用于治疗甲状旁腺功能减退症的PTH类似物

用于治疗甲状旁腺功能减退症的pth类似物
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求以下优先权：于2020年5月26日提交的美国临时专利申请号63/030,004和于2020年6月2日提交的美国临时专利申请号63/033,586，其公开内容明确并入本文。
3.通过援引以电子方式提交的材料并入
4.通过援引以其全部内容并入的是与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，其标识如下：80千字节acii(文本)文件，命名为“338101final_st25.txt”，创建于2021年5月24日。


背景技术：

5.通过分泌甲状旁腺激素(pth)，甲状旁腺将血液中的钙控制在非常严格的范围内(成人中8-10mg/dl)。储存在骨中的钙响应于pth释放，支持中枢神经系统功能、血管和肌肉收缩、酶和激素分泌以及血液凝固。在机制上，pth通过刺激肾脏内具有生物活性形式的维生素d的产生来增加钙的浓度，同时调动钙和磷酸盐从骨释放，信号传导至肾脏以消除过量磷酸盐，并使肾脏内肾小管对钙的重吸收最大化。
6.甲状旁腺功能减退症(hypo pt)是罕见疾病，其中pth的产生不足。患有hypo pt的患者在他们的尿液中钙排泄过多，在他们的血液中磷酸盐过多，并且具有的骨转换异常低。在2015年1月美国食品药品监督管理局(food and drug administration,fda)批准nps/shire’s(rhpth)之前，甲状旁腺功能减退症是不用激素替代治疗的极少数经典内分泌疾病之一。与由高剂量钙和维生素d补充剂组成的护理标准相比，仅提供适度功效。即便如此，该药物自2015年商业推出以来仍广受好评，这表明治疗hypo pt存在显著未满足的需求。
7.由于hypo pt是罕见疾病，针对hypo pt开发的药物受益于fda和欧洲药品管理局(european medicines agency，ema)的孤儿药资格认定(orphan drug designation)。每个新出现的竞争品均以比更具生理性的方式恢复pth，以主要使血清钙正常化并减少疾病管理不足的长期后果。竞争品在使pth正常化的方法上有所不同，在产品特征方面存在很大差异，包括施用途径、效力、给药频率和治疗指数。本文公开的组合物为患有hypo pt的患者每周提供治疗，将在一周内安全地恢复并维持pth的生理水平，为患者提供独特药理获益和显著便利。
8.hypo pt可以分为原发性和继发性疾病。当因遗传原因甲状旁腺内存在缺陷时，发生原发性疾病。遗传原因引起的hypo pt尤其罕见，被认为引起少于总病例的10％。当先前功能正常的甲状旁腺功能受损、破坏或消融时，发生继发性或获得性疾病。继发性疾病是迄今为止最常见的疾病，引起总病例的大约90％。
9.至少75％的获得性hypo pt病例是由前颈部手术(即甲状腺全切除术或头颈部恶性肿瘤的根治性颈部清扫术)引起的，原因是无意或不可避免地切除或损害甲状旁腺和/或其血液供应。甲状腺手术后的暂时性hypo pt相对常见，估计7-46％的甲状腺手术中发生。
暂时性hypo pt在手术后数周或数月内消退。慢性hypo pt极少见，在有经验丰富的内分泌外科医生和大量病例的外科中心发生率为0.9-1.6％。然而，已报告甲状腺手术后的发生率高达6.6％，这强调了专业知识和经验在避免导致hypo pt的永久性损伤方面的重要性。
10.在前颈手术后，成人中hypo pt的下一个最常见的获得性原因被认为是自身免疫性疾病。它可以影响单独的甲状旁腺或多个内分泌腺。据估计，自身免疫介导的疾病引起获得性hypo pt小于10％。其他继发性原因包括由于转移性疾病或铁/铜超载、电离辐射暴露或来源不明(特发性)引起的罕见浸润性疾患。
11.美国中hypo pt患病率的估计范围为60,000至115,000名患者。专家建议，基于大型健康计划索赔数据库的最佳估计是77,000名患者，其中58,793名投保。其他地区的数据极为有限，并且有记录的估计范围为欧洲70,000至267,000名，日本20,000名和世界其他地区30,000名。
12.慢性hypo pt是日益严重的疾病，由甲状腺疾病(包括癌症)及其治疗(最明显的是手术)的发病率驱动。例如，从1996年到2006年之间，美国进行的甲状腺切除术总数增加了39％，从66,864例增加至92,931例。据估计，美国每年进行的甲状腺切除术数量现已达到150,000例。可能受hypo pt影响的人数正在增加。由于甲状腺疾病对女性的影响大于男性，因此超过70％的hypo pt患者是女性。
13.钙水平超出正常生理范围的大多数人均感到不适。由于钙在神经和肌肉功能中的关键作用，低钙血症患者可能经历四肢的刺痛或灼痛(感觉异常)、肌肉抽搐、肌肉疼痛、不自主肌肉收缩(手足搐搦)、皮肤干燥/粗糙、无法集中或专注、焦虑和/或抑郁。严重低水平的血钙可以引起危及生命的喉痉挛、惊厥或心律失常，需要iv钙进行急症治疗。hypo pt的严重长期后果可以包括肾钙沉着症、肾功能受损/慢性肾病、软组织中的钙沉积和骨过度矿化。
14.hypo pt通常通过临床病史和实验室测试进行诊断。诊断的典型特征在于低/未检出水平的血清pth和低钙血症(定义为总血清钙低于正常下限)和高磷血症。激活的维生素d和骨转换标志物的水平通常也在正常范围的较低部分到明显较低的范围内，并且钙的排泄增加。在最近的颈部手术的背景下，此类实验室结果可以直接诊断为hypo pt。然而，hypo pt病例可能很难诊断，尤其是在甲状旁腺没有已知损伤的情况下。
15.关于hypo pt治疗没有明确指南，因此治疗基于经验和临床判断。慢性治疗的普遍接受的主要目标是将血清总钙(低至低正常范围)、血清磷(高正常范围)、24小时尿钙排泄(《7.5mmol/d)和磷酸钙产物(低于4.4mmol2/l2)维持在可接受的范围内。
16.标准治疗包括钙、维生素d代谢物，并且有时还包括噻嗪类利尿剂。建议的钙补充剂是碳酸钙和柠檬酸钙，并且所需的量因患者差异很大(9倍)。1,25(oh)2d3(骨化三醇)是维生素d的活性代谢物，并且通过提高肠道钙吸收的效率而有助于维持血清钙。骨化三醇还以广泛(8倍)的剂量范围施用。通过增强远端肾小管钙重吸收，噻嗪类利尿剂(苯并噻二嗪类药物)也可用于治疗hypo pt。
17.虽然用钙和维生素d补充剂来补充缺乏的钙听起来很简单，但实际情况是很难实现良好控制。大多数患者在剂量水平过高和过低之间交替经历急剧变化。此外，钙和维生素d补充剂对恢复具有治疗后果的潜在pth缺乏无任何作用。
18.患有hypo pt的患者经历沉重的疾病负担，对他们的日常生活质量以及他们的照
顾者、家人和朋友的生活产生重大负面影响。nps pharmaceuticals开展了一项374名患者的流行病学研究paradox，以评估hypo pt的临床、社会和经济影响。通过30分钟基于网络的仪器来收集数据，该仪器是用来自临床专家、甲状旁腺功能减退症协会和患者的输入的信息开发的。该仪器主要经由电子邮件传播给甲状旁腺功能减退症协会成员，包括在美国患有hypo pt六个月或更长时间的成年人。hadker等人在内分泌实践(endocrine practice)上发表了研究结果，关键要点如下：
19.72％每日经历超过10种症状，其中最常报告的是：
20.身体症状：疲劳(82％)、肌肉疼痛/痉挛(78％)、感觉异常(76％)、手足搐搦(70％)、关节或骨疼痛(67％)以及四肢疼痛或无力(53％)
21.情绪症状：焦虑(59％)和抑郁(53％)
22.认知症状：脑雾/精神嗜睡(72％)、无法集中(65％)、记忆力减退(61.5％)和睡眠障碍(57％)
23.79％需要住院或急诊就诊
24.45％报告他们的生活受到严重干扰
25.85％报告无法进行家务活动，以及
26.20％在就业状况方面经历疾病相关的(负面)变化。
27.其他出版物也证实了hypo pt的疾病负担。arlt等人在欧洲内分泌学杂志(european journal of endocrinology)上发表的一项横向研究，该研究使用经验证的问卷调查比较了用钙和维生素d治疗而稳定管理的患有术后hypo pt的25名女性与甲状腺手术后甲状旁腺功能完整的25名女性的健康和情绪。hypo pt患者在geissen疾病(complaint)列表、von zerssen症状列表和症状检验表-90中的总体疾病评分显著更高，焦虑、恐惧性焦虑及其体格等同项的子量表评分增加。重要的是，目前hypo pt治疗的常规疗法标准并没有恢复这些患者的健康。
28.通常期望延长注射药物的释放时间以增加其作用持续时间，或降低其毒性作用。在体内易溶的制剂通常被迅速吸收并提供可用药物的突然爆发，而不是药理学活性产品更期望且逐渐释放。
29.已进行多种尝试来提供受控和延释药物化合物，但先前公开的技术未能成功克服与该技术相关的所有问题，诸如实现最佳延释时间、最大化稳定性和功效、降低毒性、最大化制备的可重复性，并消除由由非期望的基质材料引入的不需要的物理、生化或毒理学作用。因此，需要安全且有效地延长现有药物的半衰期并提高其自剂量与剂量以及患者与患者治疗指数的制剂。这对于具有狭窄治疗指数以将功效剂量与毒性剂量分开的药物来说是最重要的。pth与胰岛素或甲状腺激素非常相似，被认为是其中钙的轻微过度升高超出生理范围产生急性和慢性不良后果的这类药物。
30.提供延长释放和增强治疗指数的机制包括在注射部位处的隔离分子或使用药物的前药衍生物形式，其中前药衍生物被设计成延迟起效并延长药物的半衰期。延迟起效是有利的，因为它使得前药在其活化之前全身分布。因此，前药的施用可以消除施用时活性峰引起的并发症并提高母体药物的治疗指数。
31.此外，肽和蛋白质激动剂的受体识别和后续加工是许多基于肽和蛋白质的药物降解的主要途径。因此，肽药物与其受体的结合将导致生物刺激，但也将通过肽或蛋白质的酶
促降解引发肽/蛋白质诱导的药理学随后的失活。因此，前药的使用还可以延迟施用的药物的作用时间，以在激活之前使药物遍布身体均匀分布。本公开提供了组合物和方法以安全地延长pth的生物学作用，同时在施用后立即使过度作用最小化。


技术实现要素：

32.根据本公开，pth肽可以经修饰以防止它们与其相应的受体相互作用。更具体地，如本文所公开的，pth肽可以通过非酶促自切割二肽与药物的连接而被可逆地修饰，以形成复合物，该复合物作为储库组合物起作用，以将药物定位于注射部位以便以受控方式释放，和/或作为分布遍布身体但不能与其受体相互作用的前药。此外，可以通过脂肪酰基或二酸基团与pth肽的共价连接来进一步修饰此类pth肽的前药衍生物，以增强保留时间并延长前药的保留时间和切割前药部分时基础肽的作用持续时间。
33.有利地，本公开的pth缀合物安全地延长pth的生物学作用，同时在施用后立即使过度作用最小化。因此，本文公开的组合物为患者提供了使血清钙安全正常化的能力，而没有钙过度升高的危险，这可以改变生活后果。该技术增加了药物施用的便利性，这应导致对疗法的依从性增加。如本文所公开的，本公开的pth类似物表现出延长的作用持续时间，实现向患者每周施用一次。然而，向患者每日施用也被设想为实现更精确地控制患者血清钙水平的方法。
34.本公开的组合物可以使用标准途径诸如皮下施用来施用。在一种实施方式中，通过将本公开中的pth缀合物与吸收促进剂共配制来配制组合物用于口服递送，该吸收促进剂可以充分增加pth缀合物的吸收。n-[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠(snac)是递送剂，其已报告可增强多种分子(包括肽诸如胰岛素、glp-1、降钙素和其他大分子诸如例如肝素)的渗透性。根据一种实施方式，提供用于口服递送的药物组合物，其中该组合物包括本公开的pth缀合物和snac，任选地，其中该药物组合物被配制成片剂。
[0035]
根据一种实施方式，提供了甲状旁腺激素的酰化缀合衍生物，其中，该衍生物在向包括例如智人(homo sapiens)的温血哺乳动物施用时具有改善的治疗指数和体内延长的作用时间。在一些实施方式中，本发明提供了酰化的31个氨基酸的pth肽，其通过经由酰胺键的自切割二肽的共价连接而另外修饰。在一些实施方式中，本发明提供了酰化的32个氨基酸的pth肽，其通过经由酰胺键的自切割二肽的共价连接而另外修饰。在一些实施方式中，本发明提供了酰化的33个氨基酸的pth肽，其通过经由酰胺键的自切割二肽的共价连接而另外修饰。在一些实施方式中，本发明提供了酰化的34个氨基酸的pth肽，其通过经由酰胺键的自切割二肽的共价连接而另外修饰。在一些实施方式中，本发明提供了酰化的38个氨基酸的pth肽，其通过经由酰胺键的自切割二肽的共价连接而另外修饰。更具体地，在一种实施方式中，修饰的甲状旁腺激素(pth)分别是seq id no:2、3或30的33、34或35个氨基酸的肽，其中，pth肽通过经由酰胺键的自切割二肽的共价连接而另外修饰，任选地在pth肽的n-末端α胺处。
[0036]
在一种实施方式中，pth肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0037]
svseiqlmhx
10
lgx
13
hlx
16
sx
18
ervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z，(seq id no:133)；
[0038]
svseiqlmhx
10
lx
12
khlx
16
x
17
x
18
ervewlrkklqdvh-z；(seq id no:134)；
[0039]
svseiqlmhx
10
lgkhlx
16
sx
18
ervewlrkklqdvh-z(seq id no:135)和
[0040]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0041]
其中，z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
；
[0042]
x
10
和x
16
独立地是asp、gln或asn；
[0043]
x
12
是gly或aib；
[0044]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0045]
x
18
是met、met(o)、leu或nleu；
[0046]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0047]
x
31
是gly或val；
[0048]
x
33
和x
35
各自包括酰化氨基酸，所述酰化氨基酸包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，任选地经由间隔基，任选地，其中，所述酰化氨基酸选自由lys、dlys、鸟氨酸、cys和高半胱氨酸组成的组；
[0049]
x
53
是gln或asn，任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中不超过一个是aib，并且任选地，其中，c-末端氨基酸经修饰以用酰胺替换羧基末端。在一些实施方式中，pth肽进一步包括经由酰胺键与所述pth肽共价结合的自切割二肽，任选地，其中，所述自切割二肽与所述pth肽的n-末端α胺共价连接。在一种实施方式中，自切割二肽包括结构a-b，其中
[0050]
a是氨基酸，任选地，酰化氨基酸包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，任选地经由间隔基；以及
[0051]
b是n-烷基化氨基酸。在某些实施方式中，pth肽包括ε-酰化-lys、ε-酰化-dlys、鸟氨酸、ε-酰化鸟氨酸、半胱氨酸、s-酰化半胱氨酸、高半胱氨酸或s-酰化高半胱氨酸，任选地，其中，酰化氨基酸是pth肽的c-末端氨基酸。
[0052]
在一些实施方式中，pth肽进一步包括非天然氨基酸。在一些实施方式中，pth肽包括1、2或3个氨基酸置换。在一些实施方式中，氨基酸置换是保守置换。在一些实施方式中，用非保守氨基酸进行置换。在一些实施方式中，本发明的pth肽包括一种或多种非天然氨基酸。用于本发明的pth肽的非天然氨基酸的非限制性实例包括包含二苯甲酮、酮、碘化物或叠氮化物取代基的苯丙氨酸衍生物；o-炔丙基酪氨酸；α-氨基辛酸、o-甲基酪氨酸、o-硝基苄基半胱氨酸；3-(萘-2-基氨基)-2-氨基丙酸；对位取代的苯丙氨酸衍生物，诸如对氨基苯丙氨酸和对甲氧基苯丙氨酸；间位取代的酪氨酸衍生物，诸如3-氨基酪氨酸、3-硝基酪氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸和3-碘化酪氨酸；苯基硒代半胱氨酸；对硼苯丙氨酸；邻硝基苄基酪氨酸；酰胺和氨基甲酸酯取代的赖氨酸，诸如2-氨基-6-((r)-四氢呋喃-2-甲酰胺基)己酸、n-ε-d-脯氨酰基-l-赖氨酸和n-ε-环戊氧基羰基-l-赖氨酸；n-ε-丙烯酰-l-赖氨酸；n-ε-[(1-(6-硝基苯并[d][1,3]二氧杂环戊烯-5-基)乙氧基)羰基]-l-赖氨酸(n-ε-[(1-(6-nitrobenzo[d][1,3]dioxol-5-yl)ethoxy)carbonyl]-l-lysine)；叠氮基丙氨酸；2-(4'-戊烯基)丙氨酸；丙氨酸；以及n-ε-(1-甲基环丙-2-烯甲酰胺)赖氨酸。
[0053]
在一种实施方式中，提供了pth缀合物，包括本文公开的任何pth肽和自切割二肽，该自切割二肽经由酰胺键与所述pth肽共价结合，任选地与所述pth肽的n-末端α胺共价结合。在一种实施方式中，所述缀合物包括具有选自由以下组成的组的氨基酸序列的pth肽：
[0054]
svseiqlmhnlx
12
x
13
hlx
16
x
17
mervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:4)，
[0055]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:5)，
[0056]
svseiqlmhnlx
12
khlx
56
x
17
mervewlrkklqdvh-z(seq id no:6)；
[0057]
svseiqlmhx
10
lgkhlx
16
sx
18
ervewlrkklqdvh-z(seq id no:135)；
[0058]
和
[0059]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)
[0060]
其中
[0061]
z是x
33
f、x
53
fx
35
、x
33
fx
35
或x
33
，任选地z是x
53
fx
35
或x
33
；
[0062]
x
10
和x
16
独立地是asp、gln或asn；
[0063]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0064]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0065]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0066]
x
18
是met、met(o)或nleu；
[0067]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；任选地，其中，x
13
、x
26
和x
27
独立地选自glu和lys；
[0068]
x
31
是gly或val；
[0069]
x
33
和x
35
各自包括酰化氨基酸；
[0070]
x
53
是gln、asp、glu或asn，任选地，其中，x
53
是asn，
[0071]
任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中仅一个是aib；其中
[0072]
所述缀合物的自切割二肽包括通式结构a-b-；
[0073]
其中
[0074]
a是酰化氨基酸；和
[0075]
b是n-烷基化氨基酸；
[0076]
其中，x
33
、x
35
和a中的每一个的所述酰化氨基酸是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸的氨基酸，任选地经由间隔基，并且其中，自切割二肽与所述pth肽通过在b和pth肽的伯胺之间形成酰胺键来连接，任选地，其中，伯胺位于第13、16、19、22或26位存在的赖氨酸置换的侧链或pth肽的n-末端α胺上。在另外的实施方式中，自切割二肽的氨基酸“a”是用c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸酰化的赖氨酸残基。在一种实施方式中，选择a和b以提供在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t1/2)为至少约24小时至约240小时、约48小时至约168小时、约48至约120小时、或约70至约120小时、约80至约120小时、约90至约120小时、或约100至约120小时。在一种实施方式中，本文公开的任何pth缀合物的c-末端氨基酸可以经修饰以用酰胺替换天然羧基基团。
[0077]
根据一种实施方式，提供了pth的缀合物衍生物，其中，自切割二肽经由酰胺键与所述pth肽的n-末端α胺共价结合，另外其中，pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33-z(seq id no:2)、svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhfnx
35 seq id no:15)或svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33 seq id no:2)的序列，其中
[0078]
x
33
和x
35
各自独立地是氨基酸，其中，氨基酸侧链用c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸酰化，任选其中，x
33
和x
35
独立地选自c16-c20酰化赖氨酸、c16-c20酰化鸟氨酸、c16-c20酰化半胱氨酸和c16-c20酰化高半胱氨酸，任选地，其中，x
33
和x
35
两者均是c16-c20酰化lys；z选自由f-r、fv-r fva-r、fval-r、fvalg-r和fvalga-r组成的组，其中，r是cooh或conh2，并
且所述自切割二肽是具有以下结构的二肽：
[0079][0080]
其中
[0081]r1,
是选自由c
1-c
18
烷基、(c
1-c4烷基)oh、(c
1-c4烷基)sh、(c
1-c4烷基)cooh和(c
1-c4烷基)nh2组成的组的侧链，任选地，其中，c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸与所述侧链共价连接；
[0082]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0083]
r3是c
1-c4烷基，或者r4和r3连同它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环，包括例如吡咯烷环；和
[0084]
r5是nh2，条件是当r4和r3连同它们所附接的原子一起形成5元或6元杂环(包括例如吡咯烷环)时，r2不是h。在一种实施方式中，a、x
33
和x
35
的酰化氨基酸独立地选自具有以下通式结构的氨基酸
[0085][0086]
其中，n是选自1-4范围的整数以及r
50
选自由以下组成的组：nh-co(ch2)
14-20
cooh、nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、s(ch2)
14-20
cooh、s-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、n＝n＝n-[间隔基]-co(ch2)
14-20
coo、hc≡c-[间隔基]-co(ch2)
14-20
coo和cho-[间隔基]-co(ch2)
14-20
coo。在一种实施方式中，a、x
33
和x
35
的酰化氨基酸独立地选自赖氨酸、d-赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、叠氮丙氨酸、2-(4'-戊烯基)丙氨酸或丙氨醛，其中，所述酰化氨基酸的侧链任选地通过包括氨基酸或二肽的间隔基与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接。在一种实施方式中，间隔基包括γ谷氨酸。在一种实施方式中，任选的间隔基包括两个γ谷氨酸，任选地，其中，两个γ谷氨酸经由插入的官能化peg聚合物[coch2(och2ch2)khn]q彼此连接，其中，k和q各自是独立地选自1、2、3、4、5、6、7或8的整数。在一种实施方式中，间隔基是-{γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-。在另外的实施方式中，自切割二肽具有式i的结构，其中，r1,是(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh；r2和r8各自是h；r4是h或ch3；r3是ch3以及r5是nh2，任选地，其中，自切割二肽的第一个氨基酸是呈d-立体化学构型的氨基酸，以及间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)khn]q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数以及q是1、2、4或8。在一种实施方式中，k是2或4以及q是1或2。
[0087]
根据一种实施方式，提供了药物组合物，包括本文公开的任何新型pth缀合物，优
选地纯度水平为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。此类组合物可以包含浓度为至少0.1-10mg/ml或更高的如本文所公开的pth缀合物。在一种实施方式中，药物组合物包括经消毒并任选地储存在各种包装容器中的水性溶液。在其他实施方式中，药物组合物包括冻干粉末。药物组合物可以另外包装为试剂盒的一部分，该试剂盒包括用于向患者施用组合物的一次性装置。可以将容器或试剂盒进行标记在环境室温或在冷藏温度下储存。
[0088]
根据一种实施方式，提供了治疗有需要的患者的甲状旁腺功能减退症的改善方法。该方法包括以对控制甲状旁腺功能减退症治疗有效的量施用本公开的pth缀合物的步骤。在一种实施方式中，pth肽用大小足以以高亲和力结合血清白蛋白的脂肪酸或二酸基团酰化，并且另外，其中pth肽与自切割二肽连接，其中，二肽的氨基酸任选地用大小足以以高亲和力结合血清白蛋白的脂肪酸或二酸基团酰化。
[0089]
根据一种实施方式，提供了治疗有需要的患者的骨质疏松症或骨质减少的改善方法。该方法包括以对控制血清钙水平治疗有效的量施用本公开的pth缀合物的步骤。在一种实施方式中，pth肽用大小足以以高亲和力结合血清白蛋白的脂肪酸或二酸基团酰化，并通过与自切割二肽连接另外修饰，其中，二肽的氨基酸任选地用大小足以以高亲和力结合血清白蛋白的脂肪-酰基基团酰化。
附图说明
[0090]
图1是示出(seq id no:1)对人中钙尿排泄率的影响的图。示出了皮下施用100ug剂量的后血浆pth水平和钙尿排泄率随时间的变化。尽管可有效逆转钙流失，但该化合物具有的作用持续时间不足，导致对血清钙水平的充分控制限于一天中的仅1/3，其余时间期间过高和过低。
[0091]
图2a-2b展示了使用二肽形成pth的前药。图2a是从pth缀合物切割酰胺连接的二肽以形成生物激活的pth肽和二酮哌嗪(dkp)的反应示意图。图2b表明化学切割是线性的零级反应，不具有浓度依赖性，并且不需要额外的组分(酶或催化剂)。在特定ph和温度下的反应速度是特定二肽的函数，并且可以从小于30分钟调整到超过500小时。
[0092]
图3a和3b示出了pth类似物在用产生camp的荧光素酶报道基因稳定转染的pth受体-1中刺激pth受体的能力。图3a提供了seq id no:9、10、11和12的数据，同时图3b呈现了seq id no:9、12、13和14的数据。pth类似物的氨基酸序列如下提供。数据表明，其中通过在第35位添加酰化赖氨酸(具有与其侧链连接的c18脂肪二酸链)共价修饰35个氨基酸的pth肽的pth类似物对pth受体(seq id no:12)保持高效力，而酰化二肽(seq id no:10、11和14)与pth(1-34)的附接降低效力，并且酰化二肽在n-末端的附接以及在羧基末端氨基酸处的酰化的组合也具有低效力(seq id no:13)。
[0093][0094][0095]
图4示出了33个氨基酸pth类似物(包括seq id no:2的pth序列)在用产生camp的荧光素酶报道基因稳定转染的pth受体-1的细胞中刺激pth受体的能力。seq id no:18是pth类似物，在第8位包括丙氨酸置换，其降低对pth受体的pth活性。数据表明，与34个氨基酸的pth类似物相似，将脂肪酸链添加至33个氨基酸的pth类似物的c-末端保留了母体化合物(seq id no:16)的高效力，但在羧基末端处二肽与脂肪酰化的组合降低效力(seq id no:17)：
[0096][0097]
图5a-5c是证明以下的图：在pth肽的c-末端处包括酰化氨基酸的pth类似物在小鼠中在72小时的延长时间内以剂量-效应的方式提高血清钙水平(图5a)和降低血清磷酸盐(图5b)的体内功效。
[0098]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhk(γe-coc
16h32
co2h)f-oh(seq id no:102)。图5c是证明额外的酰化pth类似物(pth(1-34)、k33(γe-二酸c18)(seq id no:102)；pth(1-33)、k33(γe)-二酸c18)(seq id no:74)；和pth(1-33)、k33(γe-(minipeg)
2-γe-二酸c18)(seq id no:77)在小鼠中增加血清钙水平的体内功效的图。
[0099]
图6a和6b表示药代动力学(pk)研究的结果，以确定在小鼠中使用pth类似物设计成缓释持续时间，但不能转化为活性药物的出现和消失时间。每种化合物以100nmol/kg sc的剂量在小鼠中皮下施用。图6a示出了以下的数据：(dk)gsvseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhk(γe-(minipeg)
2-γe-coc
16h32
co2h)-oh(seq id no:78)；
[0100]
(dk)gsvseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhk
[0101]
(γe-(minipeg)
2-γe-coc
18h32
co2h)-oh(seq id no:84)；和
[0102]
(dk)(γe-(minipeg)
2-γe-coc
16h32
co2h)gsvseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhk(γe-(minipeg)
2-γe-coc
16h32
co2h)-oh(seq id no:79)。图6b示出了与图6a中seq id no:78、84和79相同的结果，但以对数形式表示。图6a和6b证明了脂肪酰基长度的重要性以及本发明的酰化和二酰化pth类似物之间的差异。
[0103]
图7a和7b表示药代动力学(pk)研究的结果，以确定在猴中施用25nmol/kg前药pth-类似物单次皮下给药的保留时间，其中，pth肽已在第8位用丙氨酸置换修饰以产生低效力pth类似物。图7a是证明以下的图：前药pth类似物seq id no:94：pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)dk-1
、n(me)g0；及其活化形式seq idno:93：pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)在施用单次给药的前药(seq id no:94)之后随时间的检测水平。图7b是证明以下的图：前药pth类似物seq id no:95：pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)dk-1
(γe-2xoeg-γe-二酸c18)、n(me)g0及其活化形式：seq id no:93:pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)在施用单次给药的前药(seq id no:95)之后随时间的检测水平。数据表明活性形式随时间的蓄积，对应于前药形式的减少，导致在延长的时间段内活性形式的量相对一致。双脂肪酰化的前药(seq id:95)比单脂肪酰化的前药(seq id:94)达到持续更长时段的更高的浓度。
[0104]
图7c是与图7a中呈现的相同的药物浓度结果，以对数标度呈现。
[0105]
图7d是与图7b中呈现的相同药物浓度结果，以对数标度呈现
[0106]
图8a-8c示出了响应于以下的治疗：图8a中用pth(1-34)(本发明seq id no:77的激动剂)；图8b中，用不可切割的前药seq id no:79；图8c中，用pth(1-34)，和可切割的前药seq id no:87，在实施例11中描述的camphunter teriparitide bioassay中使用的cho-k1pthr1细胞中环amp产生的功能反应。
[0107]
图9a-9f示出了本发明的pth前药seq id no:87与其活性药物形式seq id no:77在pbs缓冲液中经过8天时程的lcms结果。7.3分钟的峰示出前药，并且在图9a中，在0天，这是唯一的峰。在图9b中，某一天在6.5分钟开始出现活性药物峰。在图9c和9d中，分别在2天和3天，活性药物仍然少于前药。在图9e和9f中，分别在5天和8天，活性药物多于前药。
[0108]
图10是来自实施例11的lcms测定数据拟合成零级反应动力学的图。lcms测定示出了前药seq id no:87在192小时内转化成活性药物seq id no:77，并示出半衰期为112小时，具有高线性相关性(r》0.99)。
[0109]
图11示出了用本发明的肽seq id no:87、seq id no:77或用pth(1-34)在治疗第0至8天，在不同温育时长后，来自camphunter teriparitide bioassay的cho-k1 pthr1细胞中产生环amp的功能反应，如图9a-9f中所评估。
[0110]
图12示出了在用肽seq id no:77、seq id no:109和seq idno:110治疗后，来自camphunter teriparitide bioassay的cho-k1pthr1细胞中产生环amp的功能反应。
[0111]
图13a和13b示出了在用图13a，seq id no:77、seq id no:118和seq id no:120；以及图13b，seq id no:77、seq id no:122和seq id no:124中的肽治疗后，来自camphunter teriparitide bioassay的cho-k1 pthr1细胞中产生环amp的功能反应。
