气溶胶、分散体、溶液或悬浮液的形式并且被配制用于吸入、肌肉内、口服、舌下、颊、肠外、鼻腔、皮下、皮内或局部施用。本文所用的术语肠外包括经皮、皮下、血管内（例如静脉内）、肌肉内或鞘内注射或输液技术等。
[0065]
如本文所用，疫苗的有效剂量是指在施用疫苗的对象中产生保护性免疫反应所需的剂量。在本文中，保护性免疫反应是指在受到2019-ncov挑战的对象中预防或改善疾病的免疫反应。在多个对象中进行临床试验以确定疫苗是否产生保护性免疫反应的方法在本领域是众所周知的。
[0066]
该疫苗可被施用一次或多次。对疫苗免疫反应的初步测量可以通过测量接受疫苗的对象中抗体的产生来进行。以这种方式测量抗体产生的方法在本领域也是众所周知的。是指预防、抑制疾病的发生或治疗（在一定程度上缓解症状，优选所有的症状）疾病状态所需的剂量。药学上的有效剂量取决于疾病的类型、使用的组合物、给药途径、被治疗的哺乳动物的类型、所考虑的特定哺乳动物的物理特性、同时进行的药物治疗以及那些医疗领域的技术人员将认识到的其他因素。一般来说，根据配制的组合物的效力，施用0.1 mg/kg至100 mg/kg体重/天的量的活性成分。
[0067]
然而，直到最近，它们的应用还受到mrna的体内递送的不稳定性和低效的限制。本文所述的方法提供了制备和使用带有多肽递送系统和多肽纳米颗粒递送系统的mrna疫苗的方法。
[0068]
本文所述的方法可用于mrna的临床应用，包括针对各种疾病（特别是传染病）的预防性和治疗性的疫苗。
[0069]
实施例1：mrna的合成：合成了表达cleancap sars-cov 2刺突蛋白（s1p和s2p）和cleancap增强型绿色荧光蛋白（egfp）的mrna，并且通过trilink biotechnologies, inc, (san diego, ca)制备了cleancap sars-cov 2刺突蛋白（s6p），并通过在含乙醇的缓冲液a色谱缓冲液中的dsrna与纤维素的选择性结合来进行纯化，所述缓冲液含有10mm hepes（ph 7.2）、0.1mm edta、125mm nacl、16%的乙醇，并将纤维素纤维与mrna产品一起加入微离心机旋转柱中并离心。在这个过程之后，几乎90%的dsrna可以被去除（baiersdorfer et.al, 2019）。污染物也可以用fplc和hplc来消除（kariko et.al, 2011）。
[0070]
实施例2：肽（hk聚合物）的制备通过马里兰大学（university of maryland）的生物聚合物核心设施在rainin voyager合成器（tucson, az）上合成了hk肽聚合物。
[0071]
实施例3：mrna的体外转染为了验证mrna（egfp mrna和sars-cov 2 sp）的合适的蛋白质表达，将mrna瞬时转染到人类胚胎肾脏293t细胞（293t细胞）中。简而言之，将4.8 x 105个细胞接种到含有2毫升dmem（10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（thermofisher scientific））的6孔板中。24小时后，当细胞70-90%汇合时，根据提供的实验方案使用lipofectamine messengermax转染试剂（thermofisher scientific）将mrna转染到293t细胞中。293t细胞培养两天，进行体外蛋白表达测量。
[0072]
检查与阳离子脂质体dotap（1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷，roche）、mc3（dlin-mc3-dma，chemscene）和pla（聚乳酸）结合的两种基于hk的聚合物的携带egfp mrna和sars-cov 2 sp mrna进入人类胚胎肾293细胞（hek 293细胞）的能力。简而言之，将4.8 x 105个细胞接种至含有2毫升dmem（10%胎牛血清和青霉素-链霉素（thermofisher scientific））的6孔板。24小时后，当细胞达到70-90%汇合时，在每个孔中加入两种含有egfp和sp mrna的基于hk的聚合物制剂。293t细胞培养两天，进行体外蛋白表达测量。
[0073]
实施例4：体外蛋白表达测量免疫荧光分析：转染两天后，使用cytation 5 cell imaging multi-mode reader（biotek，winooski，vt）通过免疫荧光成像测量蛋白质表达。
[0074]
细胞裂解液的制备：转染两天后，吸出培养基，在冰上用冰冷的pbs清洗细胞。加入含有蛋白酶抑制剂（thermofisher scientific）的冰冷的裂解缓冲液（ripa，thermofisher scientific），在4
˚
c下孵育细胞30分钟。用细胞刮刀收割细胞，并通过超声处理裂解。在4℃下以10,000g离心20分钟以沉淀细胞碎片，并将上清液转移到新的微离心管中。裂解液的蛋白浓度通过bradford或bca蛋白检测来确定以用于蛋白质印迹。
[0075]
蛋白质印迹：简单地说，在凝胶的每个孔中，20-50ug的蛋白质与4x sds样品缓冲液（thermofisher scientific）、10x还原缓冲液（thermofisher scientific）和额外的ddh2o（thermofisher scientific）一起，总装载量为25
µ
l/孔。混合物在95℃下加热5分钟变性，冷却到室温后离心，然后装入nupage
™ꢀ