[0112]
图14a和14b是在用溶媒、20或40nmol/kg的pth类似物seq id no:77治疗48小时的时间段后小鼠中绝对血清钙水平(图14a)和钙水平的相对变化(图14b)的图。
[0113]
图15示出了在施用前药seq id no:87和活性药物seq id no:77之后一周时段内
大鼠中的血清浓度。通过皮下注射给予前药或活性药物单次给药，并在一周的时程中进行血清浓度测量。还测量了源自前药的活性药物的量(黑色虚线，方形符号)。
[0114]
图16a和16b示出了在30或60nmol/kg的前药seq id no:87皮下给药之后一周的时段内大鼠中的绝对血清钙浓度及其变化。
[0115]
图17a和17b示出了在30或60nmol/kg的前药seq id no:87皮下给药之后一周的时段内大鼠中的绝对血清磷酸盐浓度及其变化。
[0116]
图18a和18b是在每日皮下注射溶媒、20nmol/kg活性药物seq id no:77、20nmol/kg或40nmol/kg前药seq id no:87之后的sprague-dawley大鼠中血清钙水平(图18a)和血清磷酸盐水平(图18b)的变化图。
[0117]
图19a和19b是从第0天开始每日七次皮下注射后的大鼠中前药seq id no:87(图19a)和活性药物seq id no:77(图19b)的血清浓度图，在不同时间点进行测量为期144小时。前药与药物的总浓度存在4倍差异。
[0118]
图20a和20b是示出以下的图：从第0天开始用重复28次每日溶媒给药治疗，以4、8和12nmol/kg前药seq id no:87治疗28天的啮齿动物中钙水平(图20a)以及在第28天末次给药后的洗脱钙水平(图20b)。
[0119]
图21是在重复给药28天的大鼠中，通过lcms对从不同起始剂量(4、8或12nmol/kg)的前药seq id no:87的前药转化成药物的药代动力学分析，如实施例5中详述。实线示出以nm计的前药血浆浓度，而相应的虚线是活性药物seq id no:77的血浆浓度。
[0120]
图22是通过lcms对图21的较小时间部分进行的药代动力学分析，并且它示出了来自实施例15的停止重复给药后活性药物(实心条)和前药(白色虚线条)的血浆浓度水平和末次给药后数小时(2、7和24)内血浆浓度的变化。
[0121]
图23是疾病模型大鼠(进行手术操作的对照大鼠(假手术)和进行甲状旁腺切除术的其他大鼠)中的钙血浆浓度图，其中它们然后用溶媒或10、25或40nmol/kg前药seq id no:87治疗。在第0、24、48、72小时(72小时是末次给药)的时间进行每次测量之前给药，并且在144小时，即末次给药后的72小时进行额外的测量。
[0122]
图24是示出具有假手术对照的疾病模型大鼠的血清钙水平的图，如实施例5中所述。向大鼠给药溶媒或不同水平的化合物，10、25和40nmol/kg前药seq id no:87，在10天内每日给药并在25天内测定。
[0123]
图25是示出具有假手术对照的疾病模型大鼠的血清磷酸盐水平的图，如实施例5中所述。向大鼠给药溶媒或不同水平的化合物，10、25和40nmol/kg前药seq id no:87，在10天内每日给药并在25天内测定。
[0124]
图26a和26b是皮下给药不同浓度的前药seq id no:87(2.5、3.75和5.0nmol/kg)后猴中前药seq id no:87(图26a)和活性药物seq id no:77(图26b)的血清浓度图。前药与药物存在约4倍的差异。
具体实施方式
[0125]
定义
[0126]
在描述和要求保护本发明时，将根据以下给出的定义使用以下术语。
[0127]
如本文所用，如本文所用的术语“pth肽”包括含有seq id no:7的氨基酸序列或
seq id no:7的氨基酸序列的任何类似物的任何肽，包括肽的氨基酸置换、添加、缺失或翻译后修饰(例如甲基化、酰化、烷基化、聚乙二醇化等)，其中该类似物在向患者施用后刺激血液中钙的增加。
[0128]
如本文所用，术语“约”意指大于或小于规定的值或值范围百分之10，但并非旨在将任何值或值范围仅限于该更广泛的定义。以术语“约”开头的每个值或值范围还旨在涵盖所述绝对值或值范围的实施方式。
[0129]
如本文所用，术语“天然(native或natural)”定义在自然界中发现的条件。“天然氨基酸”是存在于自然界中的通过自然方式产生的氨基酸。
[0130]
如本文所用，术语“氨基酸”涵盖包含氨基和羧基官能团两者的任何分子，其中，氨基和羧基基团与相同的碳(α碳)附接。α碳任选地可以具有一个或两个另外的有机取代基。氨基酸可以通过其三字母代码、一个字母代码或在一些情况下通过其侧链名称来指定。例如，包括与α碳附接的环己烷基团的非典型氨基酸称为“环己烷”或“环己基”。出于本公开的目的，在没有具体说明其立体化学的情况下对氨基酸的命名旨在涵盖氨基酸的l或d形式，或外消旋混合物。然而，在氨基酸由其三字母代码(例如，lys)或单字母(例如，k)指定的情况下，这种命名旨在指定氨基酸的天然l形式，而d形式将通过在三字母代码或单个代码之前包含小写d(即dlys或dk)来指定。如本文所用，特定氨基酸的命名旨在涵盖天然氨基酸以及其分子量与天然氨基酸不同但具有与天然氨基酸等效的物理和生物学特性的任何同位素富集的衍生物。
[0131]
如本文所用，术语“羟基酸”是指经修饰以用羟基基团替换α碳氨基基团的氨基酸。
[0132]
如本文所用，术语“非编码(非典型)氨基酸”涵盖并非以下20种氨基酸中任何一种的l-异构体的任何氨基酸：ala、cys、asp、glu、phe、gly、his、ile、lys、leu、met、asn、pro、gln、arg、ser、thr、val、trp、tyr。
[0133]“二肽”是α氨基酸或α羟基酸通过肽键与另一个氨基酸连接的结果。
[0134]
如本文所用，没有任何另外指定的术语“化学切割”涵盖导致共价化学键断裂的非酶促反应。
[0135]“生物活性肽”是指可以在体外和/或体内发挥生物效应的肽。如本文所用，对肽的一般提及旨在涵盖具有修饰的氨基和羧基末端的肽。例如，指定标准氨基酸的氨基酸序列旨在涵盖n-末端和c-末端的标准氨基酸以及n-末端的相应羟基酸和/或相应c-末端氨基酸，其经修饰以包括代替末端羧酸的酰胺基团。
[0136]
如本文所用，“酰化”氨基酸是包括酰基基团的氨基酸，其对于天然存在的氨基酸是非天然的，无论其产生方式如何。产生酰化氨基酸和酰化肽的示例性方法是本领域已知的并且包括在肽包合或肽合成之前酰化氨基酸，随后对肽进行化学酰化。在一些实施方式中，酰基基团引起肽具有以下一项或多项：(i)循环中半衰期延长，(ii)延迟起效，(iii)作用持续时间延长，(iv)对蛋白酶诸如dpp-iv的抗性改善，以及(v)改变pth受体的效力。
[0137]
如本文所用，“烷基化”氨基酸是包括烷基基团的氨基酸，其对于天然存在的氨基酸是非天然的，无论其产生方式如何。产生烷基化氨基酸和烷基化肽的示例性方法在本领域中是已知的并且包括在肽包合或肽合成之前烷基化氨基酸，随后对肽进行化学烷基化。
[0138]
如本文所用，术语“前药”定义为在显示其药理作用之前经历化学修饰的任何化合物。
[0139]
如本文所用，“受体”是识别特定分子并以高亲和力相互作用与特定分子结合的分子，在细胞中或对宿主生物的细胞和/或组织(直接或间接)产生一些生物效应。“细胞受体”是细胞上或细胞内的分子，它识别特定分子并与特定分子结合，在细胞中(直接或间接)产生某种作用。
[0140]
如本文所用，术语“同一性”涉及两个或更多个序列之间的相似性。同一性通过将相同氨基酸残基数除以残基总数并将乘积乘以100来获得百分比进行测量。因此，完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性，而相对于彼此具有氨基酸缺失、添加或置换的两个序列具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到，若干计算机程序，诸如采用算法诸如blast(basic local alignment search tool,altschul et al.(1993)j.mol.biol.215:403-410)的计算机程序可用于确定序列同一性。
[0141]
术语“pth肽”是指以下的那些肽，该肽对天然pth受体具有生物活性(作为激动剂或拮抗剂)并包括与比对部分中(seq id no:7)的肽序列具有至少70％序列同一性(例如，70％、75％、80％、85％、90％、95％)的氨基酸序列。
[0142]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括任何标准药用载体，诸如磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂(例如油/水或水/油乳剂)以及各种类型的润湿剂。该术语还涵盖任何经美国联邦政府监管机构批准或在美国药典中列出的用于动物(包括人)的药剂。
[0143]
如本文所用，术语“磷酸盐缓冲盐水”或“pbs”是指包括氯化钠和磷酸钠的水性溶液。本领域技术人员已知不同pbs制剂，但对于本公开的目的，短语“标准pbs”是指具有终浓度为137mm nacl、10mm磷酸盐、2.7mm kcl和ph为7.2-7.4的溶液。
[0144]
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的生物活性并且在生物学或其他方面不是非期望的化合物的盐。由于存在氨基和/或羧基基团或与其类似的基团，本文公开的许多化合物可以形成酸和/或碱盐。
[0145]
如本文所用，术语“治疗”包括预防特定疾患或病症，或减轻与特定疾患或病症相关的症状和/或预防或消除所述症状。
[0146]
如本文所用，药物的“有效”量或“治疗有效量”是指无毒量但足以提供期望作用的药物。根据个体的年龄和一般状况、施用方式等，“有效”量将因受试者而异或甚至在受试者内随时间而异。因此，并不总是可以指定确切的“有效量”。然而，任何个体情况下的适当“有效”量可以由本领域普通技术人员使用常规实验确定。
[0147]
术语“肠胃外”意指不通过消化道，而是通过一些其他途径，诸如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。
[0148]
如本文所用，氨基酸“置换”是指一个氨基酸残基被不同氨基酸残基替换。
[0149]
如本文所用，术语“保守氨基酸置换”在本文中定义为以下五组中的一组内的交换：
[0150]
i.小脂肪族、非极性或微极性残基：
[0151]
ala、ser、thr、pro、gly；
[0152]
ii.极性、带负电荷的残基及其酰胺：
[0153]
asp、asn、glu、gln；
[0154]
iii.极性、带正电荷的残基：
[0155]
his、arg、lys；鸟氨酸(orn)
[0156]
iv.大脂肪族非极性残基：
[0157]
met、leu、ile、val、cys、正亮氨酸(nle)、高半胱氨酸(hcys)
[0158]
v.大芳香族残基：
[0159]
phe、tyr、trp、乙酰苯丙氨酸、萘丙氨酸(nal)
[0160]
如本文所用，通用术语“聚乙二醇链”或“peg链”是指由通式h(och2ch2)koh表示的支链或直链的环氧乙烷和水的缩聚物的混合物，其中k是至少2。如本文所用，术语“minipeg”或“oeg”定义了包括以下结构的官能化聚乙烯化合物：
[0161][0162]
如本文所用，术语“聚乙二醇化”和类似术语是指通过将聚乙二醇链与化合物连接而从其天然状态修饰的化合物。“聚乙二醇化多肽”是具有与多肽共价结合的peg链的多肽。
[0163]
如本文所用，“接头”或“间隔基”是将两个单独的实体彼此结合的键、分子或分子基团。接头可以提供两个实体的最佳间隔，或者可以另外提供使两个实体彼此分离的不稳定连接。不稳定的键包括光可切割基团、酸不稳定部分、碱不稳定部分和酶可切割基团。
[0164]
如本文所用，“二聚体”是包括经由接头彼此共价结合的两个亚基的复合物。术语二聚体，当在没有任何限定语言的情况下使用时，涵盖同二聚体和异二聚体两者。同二聚体包括两个相同的亚基，而异二聚体包括两个不同的亚基，尽管这两个亚基彼此基本相似。
[0165]
如本文所用，术语“c
1-cn烷基”，其中n可以是1至6，表示具有一个至指定数量的碳原子的支链或直链烷基基团。典型的c
1-c6烷基基团包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
[0166]
如本文所用，术语c16-c20脂肪酸指定结构：
[0167]-co(ch2)
15-18
ch3以及术语c16-c20二酸指定结构：-co(ch2)
1418
cooh，其中前缀“c16-c20”指定该命名所涵盖的化合物中的可变总碳数。例如，c18二酸表示结构：-co(ch2)
16
cooh。如本文所用，对酰化氨基酸的一般提及涵盖具有其侧链经脂肪酸酰化的氨基酸和具有其侧链经二酸酰化的氨基酸。
[0168]
如本文所公开的生理条件旨在包括约35至40℃的温度和约7.0至约7.4的ph，并且更典型地包括7.2至7.4的ph和36至38℃的温度。由于人的生理ph和温度在高度限定的范围内受到严格调节，因此从二肽/药物复合物(前药)到药物的转化速度将表现出高患者内和患者间再现性。
[0169]
如本文所用，未进一步指定的术语“患者”旨在涵盖任何温血脊椎家养动物(包括例如但不限于家畜、马、猫、犬和其他宠物)和人，并且包括不在医生的直接护理下的个体。
[0170]
缩略语：
[0171]
小写k＝赖氨酸的d-异构体
[0172]
γe＝γ谷氨酸的l-异构体
[0173]
(minipeg)2＝coch2och2ch2och2ch2nh
[0174]
coc
16h32
co2h＝(c18二酸)
[0175]
(n-me)g＝肌氨酸
[0176]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh(seq id no:7)＝pth
[0177]
大写k＝赖氨酸的l-异构体
[0178]
实施方式
[0179]
根据一种实施方式，提供了改善的甲状旁腺激素(pth)类似物和治疗甲状腺功能减退症和骨质疏松症的方法。更具体地，相对于天然pth及其已知活性片段，本文公开的pth类似物具有改善的治疗指数和延长的作用时间。
[0180]
根据一种实施方式，提供了甲状旁腺激素的缀合衍生物和pth相关肽(pthrp)的缀合衍生物，其中，相对于未修饰的母体肽，该衍生物在向包括智人的温血哺乳动物施用时时具有体内延长的作用时间和改善的治疗指数。在一种实施方式中，缀合的衍生物包括自切割二肽，任选地被酰化，与n-末端α胺连接并且在c-末端氨基酸处酰化。更具体地，在一种实施方式中，修饰的甲状旁腺激素(pth)是分别包括seq id no:2、3或30的序列的33、34或35个氨基酸的肽，或包括与比较序列的比对部分中的seq id no:2、3、7或30具有至少85％、90％、95％或97％序列同一性的氨基酸序列，其具有与选自第13、16、19、22、26和33位(相对于seq id no:7)的氨基酸侧链或在c-末端的氨基酸处共价连接的脂肪酸或二酸基团(包括例如c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸)，并且任选地通过自切割二肽的共价连接另外修饰。自切割二肽可以经由酰胺键连接至pth肽的任何伯胺，包括n-末端α胺或肽的带有肽侧链的任何伯胺，包括例如在选自以下位置处的氨基酸处：第13、16、19、22、26和33位(相对于seq id no:7)。包括自切割二肽的氨基酸侧链可以任选地与脂肪酸或二酸基团或其他聚合物连接，以更有效地阻断pth肽的活性，直至通过非酶促自切割机制来去除自切割二肽。在一种实施方式中，二肽的第一个氨基酸具有的侧链用c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸酰化。
[0181]
在一种实施方式中，自切割二肽经由酰胺键与pth肽的氨基末端共价连接，任选地在n-末端α胺处，并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处进一步包括酰化氨基酸：第13、16、19、22、26和33位(相对于seq id no:7)或作为c-末端氨基酸。在一种实施方式中，本公开的pth缀合物的修饰的pth肽包括选自由以下组成的组的序列：
[0182]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh(seq id no:7)、
[0183]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhn(seq id no:31)、
[0184]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnf(seq id no:32)、
[0185]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfv(seq id no:33)、
[0186]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfva(seq id no:34)、
[0187]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfval(seq id no:35)、svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfvalg(seq id no:36)和
[0188]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfvalga(seq id no:37)，其中pth肽通过以下修饰：自切割二肽的共价连接，任选地在pth肽的n-末端α胺处，以及与在seq id no:7、31-37中的任一个的肽的第13、16、19、22、26、33位的氨基酸侧链或在c-末端部分或者与其任何类似物的相应位置连接足够大小(例如，c14-c22脂肪酸或c14-c22二酸)以结合血清白蛋白的酰基基团，任选地，其中，seq id no:7、31-37的肽在选自第13、16、19、22、26、33位和c-末端氨基酸的一个或两个位置处包括酰化赖氨酸残基的置换。在一种实施方式中，提供了pth的缀合物，其中，seq id no:7、31-37中任一个的pth肽通过在第33位的天然氨基酸和/或在pth肽的c-末端氨基酸处或其任何类似物的相应位置的天然氨基酸通过酰化赖氨
酸置换而被修饰，并且自切割二肽经由酰胺键与pth肽的n-末端氨基酸共价连接，任选地，其中所述自切割二肽的第一个氨基酸被酰化，任选地，其中，酰化氨基酸包括c14-c20脂肪酸、c14-c20二酸、c16-c18脂肪酸或c16-c18二酸。
[0189]
根据本公开，自切割二肽包括与pth肽的伯胺连接的两个氨基酸的组合，使得在生理条件下，二肽将经由非酶促降解机制自发切割来释放pth肽的二肽。在一种实施方式中，自切割二肽的氨基酸中的一个，任选地第一个氨基酸，用c14-c20脂肪酸或c14-c20二酸酰化以另外抑制与其共价连接的pth的活性。在一种实施方式中，自切割二肽与位于pth肽(相对于seq id no:7)的第13、16、19、22或26位的氨基酸侧链上的伯胺或在n-末端伯胺处连接。因此，自切割二肽的存在延迟缀合物形式与其靶受体相互作用的能力，直至化学切割以活性形式释放pth。根据本公开，本公开的pth缀合物的一种实施方式是pth(1-33)、dk-1
(γe-(minipeg)
2-γe-coc
16h32
co2h)、n(me)g0、k
33
(γe-2xoeg-γe-二酸c18)，其完整结构为：k(x)(n-me)gsvseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhk(x)-oh(seq id no:87)，
[0190]
其中k是d-lys；
[0191]
x是γe-(minipeg)
2-γe-coc
16h32
co2h；
[0192]
γe是γ谷氨酸的l-异构体；
[0193]
(minipeg)2是coch2och2ch2och2ch2nh；
[0194]
coc
16h32
co2h是c18二酸；
[0195]
(n-me)g是肌氨酸；
[0196]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhk是pth(1-32；seq id no:7)+k33；
[0197]
k是l-lys；和
[0198]-oh表示c-末端氨基酸具有末端羧酸。
[0199]
在某些实施方式中，本发明的pth缀合物的分子量为5873.9道尔顿。
[0200]
在一些实施方式中，本发明提供了pth缀合物，其中替代的部分用于缀合物中的一个或多个minipeg。非限制性实例包括
[0201][0202]
在一些实施方式中，本发明提供了pth肽，其中该pth肽包括以下中的一种或多种：
tyr(opo3h2)：cys(so3h)：
[0203][0204]
有利地，自切割二肽的切割速率取决于二肽元件的结构和立体化学，并且还取决于二肽上存在的诱导切割成二酮哌嗪或二酮吗啉相关实体的亲核体的强度。在一种实施方式中，基于二肽的所选结构，二肽/药物复合物的非酶促半衰期(t1/2)可以选择在生理条件下为1-720小时之间。如本文所公开的生理条件旨在包括约35至40℃的温度和约7.0至约7.4的ph，更典型地包括7.2至7.4的ph和36至38℃的温度。由于生理ph值和温度在高度限定的范围内受到严格调节，因此从二肽/药物复合物到药物的转化速度将表现出高患者内和患者间再现性。化学转化的速度将决定体内生物作用的开始时间和持续时间。因此，本公开的施用的pth类似物的激活取决于不依赖于额外的化学添加剂或酶的分子内化学反应，并且其中转化速度由二肽置换的固有化学性质控制。
[0205]
在一种实施方式中，自切割二肽元件经由酰胺键与pth肽共价结合，并且二肽进一步包括与自切割二肽的氨基酸侧链连接的储库聚合物。在一种实施方式中，两种或更多种储库聚合物与单个自切割二肽元件连接。在一种实施方式中，选择储库聚合物以使其具有生物相容性并且具有足够大小，使得具有共价附接二肽的pth肽在向患者施用时保持隔离在注射部位和/或不能与其相应的受体相互作用。二肽的后续切割释放pth肽以与其预期的靶标相互作用。选择二肽元件上的不同置换组合将实现制备包括在期望时间段内释放药物的二肽/pth肽混合物的可注射组合物。合适的储库聚合物包括但不限于右旋糖酐、聚丙交酯、聚乙交酯、己内酯基聚合物、聚(己内酯)、聚酐、多胺、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚二噁烷酮、聚缩醛、聚缩酮、聚碳酸酯、聚磷酸酯、聚酯、聚对苯二甲酸丁二酯、聚原碳酸酯、聚磷腈、琥珀酸酯、聚(苹果酸)、聚(氨基酸)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚羟基纤维素、多糖、甲壳质、壳聚糖、透明质酸，以及其共聚物、三元共聚物和混合物，以及可生物降解的聚合物和它们的共聚物包括己内酯基聚合物、聚己内酯和包括聚对苯二甲酸丁二酯的共聚物。在一种实施方式中，储库聚合物选自由以下组成的组：聚乙二醇、右旋糖酐、聚乳酸、聚乙醇酸以及乳酸和乙醇酸的共聚物，并且在一种特定的实施方式中，储库聚合物是聚乙二醇。在一种实施方式中，储库聚合物包括与自切割二肽元件连接的一个或多个聚乙二醇链，其中储库聚合物的结合分子量为40,000至80,000道尔顿。
[0206]
根据一种实施方式，自切割二肽元件经由在pth的活性位点处的酰胺键与pth肽共价结合以形成药物的前药衍生物。在一种实施方式中，自切割二肽的第一个氨基酸呈d-立
体化学构型。在一种实施方式中，自切割二肽的第一个氨基酸的侧链与增强pth类似物在患者血流中的保留的部分共价连接。在一种实施方式中，与自切割二肽的第一个氨基酸连接的保留增强部分包括大小足以在向患者施用时结合血清白蛋白的烷基链。在一种实施方式中，自切割二肽的第一个氨基酸的侧链与包括14-30、14-22、16-20、16、18、20或22个碳原子的烷基链共价连接。在一种实施方式中，自切割二肽的第一个氨基酸呈d-立体化学构型的烷基化或酰化氨基酸。在一种实施方式中，自切割二肽的第一个氨基酸与具有长度为14-30、14-22、16-20、16、18、20或22个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸共价连接。
[0207]
在一种实施方式中，提供了pth肽的缀合物，其中pth肽与自切割二肽共价连接。在一种实施方式中，缀合物包括a-b-q的通式结构，其中
[0208]
a是氨基酸或羟基酸，任选地，其中氨基酸或羟基酸的侧链与储库聚合物或烷基或酰基链共价连接；
[0209]
b是n-烷基化氨基酸；
[0210]
q是根据本公开的酰化或烷基化pth肽，条件是当a是非酰化氨基酸时，则a是呈d-立体化学构型的氨基酸。在另外的实施方式中，对于本文公开的任何pth缀合物，所述a-b二肽的a或b中的一个可以是非编码氨基酸，包括例如d-立体化学构型的氨基酸。
[0211]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0212][0213]
其中
[0214]
r1,包括选自由以下组成的组的侧链：h、c
1-c
18
烷基、c
2-c
18
烯基、(c
1-c8烷基)oh、(c
1-c8烷基)sh、(c
2-c3烷基)sch3、(c
1-c4烷基)conh2、(c
1-c4烷基)cooh、(c
1-c4烷基)nh2、(c
1-c4烷基)nhc(nh
2+
)nh2、(c
0-c4烷基)(c
5-c6环烷基)、任选地进一步包含与所述侧链共价连接的c16-c30碳链；
[0215]
r2和r8独立地是h或c
1-c6烷基；
[0216]
r4选自由以下组成的组：h、c
1-c
18
烷基、c
2-c
18
烯基、(c
1-c8烷基)oh、(c
1-c8烷基)sh、(c
2-c3烷基)sch3、(c
1-c4烷基)conh2、(c
1-c4烷基)cooh、(c
1-c4烷基)nh2、(c
1-c4烷基)nhc(nh
2+
)nh2、(c
0-c4烷基)(c
5-c6环烷基)、
[0217][0218]
r3选自由c
1-c8烷基组成的组，或者r4和r3连同它们所附接的原子一起形成吡咯烷或哌啶环；
[0219]
r5是nh2或oh；以及
[0220]r10
是h、oh或nh2，条件是当r4和r3连同它们所附接的原子一起形成吡咯烷环时，r1和r2不是h。
[0221]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0222][0223]
其中
[0224]r1,
包括选自由以下组成的组的侧链：c
1-c
18
烷基、(c
1-c8烷基)oh、(c
1-c8烷基)sh和(c
1-c4烷基)cooh、(c
1-c4烷基)nh2，任选地进一步包括与所述侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸；
[0225]
r2和r8独立地是h或c
1-c6烷基；
[0226]
r4选自由以下组成的组：h、c
1-c
18
烷基、c
2-c
18
烯基、(c
1-c8烷基)oh、(c
1-c8烷基)sh、(c
2-c3烷基)sch3、(c
1-c4烷基)conh2、(c
1-c4烷基)cooh、(c
1-c4烷基)nh2、(c
1-c4烷基)nhc(nh
2+
)nh2、(c
0-c4烷基)(c
5-c6环烷基)、
[0227][0228]
r3选自由c
1-c8烷基组成的组；
[0229]
r5是nh2；以及
[0230]r10
是h、oh或nh2。
[0231]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0232][0233]
其中
[0234]
r1,包括选自由以下组成的组的侧链：c
1-c
18
烷基、(c
1-c8烷基)oh、(c
1-c8烷基)sh、(c
1-c4烷基)cooh、(c
1-c4烷基)nh2，以及与所述侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，任选地经由间隔基；
[0235]
r2和r8各自是h；
[0236]
r4选自由h和c
1-c8烷基组成的组；
[0237]
r3是c
1-c6烷基；和
[0238]
r5是nh2，其中，所述间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数以及q是选自1-4范围的整数。在一种实施方式中，k是2或4以及q是1或2。
[0239]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0240][0241]
其中
[0242]
r1包括(c
1-c4烷基)nh2的侧链，任选地，其中c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸与所述侧链共价连接，任选地经由间隔基；
[0243]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0244]
r3是c
1-c6烷基；以及
[0245]
r5是nh2，其中，所述间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数以及q是选自1-4范围的整数，任选地，其中，当r1由(c
1-c4烷基)nh2组成时，则自切割二肽的第一个氨基酸呈d-立体化学构型。在一种实施方式中，k是2或4以及q是1或2。
[0246]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0247][0248]
其中
[0249]
r1,选自由以下组成的组：(c
1-c8烷基)-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c8烷基)s-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c8烷基)-co(ch2)
14-20
cooh(c
1-c8烷基)s-co(ch2)
14-20
cooh和(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh；
[0250]
r2和r8各自是h；
[0251]
r4选自由以下组成的组：h、c
1-c8烷基、(c
1-c4烷基)oh、(c
1-c4烷基)sh、(c
2-c3烷基)sch3、(c
1-c4烷基)conh2、(c
1-c4烷基)cooh、(c
1-c4烷基)nh2、(c
1-c4烷基)nhc(nh
2+
)nh2、(c
1-c4烷基)(c
5-c6环烷基)，
[0252][0253]
r3选自由c
1-c6烷基组成的组，或者r4和r3连同它们所附接的原子一起形成吡咯烷或哌啶；
[0254]
r5是nh2；以及
[0255]r10
是h、oh或nh2，条件是当r4和r3连同它们所附接的原子一起形成吡咯烷环时，则r2不是h，任选地，其中，在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t
1/2
)为至少约20至240小时。
[0256]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0257][0258]
其中
[0259]
r1,选自由以下组成的组：(c
1-c4烷基)s-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)s-co(ch2)
14-20
cooh和(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh；
[0260]
r2和r8各自是h；
[0261]
r4选自由h和c
1-c8烷基组成的组；
[0262]
r3选自由c
1-c6烷基组成的组；和
[0263]
r5是nh2，任选地，其中，在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t
1/2
)为至少约48至168小时。在一种另外的实施方式中，r1,是(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3或(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh；r2和r8各自是h；r4是h或ch3；r3是c
1-c6烷基；以及r5是nh2。
[0264]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0265][0266]
其中
[0267]
r1,选自由以下组成的组：(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3和(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co
(ch2)
14-20
cooh；
[0268]
r2和r8各自是h或c
1-c4烷基；
[0269]
r4和r3连同它们所附接的原子一起形成哌啶环；以及
[0270]
r5是nh2，任选地，其中，在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t
1/2
)为至少约72至144小时，其中，所述间隔基包括选自γ谷氨酸和-[coch2(och2ch2)
k-nh]q的一个或多个部分，任选地，其中，所述间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数壹基金q是选自1-4范围的整数，任选地，其中，k是2或4以及q是1或2。在一种另外的实施方式中，r1,是(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh；r2和r8各自是h；r4是h或ch3；r3是c
1-c6烷基；以及r5是nh2。
[0271]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0272][0273]
其中
[0274]
r1,是(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
16
cooh或(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
18
cooh；
[0275]
r2和r8各自是h；
[0276]
r4是h或ch3；
[0277]
r3是ch3和
[0278]
r5是nh2，任选地，其中，r1,是(c
3-c4烷基)nh-co(ch2)
16
cooh以及r4是ch3。
[0279]
根据一种实施方式，自切割二肽元件(a-b)包括以下结构：
[0280][0281]
其中
[0282]