4-12%的bis-tris凝胶（thermofisher scientific）。电泳分离后，将凝胶从盒中取出，用iblot
™ꢀ
2干式印迹系统（thermofisher scientific）转移。转移膜在rt下用tbst中的5%的无脂奶粉阻断1小时，在4℃下用一抗孵育过夜，用tbst（在tbs 中的0.05% tween20）缓冲液洗三次，然后在rt下用二抗孵育1小时，二
抗是hrp连接的小鼠igg（h+l）二抗（thermofisher scientific, a24512）。转移膜由pierce ecl western blotting substrate（thermofisher scientific）显影，并使用化学发光成像系统进行成像。
[0076]
实施例5：体内制剂制备1. pni-genvoy lnp制剂：使用带有pni nanoassemblr（precision nanosystems, vancouver, british columbia, canada）的genvoy平台配制脂质纳米颗粒，作为体外和体内试验的阳性对照。
[0077]
2.hkp(+h)制剂：在无核酸酶的水中制备hkp(+h)储备溶液（10 mg/ml）。将浓缩的储备溶液在水中稀释至 4 mg/ml。在1 mm柠檬酸盐缓冲液（ph 6.0）中制备mrna工作溶液（1 mg/ml）。通过将等体积的4 mg/ml hkp(+h)和1 mg/ml mrna混合来形成mrna/hkp(+h)多聚物。hkp(+h)与mrna的质量比为4：1。使用前将mrna/hkp(+h)多聚物在室温下孵育30分钟。在转染或注射前，用zetasizer（malvern panalytical）测定每个肽基多聚物的大小。
[0078]
3.hkp(+h)/dotap制剂（后混合dotap）：在无核酸酶的水中制备hkp(+h)储备溶液（10 mg/ml）。将浓缩的储备溶液在水中稀释至4 mg/ml。dotap（sigma-aldrich）在水基缓冲溶液中为1 mg/ml。在1 mm柠檬酸盐缓冲液（ph 6.0）中制备mrna工作溶液（1 mg/ml）。首先通过将等体积的4 mg/ml hkp(+h)和1 mg/ml mrna混合来形成mrna/hkp(+h)多聚物。将mrna/hkp(+h)多聚物在室温下孵育30分钟。接下来，将相同体积的dotap与hkp(+h)溶液加入到mrna/hkp(+h)多聚物中。hkp(+h)/dotap与mrna的质量比为4：1：1。使用前将mrna/hkp(+h)/dotap纳米颗粒在室温下孵育30分钟。
[0079]
4. hkp(+h)/mc3或hkp(+h)/dotap制剂（预混合mc3或dotap）：在无核酸酶的水中制备 hkp(+h)储备溶液（10 mg/ml）。将浓缩的储备溶液在水中稀释至4 mg/ml。dotap或mc3在缓冲水溶液中为1 mg/ml。在1 mm柠檬酸盐缓冲液（ph 6.0）中制备mrna工作溶液（1 mg/ml）。将等体积的hkp(+h)和mc3以4:1的质量比预混合，并将相同体积的mrna与hkp(+h)溶液加入至预混合的hkp(+h)/mc3。将预混合的4 mg/ml hkp(+h)/1mg/ml mc3和1 mg/ml mrna混合形成mrna/hkp(+h)/mc3纳米颗粒。hkp(+h)/mc3与mrna的质量比为4:1:1。使用前将mrna/hkp(+h)/mc3纳米颗粒在室温下孵育30分钟。
[0080]
5.hkp(+h)/pla np制剂：在无核酸酶的水中制备hkp(+h)储备溶液（10 mg/ml）。将浓缩的储备溶液在水中稀释至4 mg/ml。在水中制备聚左旋乳酸（pla）纳米颗粒（5mg/ml）。在1 mm柠檬酸缓冲液（ph 6.0）中制备mrna工作溶液（1 mg/ml）。将等体积的hkp(+h)和mrna以4：1的质量比混合。将mrna/hkp(+h)多聚物在室温下孵育30分钟，然后将相同体积的pla纳米颗粒与hkp(+h)溶液加入到mrna/hkp(+h)纳米颗粒中，使mrna/hkp(+h)多聚物被吸附在pla纳米颗粒的表面。hkp(+h)/pla与mrna的质量比为4：5：1。使用前将mrna/hkp(+h)/pla纳米颗粒在室温下孵育30分钟。
[0081]
实施例6：体内动物模型和注射在antibody and immunoassay consultants (aic) inc（gaithersburg, md）进行了体内研究。简而言之，8只6-8周大的雌性balb/c被随机分进各组，每组4只小鼠并将30
µ
g不同制剂的egfp肌肉内注射进右腹。用上述相同的制剂，制备cleancap sars-cov 2刺突蛋白（s6p）多聚物以用于体内分析和抗体滴度测量及结合。
[0082]
在第28天进行第二次注射以增强免疫力，并在第35天收集血清并用免疫测定法
（elisa）进行分析以测量抗体滴度。
[0083]
结果免疫荧光分析制作完成一周后，将制剂递送到hek 293t细胞（图2）。所有hkp(h)组都证明了在体外携带mrna进入细胞的可能性。在hkp(h)组中，单独hkp(h)的组比其他组和pni genvoy（阳性对照）显示出更高的egfp表达。
[0084]
蛋白质印迹分析接下来进行蛋白质印迹检测，结果（图3）显示，s1p d614g mrna递送组在细胞表面上表达的刺突蛋白在定位到细胞膜后发生了脱落。只有刺突蛋白的s2结构域保留在细胞表面。蛋白质印迹的条带大小（70-80 kda）支撑了这一假设。然而，s2p d614g的刺突蛋白示出了刺突蛋白的完整的大小（180 kda）。