r1,是(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
16
cooh或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
18
cooh；
[0283]
r2和r8各自是h；
[0284]
r4是h或ch3；
[0285]
r3是ch3以及
[0286]
r5是nh2，任选地，其中，r1,是(c
3-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
16
cooh和r4是ch3，其中，所述间隔基是γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数以及q是选自1-4范围的整数，任选地，其中，k是2或4以及q是1或2，任选地，其中，k和q两者均是2。
[0287]
在一种实施方式中，本公开的pth缀合物的pth肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0288]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfvalgapl aprdagsqrprkkednvlveshekslgeadkadvnvltkaksqx
35
(seq id no:20)；
[0289]
avsehqllhdkgksiqdlrrrfflhhliaeihtaeirax
35
(seq id no:96)；
[0290]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfvalx
35
(seq id no:21)；
[0291]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq id no:12)；
[0292]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhqfx
35
(seq id no:14)；
[0293]
svseiqlmhnlx
12
x
13
hlx
16
x
17
mervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:4)；
[0294]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:5)；
[0295]
svseiqlmhnlx
12
khlx
56
x
17
mervewlrkklqdvh-z(seq id no:6)；
[0296]
svseiqlmhx
10
lgx
13
hlx
16
sx
18
ervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z,(seq id no:133)；
[0297]
svseiqlmhx
10
lx
12
khlx
16
x
17
x
18
ervewlrkklqdvh-z；(seq id no:134)；
[0298]
svseiqlmhx
10
lgkhlx
16
sx
18
ervewlrkklqdvh-z(seq id no:135)；
[0299]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdgh-z(seq id no:22)；
[0300]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0301]
svseiqlmhnlgehlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:23)；
[0302]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlreklqdvh-z(seq id no:24)；或
[0303]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkelqdvh-z(seq id no:25)；
[0304]
其中
[0305]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地z是x
33
f、x
53
fx
35
或x
33
；
[0306]
x
10
和x
16
独立地是asp、gln或asn；
[0307]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0308]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0309]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0310]
x
18
是met、met(o)或nleu；
[0311]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0312]
x
31
是gly或val；
[0313]
x
33
和x
35
各自包括酰化或烷基化氨基酸；
[0314]
x
53
是gln、asp、glu或asn，任选地，其中，x
53
是gln或asn或者x
53
是asn，并且任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中仅一个是aib，任选地，其中，c-末端氨基酸经修饰以用酰胺替换羧基末端。
[0315]
在一种实施方式中，本公开的pth缀合物的pth肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0316]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq id no:12)；
[0317]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhqfx
35
(seq id no:14)；
[0318]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:5)；
[0319]
svseiqlmhx
10
lgkhlx
16
sx
18
ervewlrkklqdvh-z(seq id no:135)；
[0320]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdgh-z(seq id no:22)；或
[0321]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0322]
其中
[0323]
z是x
33
f、x
53
fx
35
或x
33
；
[0324]
x
10
和x
16
独立地是asp、gln或asn；
[0325]
x
18
是met、met(o)或nleu；
[0326]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0327]
x
31
是gly或val；
[0328]
x
33
和x
35
各自包括酰化或烷基化氨基酸，任选地，其中，x
33
是酰化lys以及x
35
是酰化cys；
[0329]
x
53
是gln、asp、glu或asn。
[0330]
在一种实施方式中，本公开的pth缀合物的pth肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0331]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:5)；svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdgh-z(seq id no:22)；或
[0332]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0333]
其中
[0334]
z是x
33
f、x
53
fx
35
或x
33
；
[0335]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0336]
x
31
是gly或val；
[0337]
x
33
和x
35
各自独立地是具有以下的侧链的氨基酸：(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)s-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)s-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)s-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)s-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3；和
[0338]
x
53
是gln、asp、glu或asn，任选地，其中，x
33
和x
35
是具有选自由以下组成的组的侧链的氨基酸：(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh和(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3，其中，间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数以及q是选自1-4范围的整数。在一种实施方式中，k是2或4以及q是1或2。
[0339]
在一种实施方式中，提供了表现出改善的治疗指数和改善的体内保留时间的pth肽缀合物，其中该缀合物包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0340]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfvalgapl aprdagsqrprkkednvlveshekslgeadkadvnvltkaksqx
35
(seq id no:20)；
[0341]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfvalx
35
(seq id no:21)；
[0342]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq id no:12)；
[0343]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhqfx
35
(seq id no:14)；
[0344]
svseiqlmhnlx
12
x
13
hlx
16
x
17
mervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:4)；
[0345]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:5)；
[0346]
svseiqlmhnlx
12
khlx
56
x
17
mervewlrkklqdvh-z(seq id no:6)；
[0347]
svseiqlmhx
10
lgkhlx
16
sx
18
ervewlrkklqdvh-z(seq id no:135)；
[0348]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdgh-z(seq id no:22)；
[0349]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0350]
svseiqlmhnlgehlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:23)；
[0351]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlreklqdvh-z(seq id no:24)；或
[0352]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkelqdvh-z(seq id no:25)；
[0353]
其中
[0354]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地z是x
33
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地z是x
33
f、x
53
fx
35
或x
33
；
[0355]
x
10
和x
16
独立地是asp、gln或asn；
[0356]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0357]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0358]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0359]
x
18
是met、met(o)或nleu；
[0360]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0361]
x
31
是gly或val；
[0362]
x
33
和x
35
各自包括酰化或烷基化氨基酸；
[0363]
x
53
是gln、asp、glu或asn，任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中仅一个是aib；并且
[0364]
所述自切割二肽包括通式结构
[0365]
a-b-；
[0366]
其中
[0367]
a是酰化或烷基化氨基酸；
[0368]
b是n-烷基化氨基酸；
[0369]
其中，x
33
、x
35
和a中的每一个的所述酰化或烷基化氨基酸是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30碳链的氨基酸，任选地经由间隔基，并且所述自切割二肽与所述pth肽通过在b和所述pth肽的n-末端α胺之间形成酰胺键来连接。在一种实施方式中，选择a和b以提供在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t1/2)为至少约24小时至约96小时、或约48至约96小时、或约72至约120小时。
[0370]
在一种实施方式中，提供了包括pth肽/pthrp和自切割二肽的缀合物，其中，二肽经由酰胺键与所述pth/pthr肽共价结合，任选地在pth肽的n-末端α胺处，其中，pth/pthr肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0371]
srrlkravsehqllhdkgksiqdlrrrfflhhliaeihtaeiratsevspnskpspntknhpvrfgsddegryltqetnkvetykeqplktpgkkkkgkpgkrkeqekkkrrtrsawldsgvtgsglegdhlsdtsttsleldsrrh-x
33
(seq id no:39)；
[0372]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:5)；
[0373]
svseiqlmhnlx
12
khlx
56
x
17
mervewlrkklqdvh-z(seq id no:6)；和
[0374]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0375]
其中
[0376]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中z是x
33
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
；
[0377]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0378]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0379]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0380]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0381]
x
31
是gly或val；
[0382]
x
33
和x
35
各自包括酰化氨基酸，任选地，其中，x
33
和x
35
独立地选自具有以下通式结构的氨基酸
[0383][0384]
其中，n是选自1-4范围的整数以及r
50
是nh2、cooh或sh，任选地，其中，x
33
和x
35
的酰化氨基酸独立地选自赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸或高半胱氨酸，其中，所述酰化氨基酸的侧链与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地通过间隔基；以及
[0385]
x
53
是gln或asn，任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中仅一个是aib；并且
[0386]
所述自切割二肽包括通式结构
[0387]
a-b-；
[0388]
其中
[0389]
a是氨基酸或酰化氨基酸，任选地，其中，所述氨基酸选自半胱氨酸或赖氨酸，其中，所述半胱氨酸或赖氨酸的侧链任选地与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地经由将c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸与该氨基酸侧链连接的间隔基；
[0390]
b是n-烷基化氨基酸，任选地，其中，b是n-甲基甘氨酸或n-甲基丙氨酸；
[0391]
在一种实施方式中，x
33
、x
35
和a中的每一个的酰化氨基酸是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸的氨基酸，任选地经由间隔基，并且所述自切割二肽与所述pth肽通过在b和所述pth肽的n-末端α胺之间形成酰胺键来连接。任选地，a呈d-立体化学构型。在一种实施方式中，提供了包括pth肽和自切割二肽的缀合物，其中，二肽经由酰胺键与所述pth肽共价结合，任选地在pth肽的n-末端α胺处，其中
[0392]
pth肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：
[0393]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z(seq id no:5)；
[0394]
svseiqlmhnlx
12
khlx
56
x
17
mervewlrkklqdvh-z(seq id no:6)；
[0395]
svseiqlmhx
10
lgkhlx
16
sx
18
ervewlrkklqdvh-z(seq id no:135)；和
[0396]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0397]
其中
[0398]
z是x
33
、x
33
f、x
53
fx
35
，或；
[0399]
x
10
和x
16
独立地是asp、gln或asn；
[0400]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0401]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0402]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0403]
x
18
是met、met(o)或nleu；
[0404]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0405]
x
31
是gly或val；
[0406]
x
33
和x
35
各自包括酰化氨基酸，任选地，其中，x
33
和x
35
独立地选自半胱氨酸、高半胱氨酸、鸟氨酸或赖氨酸，其中，所述半胱氨酸、高半胱氨酸、鸟氨酸或赖氨酸的侧链与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地通过间隔基；
[0407]
x
53
是gln或asn，任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中仅一个是aib；并且
[0408]
所述自切割二肽包括通式结构
[0409]
a-b-；
[0410]
其中
[0411]
a是任选地选自半胱氨酸或赖氨酸的酰化氨基酸，其中，所述半胱氨酸或赖氨酸的侧链与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地通过间隔基；
[0412]
b是n-烷基化氨基酸，任选地，其中，b是n-甲基甘氨酸或n-甲基丙氨酸；
[0413]
其中，x
33
、x
35
和a中的每一个的所述酰化氨基酸是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸的氨基酸，任选地经由间隔基，并且所述自切割二肽与所述pth肽通过在b和所述pth肽的n-末端α胺之间形成酰胺键来连接。任选地，a呈d-立体化学构型。
[0414]
在一种实施方式中，提供了包括pth肽和自切割二肽的缀合物，其中，二肽经由酰胺键与所述pth肽共价结合，任选地在pth肽的n-末端α胺处，其中
[0415]
pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)的序列，或与seq id no:7具有1或2个氨基酸置换差异的肽，
[0416]
其中
[0417]
z是x
33
f、nfx
35
或x
33
；
[0418]
x
33
和x
35
各自独立地是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸的氨基酸，任选地经由间隔基，任选地，其中，x
33
和x
35
独立地选自半胱氨酸或赖氨酸，其中，所述半胱氨酸或赖氨酸的侧链与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地通过间隔基；并且
[0419]
x
53
是gln或asn，并且自切割二肽包括结构：
[0420][0421]
其中
[0422]
r1,包括选自由以下组成的组的侧链：c
1-c8烷基、(c
1-c4烷基)oh、(c
1-c4烷基)sh、
(c
1-c4烷基l)cooh和(c
1-c4烷基)nh2，以及任选地c16-c30碳链，其中，所述c16-c30碳链在存在时与所述侧链共价连接，任选地经由间隔基；
[0423]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0424]
r3是c
1-c6烷基或者r3和r4连同它们所附接的原子一起形成哌啶环；以及
[0425]
r5是nh2。
[0426]
在一种实施方式中，提供了包括pth肽和本文公开的任何自切割二肽的缀合物，其中，二肽经由酰胺键与所述pth肽共价结合，任选地在pth肽的n-末端α胺处，其中
[0427]
pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)的序列，或与seq id no:7具有1、2或3个氨基酸置换差异的肽，
[0428]
其中
[0429]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
、x
53
x
35
或x
53
fx
35
；
[0430]
x
33
和x
35
各自独立地是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30碳链的氨基酸，任选地经由间隔基，任选地，其中，x
33
和x
35
独立地选自半胱氨酸或赖氨酸，其中，所述半胱氨酸或赖氨酸的侧链与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地通过间隔基；并且
[0431]
x
53
是gln或asn。在一种实施方式中，自切割二肽包括结构：
[0432][0433]
其中
[0434]
r1,包括选自由(c
1-c4烷基)nh2组成的组的侧链，和任选地c16-c30碳链，其中所述c16-c30碳链，当存在时，与所述侧链共价连接，任选地经由间隔基；
[0435]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0436]
r3是c
1-c6烷基或者r3和r4连同它们所附接的原子一起形成哌啶环；以及
[0437]
r5是nh2。
[0438]
在一种实施方式中，提供了包括pth肽和自切割二肽的缀合物，其中，二肽经由酰胺键与所述pth肽共价结合，任选地在pth肽的n-末端α胺处，其中
[0439]
pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)的序列，或与seq id no:7具有1、2或3个氨基酸置换差异的肽，
[0440]
其中
[0441]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
、x
53
x
35
或x
53
fx
35
；
[0442]
x
33
和x
35
各自独立地是包括由(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3组成的组的侧链的氨基酸；
[0443]
x
53
是asn，以及自切割二肽包括结构：
[0444][0445]
其中
[0446]
r1,选自由以下组成的组：(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh和(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3；
[0447]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0448]
r3是c
1-c6烷基或者r3和r4连同它们所附接的原子一起形成哌啶环；以及
[0449]
r5是nh2，任选地，其中，第一个氨基酸呈d-立体化学构型。在另外的实施方式中，r2和r8两者均是h，以及r3和r4独立地是c
1-c4烷基。
[0450]
在一种实施方式中，提供了pth缀合物，其中，该缀合物包括pth肽和自切割二肽，其中，二肽经由在pth肽的n-末端α胺处的酰胺键与所述pth肽共价结合，其中，pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)的序列，其中
[0451]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fv、nx
35
或nfx
35
；
[0452]
x
33
和x
35
各自独立地是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c20碳链的氨基酸(任选地赖氨酸或鸟氨酸)，任选地经由间隔基，任选地，其中，x
33
和x
35
独立地是包括与赖氨酸侧链共价连接的c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸的赖氨酸酸，任选地，其中，x
33
和x
35
独立地是包括具有结构(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸；
[0453]
x
53
是gln或asn，以及自切割二肽包括结构：
[0454][0455]
其中
[0456]
r1,包括(c
1-c4烷基)nh2的侧链，和任选地c16-c20碳链，其中所述c16-c20碳链，当存在时，与所述侧链共价连接，任选地经由间隔基，任选地，其中，侧链用c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸酰化，任选经由间隔基；
[0457]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0458]
r3是c
1-c6烷基；以及
[0459]
r5是nh2，任选地，条件是当r1缺少所述c16-c20碳链时，式i的二肽的第一个氨基酸呈d-立体化学构型。
[0460]
在一种实施方式中，提供了pth缀合物，其中，该缀合物包括pth肽和自切割二肽，其中，二肽经由在pth肽的n-末端α胺处的酰胺键与所述pth肽共价结合，其中，pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)的序列，其中z是x
35
、nx
35
或nfx
35
；其中，x
35
是包括具有结构(c
1-c4氨基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh，任选地(c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸，并且所述二肽包括结构a-b，其中a是lys、ε酰化lys、ε酰化dlys或dlys，以及b是n-甲基甘氨酸(肌氨酸)，任选地，其中，a的酰化lys或酰化dlys包
括具有结构(c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh的侧链，其中所述间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸二聚体或γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数，以及q是选自1-4的整数，任选地，其中，k是2或4以及q是2，任选地，其中，间隔基是具有以下结构的γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
2-nh-coch2(och2ch2)
2-nh-γ谷氨酸：
[0461][0462]
在一种实施方式中，提供了pth缀合物，其中，该缀合物包括pth肽和自切割二肽，其中，二肽经由在pth肽的n-末端α胺处的酰胺键与所述pth肽共价结合，其中，pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)的序列，其中z是x
35
、nx
35
或nfx
35
；其中，x
35
是包括具有结构(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh，任选地(c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸，并且所述二肽包括结构a-b，其中，a是呈l或d立体化学构型的氨基酸并且包括(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh，任选地(c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh的侧链结构，以及b是n-甲基甘氨酸(肌氨酸)，其中，所述间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸二聚体或γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数以及q是选自1-4范围的整数，任选地，其中，k是2或4以及q是2，任选地，其中，间隔基是γ谷氨酸酸-[coch2(och2ch2)2nh]
2-γ谷氨酸。
[0463]
根据本文公开的任何缀合物实施方式，缀合物的间隔基当存在时包括氨基酸或二肽。在一种实施方式中，间隔基的氨基酸是γ谷氨酸。在一种实施方式中，间隔基包括由聚乙二醇聚合物隔开的两个氨基酸。根据本文公开的任何缀合物实施方式，间隔基可以包括以下结构：γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数以及q是选自1-4范围的整数。在一种实施方式中，k是2或4以及q是1或2。在一种实施方式中，k是2以及q是2或4。在一种实施方式中，k是2以及q是2。在一种实施方式中，k是2以及q是4。在一种实施方式中，k是2以及q是8。在一种实施方式中，k是2或4以及q是1。在一种实施方式中，k是2以及q是1。在一种实施方式中，k是4以及q是1。在一种实施方式中，k是8以及q是1。在一种实施方式中，k是1以及q是选自2至8或2至4的整数。在一种实施方式中，k是2以及q是选自2至8或2至4的整数。在一种实施方式中，k是2以及q是1。
[0464]
在一种实施方式中，缀合物的pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
(seq id no:2)或svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq idno:26)的序列，
[0465]
其中，x
33
和x
35
各自独立地是包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30碳链的氨基
酸，任选地经由间隔基，任选地，其中，x
33
和x
35
各自独立地是包括用c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸酰化的侧链的氨基酸，任选地经由间隔基，以及自切割二肽包括结构：
[0466][0467]
其中
[0468]
r1是(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]co(ch2)
14-20
ch3；
[0469]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0470]
r3是c
1-c6烷基；以及
[0471]
r5是nh2，任选地，其中，r2和r8两者均是h，以及r4是h或ch3。
[0472]
在一种实施方式中，pth缀合物包括与pth肽的n-末端α胺共价连接的自切割二肽，其中，pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
(seq id no:2)或svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq idno:26)的序列，
[0473]
其中
[0474]
x
33
和x
35
各自是包括具有选自由以下组成的组的结构的侧链的氨基酸：(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3，其中，间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸二聚体或γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数，以及q是选自1-4范围的整数，任选地，其中，k是2以及q是2；
[0475]
并且自切割二肽包括结构：
[0476][0477]
其中
[0478]
r1是选自由以下组成的组的结构：(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3，其中，间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸二聚体或γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8或2-4范围的整数，以及q是选自1-4范围的整数；
[0479]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0480]
r3是c
1-c6烷基；以及
[0481]
r5是nh2，任选地，其中，r2和r8两者均是h，以及r4是h或ch3。
[0482]
在一种实施方式中，pth缀合物包括与pth肽的n-末端α胺共价连接的自切割二肽，其中，pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
(seq id no:2)的序列
[0483]
其中
[0484]
x
33
是包括具有选自由(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)
nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3组成的组的结构的侧链的氨基酸，其中，间隔基是γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸，其中，k是选自2-4范围的整数以及q是1或2，任选地，其中，k和q两者均是2；
[0485]
并且自切割二肽包括结构：
[0486][0487]
其中
[0488]
r1是选自由(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3组成的组的结构，其中，间隔基是γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸，其中，k是选自2-4范围的整数以及q是1或2，任选地，其中，k和q两者均是2；
[0489]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0490]
r3是c
1-c6烷基；以及
[0491]
r5是nh2，任选地，其中，r2和r8两者均是h，r3是c
1-c3烷基。以及r4是h或ch3。
[0492]
在一种实施方式中，提供了缀合物，包括pth肽和经由酰胺键与pth肽的n-末端α胺共价结合的自切割二肽，其中，pth肽包括氨基酸序列
[0493]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z
[0494]
其中
[0495]
z是x
33
f、x
53
fx
35
或x
33
；
[0496]
x
33
和x
35
各自独立地包括半胱氨酸、高半胱氨酸、鸟氨酸、d-赖氨酸或赖氨酸，其中，半胱氨酸、高半胱氨酸、鸟氨酸、d-赖氨酸或赖氨酸残基的侧链用c14-c30碳链酰化或烷基化；
[0497]
x
53
是gln或asn；并且
[0498]
所述自切割二肽包括通式结构：
[0499][0500]
其中
[0501]
r1,是包括选自由(c
1-c4烷基)sh或(c
1-c4烷基)nh2组成的组的侧链以及与所述侧链共价连接的c16-c30碳链的聚合物链；
[0502]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0503]
r3是c
1-c6烷基；以及
[0504]
r5是nh2，任选地，其中，r1,是(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh；r2和r8各自是h；r4是h；r3是ch3以及r5是nh2。
[0505]
根据一种实施方式，提供了缀合物，其中，该缀合物包括pth肽和自切割二肽，其中，二肽经由酰胺键与所述pth肽的n-末端α胺共价连接，另外其中
[0506]
该pth肽包括氨基酸序列
[0507]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
或svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
，其中
[0508]
x
33
和x
35
各自是包括(c
1-c4烷基)nh-γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸-co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸；并且
[0509]
所述自切割二肽包括通式结构：
[0510][0511]
其中
[0512]
r1,是(c
1-c4烷基)nh-γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸-co(ch2)
14-20
cooh；
[0513]
r2和r8各自是h；
[0514]
r4是h或ch3；
[0515]
r3是c
1-c3烷基；
[0516]
r5是nh2；
[0517]
k是选自1、2、3、4、5、6、7或8的整数；以及
[0518]
q是选自1、2、3、4、5和6的整数，任选地，其中，r4是h以及k是2或4以及q是1或2，任选地，其中，k是2以及q是2。
[0519]
根据一种实施方式，提供了包括pth肽和自切割二肽的缀合物，其中，二肽经由酰胺键与所述pth肽的n-末端α胺共价连接，其中，pth肽包括氨基酸序列
[0520]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
，其中
[0521]
x
35
是包括(c
1-c4烷基)nh-γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸-co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸；并且
[0522]
所述自切割二肽包括通式结构：
[0523][0524]
其中
[0525]
r1,是(c4烷基)nh-γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸-co(ch2)
14-20
cooh；
[0526]
r2、r4和r8各自是h；
[0527]
r3是ch3；
[0528]
r5是nh2；
[0529]
k是选自1-4范围的整数；和
[0530]
q是选自1-4范围的整数，任选地，其中，k是1或2以及q是1、2或4，任选地，其中，k和q两者均是2。
[0531]
根据一种实施方式，提供了包括pth肽和自切割二肽的缀合物，其中，二肽经由酰胺键与所述pth肽的n-末端α胺共价连接，其中，pth肽包括氨基酸序列
[0532]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
，其中
[0533]
x
33
是包括(c
1-c4烷基)nh-γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸-co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸；并且
[0534]
所述自切割二肽包括通式结构：
[0535][0536]
其中
[0537]
r1,是(c4烷基)nh-γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸-co(ch2)
14-20
cooh；
[0538]
r2、r4和r8各自是h；
[0539]
r3是ch3；以及
[0540]
r5是nh2，
[0541]
k是选自1-4范围的整数；以及
[0542]
q是选自1-4范围的整数，任选地，其中，k是1或2以及q是1、2或4，任选地，其中，k和q两者均是2。
[0543]
根据一种实施方式，本发明提供了选自包括以下组的pth肽：seq id no:77、78、79、84、87、95、102、108、110、127或128。在一些实施方式中，pth肽选自由seq id no:87、95、108、127或128组成的组。在一些实施方式中，本发明的pth肽选自77或87。在一种实施方式中，pth肽是seq id no:77。在另一实施方式中，pth肽是seq id no:87。在一种实施方式中，本发明涵盖表2中列出的pth肽。在另一实施方式中，本发明涵盖来自表2的pth肽，具有对序列中的一个赖氨酸进行鸟氨酸置换。在另一实施方式中，本文提供了来自表2的pth肽，具有对多于一个鸟氨酸置换多于一个赖氨酸。
[0544]
根据一些实施方式，本发明提供了pth肽前药，当向有此需要的患者施用时，该pth肽前药在一周之后提供一半或更少的活性药物至前药。根据一些实施方式，本发明提供了pth肽前药，当向有此需要的患者施用时，该pth肽前药在一周之后提供三分之一或更少的活性药物至前药。根据一些实施方式，本发明提供了pth肽前药，当向有此需要的患者施用时，该pth肽前药在一周之后提供四分之一或更少的活性药物至前药。
[0545]
本公开还涵盖其他缀合物，其中，本公开的pth缀合物任选地经由共价键和任选地经由接头与额外的缀合物部分连接。连接可以通过共价化学键、物理力(如静电)、氢、离子、范德瓦尔斯或者疏水或亲水相互作用来实现。可以使用多种非共价偶联体系，包括生物素-抗生物素蛋白、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞粘附分子配偶体；或彼此具有亲和力的任何结合配偶体或其片段。
[0546]
所公开的pth肽缀合物被认为适用于先前已针对其相应的母体pth描述的任何用途。因此，可以将pth缀合物向患者施用以治疗与pth水平不足(甲状旁腺功能减退症)相关的任何疾病或病症，或对pth疗法有反应的疾病，诸如骨质疏松症。根据一种实施方式，提供
了治疗甲状旁腺功能减退症的方法，其中，以有效治疗或预防甲状旁腺功能减退症或减轻与甲状旁腺功能减退症相关的医学病状的量向需要这种疗法的患者施用根据本文所述的那些组合物或缀合物。在一种实施方式中，施用途径是肠胃外，包括皮下。在另一实施方式中，施用途径是口服。在另一种实施方式中，施用途径是肺部。在某些实施方式中，本发明的pth肽作为气溶胶、雾或粉末制剂被吸入。本文所述的吸入药物组合物可以使用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体，以气溶胶喷雾剂呈现的形式从加压包装或雾化器中递送。此类方法包括美国专利号6,468,798中描述的那些方法，其全部内容通过援引并入本文。在某些实施方式中，pth肽的剂量单位通过提供阀以递送计量的量来确定。
[0547]
在本公开的某些实施方式中，描述了治疗骨质疏松症的方法。该方法包括向有此需要的患者施用本公开的任何pth缀合物，任选地，其中，pth缀合物与短效pth激动剂(例如，seq id no；7的pth肽，或任何seq id no:31-37)联合施用。在一种实施方式中，向患者施用的组合物包括本公开的pth缀合物和选自由以下组成的组的第二组分：特立帕肽(teriparatide,)、seq id no:7、31、32、33、34、35、36、37和降钙素。在一种实施方式中，治疗骨质疏松症或骨质减少的方法包括通过每日皮下注射或每日口服施用来向有此需要的受试者施用包括本公开的pth缀合物的组合物。
[0548]
在一些实施方式中，需要治疗的受试者患有骨质疏松症。在一些实施方式中，需要治疗的受试者患有骨质减少。在某些实施方式中，需要治疗的受试者是绝经后女性。在一些实施方式中，需要治疗的受试者患有糖皮质激素诱导的骨质疏松症。在某些实施方式中，需要治疗的受试者患有糖皮质激素诱导的骨质减少。在另一实施方式中，提供了治疗骨质疏松症的方法，该方法包括通过每日皮下注射本公开的pth缀合物来治疗有此需要的受试者。在另一实施方式中，提供了治疗骨质疏松症的方法，该方法包括通过每隔一天皮下注射本公开的pth缀合物来治疗有从需要的受试者。在另一实施方式中，本公开提供了治疗骨质疏松症的方法，该方法包括通过每周或每月皮下注射本公开的pth缀合物来治疗有此需要的受试者。
[0549]
可以使用本领域技术人员已知的标准药学上可接受的载体和施用途径来配制包含本文公开的缀合物的药物组合物并向患者施用。因此，本公开还涵盖药物组合物，该药物组合物包括本文公开的缀合物的一种或多种，或其药学上可接受的盐，联合药学上可接受的载体。
[0550]
根据一种实施方式，提供了药物组合物，该药物组合物包括本文公开的新型二肽/pth肽复合物的任何一种，优选地无菌且优选地纯度水平为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。此类组合物可以包含如本文所公开的二肽/pth肽缀合物，其中，所得活性剂以至少0.1-10mg/ml或更高的浓度存在。在一种实施方式中，药物组合物包括经消毒并任选地储存在各种容器中的水性溶液。根据一种实施方式，本文公开的化合物可以用于制备准备用于注射的预配制溶液。在其他实施方式中，药物组合物包括冻干粉末。药物组合物可以另外包装为试剂盒的一部分，该试剂盒包括用于向患者施用组合物的一次性装置。可以将容器或试剂盒进行标记在环境室温或在冷藏温度下储存。
[0551]
根据一种实施方式，提供了药物组合物，其中，选择所公开的pth缀合物的前药形
式以在患者的血液/血清/血浆中提供优化水平的活性pth。在一些实施方式中，在向有此需要的患者第一次施用本公开的pth缀合物肽中的一种的前药形式之后，前药的血浆浓度保持高于释放药物的浓度至少48-96小时。在某些实施方式中，在用本公开的pth缀合物肽中的一种的前药形式初始给药之后，前药的血浆浓度高于活性药物的血浆浓度至少120小时。在某些实施方式中，将本公开的肽向有此需要的患者施用，并且活性肽的血浆浓度在初始给药之后48-120小时达到峰值。在一些实施方式中，将本公开的pth缀合物肽中的一种的前药形式向有此需要的患者施用，并且在施用之后一周活性肽的血浆浓度保持大于其cmax的75％。在一些实施方式中，将本公开的pth缀合物肽中的一种的前药形式向有此需要的患者施用，并且所得活性肽的血浆浓度在施用之后十天保持大于其cmax的50％。在一些实施方式中，将本公开的pth缀合物肽中的一种的前药形式向有此需要的患者施用，并且所得活性肽的血浆浓度在施用之后两周保持大于其cmax的25％。
[0552]
本公开的pth缀合物可以使用任何已知的标准途径单独或与其他合适的组分联合向患者施用。
[0553]
适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质，以及可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌混悬剂。术语“肠胃外”意指不通过消化管，而是通过一些其他途径诸如皮下、肌内、脊柱内或静脉内。本公开的类似物可以与以下项一起施用：在药物载体中的生理学上可接受的稀释剂，诸如无菌液体或液体混合物，包括水、盐水、水性右旋糖和相关的糖溶液、醇(诸如乙醇或十六烷醇)、二醇(例如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮(诸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(诸如皂或清洁剂)、助悬剂(诸如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其他药物佐剂。
[0554]
本公开的化合物的施用可以与更短效的pth或pth类似物联合进行。本公开的肽可以与具有相对短的生物半衰期的pth化合物序贯或共同施用来向有此需要的患者施用。
[0555]
在其他实施方式中，本公开的化合物可以单独施用或与其他药剂联合施用，其他药剂例如骨抗吸收剂，包括降钙素、双膦酸盐、serm(例如雷洛昔芬(raloxifene))、激素替代疗法(hrt)、钙、维生素d1、维生素d2、维生素d3、维生素d4和雌激素。本公开的化合物可以与另一药剂共同施用。替代地，本公开的化合物可以与另一种药剂序贯施用；例如，本公开的化合物单独施用一周至一年的时间段，随后施用另一种药剂，或连同所述化合物一起或在没有所述化合物的情况下施用。
[0556]
根据一种实施方式，提供了药物组合物，该药物组合物包括本公开的pth缀合物和一种或多种骨抗吸收剂，包括降钙素、双膦酸盐、serm(例如雷洛昔芬(raloxifene))、激素替代疗法(hrt)、钙、维生素d1、维生素d2、维生素d3、维生素d4和雌激素。在一种实施方式中，向患者施用此类组合物以治疗骨质减少或骨质疏松症，任选地，其中，药物组合物被配制用于口服施用。
[0557]
适用于口服施用的制剂可以由以下组成：(a)液体溶液，诸如溶解于稀释剂(诸如水、盐水或橙汁)中的有效量的本公开的类似物；(b)胶囊、小袋、片剂、锭剂和糖锭剂，其各自包含预定量的活性成分，呈固体或颗粒剂；(c)粉末；(d)在适当液体中的混悬剂；和合适
的乳剂。根据一种实施方式，适用于口服施用的制剂包括本公开的pth缀合物和吸收促进剂，诸如n-[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠(snac)。n-[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基]辛酸钠(snac)是递送剂，其已报告可增强多种分子(包括蛋白质，诸如胰岛素、降钙素和其他大分子诸如肝素)的渗透性。根据一种实施方式，提供用于口服递送的药物组合物，其中，该组合物包括本公开的pth缀合物和snac，最佳地其中，该药物组合物被配制成片剂。
[0558]
本文所述的所有治疗方法、药物组合物、试剂盒和其他类似实施方式设想了二肽/pth肽复合物包括其所有药学上可接受的盐。
[0559]
在一种实施方式中，试剂盒提供了用于向患者施用二肽/pth肽复合物组合物的装置。该试剂盒可以进一步包括多种容器，例如小瓶、管、瓶等。优选地，该试剂盒还将包括使用说明书。根据一种实施方式，试剂盒的装置是气溶胶分配装置，其中，组合物被预先包装在气溶胶装置内。在另一实施方式中，试剂盒包括注射器和针头，并且在一种实施方式中，前药组合物使用低规格针头例如具有29-31尺寸的低规格针头来预先包装在注射器或注射笔内。
[0560]
根据一种实施方式，提供了修饰的pth肽，其包括seq id no:31、32或33的序列或者与seq id no:31、32或33具有在选自第13、16、19、22、26和33位的一个或两个位置处的赖氨酸置换差异的序列，其中，所述修饰的pth肽在选自13、16、19、22、26和33的一个或两个位置处包括酰化氨基酸，任选地，其中，酰化氨基酸具有与氨基酸侧链共价连接的c16-c20脂肪酸或c16-c20二酸，任选地经由间隔基，并且pth肽进一步包括经由酰胺键与pth肽的n-末端共价连接的二肽a-b，其中，a是氨基酸(例如，赖氨酸、鸟氨酸、半胱氨酸或高半胱氨酸)，任选地呈d-立体化学构型的氨基酸，和任选地是酰化氨基酸；以及b是n-烷基化氨基酸，任选地n-甲基甘氨酸或n-甲基丙氨酸。。
[0561]
根据实施方式1，提供了包括pth肽和经由酰胺键与所述pth肽共价结合的自切割二肽的缀合物，任选地，其中，自切割二肽经由酰胺键与pth肽的n-末端α胺连接，其中
[0562]
所述pth肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列
[0563]
svseiqlmhx
10
lgx
13
hlx
16
sx
18
ervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z，(seq id no:133)；
[0564]
svseiqlmhx
10
lx
12
khlx
56
x
17
x
18
ervewlrkklqdvh-z；(seq id no:134)；
[0565]
svseiqlmhx
10
lgkhlx
16
sx
18
ervewlrkklqdvh-z(seq id no:135)和
[0566]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0567]
其中
[0568]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
；
[0569]
x
10
和x
16
独立地是asp、gln或asn；
[0570]
x
12
是gly或aib；
[0571]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0572]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0573]
x
18
是met、met(o)、leu或nleu；
[0574]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0575]
x
31
是gly或val；
[0576]
x
33
和x
35
各自包括酰化氨基酸，该酰化氨基酸包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，任选地经由间隔基，任选地，其中，该酰化氨基酸选自由lys、dlys、鸟氨酸、cys和高半胱氨酸组成的组；
[0577]
x
53
是gln或asn，任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中不超过一个是aib，并且任选地，其中，c端氨基酸经修饰以用酰胺替换羧基末端；和
[0578]
所述自切割二肽包括结构a-b，其中
[0579]
a是氨基酸，任选地，酰化氨基酸包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，任选地经由间隔基；以及
[0580]
b是n-烷基化氨基酸。
[0581]
根据实施方式2，提供了实施方式1的缀合物，其中,a选自由以下组成的组：lys、dlys、ε-酰化-lys、ε-酰化-dlys、鸟氨酸、ε-酰化鸟氨酸、半胱氨酸、s-酰化半胱氨酸、高半胱氨酸和s-酰化高半胱氨酸，任选地，其中,a选自由lys、dlys、酰化-lys和酰化-dlys组成的组。在另一实施方式中，提供了实施方式1的缀合物，其中，a是dlys。在另一实施方式中，提供了实施方式1的缀合物，其中，a是ε-酰化-dlys。在另一实施方式中，提供了实施方式1的缀合物，其中，a选自l-lys或ε-酰化l-lys。
[0582]
根据实施方式3，提供了实施方式1或2的缀合物，其中，z是lys；x
10
和x
16
是asn；x
13
、x
26
和x
27
是lys；x
17
是ser；x
18
是met；x
31
是val；x
33
是lys；a是dlys；其中，侧链经由γglu-coch2(och2ch2)2nh-γglu间隔基用coc
16h32
co2h酰化；以及b是正甲基甘氨酸。
[0583]
根据实施方式4，提供了包括pth肽和经由酰胺键与所述pth肽共价结合的自切割二肽的缀合物，任选地，在pth蛋白的n-末端α胺处，其中，所述pth肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列
[0584]
i)
[0585]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z,(seq id no:5)；
[0586]
svseiqlmhnlx
12
khlx
56
x
17
mervewlrkklqdvh-z；(seq id no:6)；和
[0587]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)；
[0588]
其中
[0589]
z是x
33
、x
33
f、x
33
fx
35
、x
33
fvx
35
、x
33
fvax
35
、x
33
fvalx
35
、x
33
fvalgx
35
、x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
，任选地，其中，z是x
33
x
53
x
35
、x
53
fx
35
、x
53
fvx
35
、x
53
fvax
35
、x
53
fvalx
35
或x
53
fvalgx
35
；
[0590]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0591]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0592]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0593]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；任选地，其中，x
13
、x
26
和x
27
独立地选自glu和lys；
[0594]
x
31
是gly或val；
[0595]
x
33
和x
35
各自包括酰化氨基酸，该酰化氨基酸包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，任选地经由间隔基；
[0596]
x
53
是gln或asn，任选地，条件是x
12
、x
16
和x
17
中仅一个是aib，并且任选地，其中，c-末端氨基酸经修饰以用酰胺替换羧基末端；或
[0597]
ii)
[0598]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
35
(seq id no:2)；
[0599]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq id no:12)；
[0600]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhqfx
35
(seq id no:14)；
[0601]
svseiqlmhnlx
12
x
13
hlx
16
x
17
mervewlrx
26
x
27
lqdx
31
hn(seq id no:103)；
[0602]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
hn(seq id no:104)；
[0603]
svseiqlmhnlx
12
khlx
16
x
17
mervewlrkklqdvhn(seq id no:105)；
[0604]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhn(seq id no:106)；
[0605]
其中
[0606]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0607]
x
16
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0608]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0609]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0610]
x
31
是gly或val；和
[0611]
x
35
是酰化氨基酸，该酰化氨基酸包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，任选地经由间隔基
[0612]
其中，seq id no:2、12、14、103、104、105、106或107的pth肽经修饰在seq id no:103、104、105、106或107的肽的第13、16、19、22、26、33位或在c-末端氨基酸处的任一位置处用经c14-c20脂肪酸或c14-c20二酸酰化的赖氨酸置换，任选地经由间隔基；和
[0613]
所述自切割二肽包括结构a-b，其中
[0614]
a是氨基酸，任选地呈d-立体化学构型的氨基酸，并且任选地，其中，“a”氨基酸的侧链经c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸酰化，任选地经由间隔基；以及
[0615]
b是n-烷基化氨基酸，任选地n-(c
1-c4)烷基化甘氨酸、n-甲基甘氨酸或n-甲基丙氨酸；任选地，条件是式i的二肽的x
33
、x
35
处的酰化氨基酸和“a”氨基酸相同或不同，任选地，其中式i的二肽的x
33
、x
35
处的氨基酸和“a”氨基酸两者均是赖氨酸，但在间隔基、立体化学或附接至赖氨酸侧链的酰化基团方面不同，任选地，其中“a”是ε-酰化的dlys，以及x
33
和x
35
各自是ε-酰化的lys，任选地，其中酰化基团是经由间隔基任选地连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸。
[0616]
根据实施方式5，提供了实施方式1-2或4中任一项的缀合物，其中，该缀合物的酰化氨基酸的每一个包括经由间隔基连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，其中，该间隔基包括独立地选自由γ谷氨酸和coch2(och2ch2)knh组成的组的一个或多个接头部分，其中，k是选自1-8范围的整数，任选的条件是当a是非酰化氨基酸时，则a是呈d-立体化学构型的氨基酸。
[0617]
根据实施方式6，提供了实施方式1的缀合物，其中，a选自由以下组成的组：lys、dlys、酰化-lys、酰化-dlys、鸟氨酸、酰化鸟氨酸、半胱氨酸、酰化半胱氨酸、高半胱氨酸和酰化高半胱氨酸，任选地，其中a选自由lys、dlys、酰化-lys和酰化-dlys组成的组。
[0618]
根据实施方式7，提供了实施方式1-6中任一项的缀合物，其中，z是x
33
、x
53
x
35
或x
53
fx
35
；
[0619]
根据实施方式8，提供了包括pth肽和经由酰胺键与所述pth肽共价结合的自切割
二肽的缀合物，任选地在pth蛋白的n-末端α胺处，其中，
[0620]
所述pth肽包括选自由以下组成的组的氨基酸序列
[0621]
svseiqlmhnlgx
13
hlnsmervewlrx
26
x
27
lqdx
31
h-z,(seq id no:5)；
[0622]
svseiqlmhnlx
12
khlx
56
x
17
mervewlrkklqdvh-z；(seq id no:6)；
[0623]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)，和与seq id no:7的肽具有1、2或3个氨基酸置换差异的肽；
[0624]
其中
[0625]
z是x
33
f、x
53
x
35
、x
53
fx
35
或x
33
；
[0626]
x
12
是氨基异丁酸(aib)或gly；
[0627]
x
56
是氨基异丁酸(aib)或asn；
[0628]
x
17
是氨基异丁酸(aib)或ser；
[0629]
x
13
、x
26
和x
27
独立地选自由arg、glu、asp和lys组成的组；
[0630]
x
31
是gly或val；
[0631]
x
33
和x
35
各自包括酰化氨基酸；
[0632]
x
53
是gln或asn；并且
[0633]
所述自切割二肽包括通式结构
[0634]
a-b-；
[0635]
其中
[0636]
a是氨基酸或酰化氨基酸，任选地，其中氨基酸或酰化氨基酸呈d-立体化学构型；
[0637]
b是n-烷基化氨基酸；
[0638]
其中，x
33
、x
35
和a中的每一个的所述酰化氨基酸独立地选自包括与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸的氨基酸，任选地经由间隔基，并且所述自切割二肽通过在b和所述pth肽的n-末端α胺之间或在第13、16、19、22、26和33位中的任一个位置处形成酰胺键来与所述pth肽连接，其中，x
33
、x
35
和a的酰化氨基酸的所述任选间隔基独立地选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自1-8范围的整数以及q是选自1-4范围的整数；以及
[0639]
条件是当a是非酰化氨基酸时，则a是呈d-立体化学构型的氨基酸。
[0640]
根据实施方式9，提供了实施方式8的缀合物，其中，所述pth肽包括序列svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvh-z(seq id no:7)，
[0641]
其中
[0642]
z是x
33
f、x
53
x
35
、x
53
fx
35
或x
33
；
[0643]
x
33
和x
35
各自独立地是包括与氨基酸的酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸的氨基酸，任选地经由间隔基；和
[0644]
x
53
是asn，任选的条件是式i的二肽的x
33
、x
35
处的酰化氨基酸和“a”氨基酸相同或不同，任选地，其中，式i的二肽的x
33
、x
35
处的氨基酸和“a”氨基酸各自是赖氨酸，但在附接至赖氨酸侧链的间隔基或酰化基团上不同，任选地，其中，式i的二肽的x
33
、x
35
处的酰化氨基酸和“a”氨基酸相同。
[0645]
根据实施方式10，提供了实施方式4-9中任一项的缀合物，其中，所述pth肽包括svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
(seq id no:16)或svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkk
lqdvhnfx
35
(seq id no:12)的序列
[0646]
其中，x
33
和x
35
各自独立地是包括与氨基酸的酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸的氨基酸，任选地经由间隔基。
[0647]
根据实施方式11，提供了实施方式1-10中任一项的缀合物，其中，a、x
33
和x
35
的酰化氨基酸独立地选自半胱氨酸、高半胱氨酸、鸟氨酸和赖氨酸，其中，所述半胱氨酸、高半胱氨酸、鸟氨酸或赖氨酸的侧链与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地通过包括γ谷氨酸连接基(linkage)的间隔基。
[0648]
根据实施方式12，提供了实施方式1-11中任一项的缀合物，其中，a、x
33
和x
35
的酰化氨基酸各自是赖氨酸或d-赖氨酸，其中，所述赖氨酸或d-赖氨酸的侧链与c16-c22脂肪酸或c16-c22二酸共价连接，任选地通过包括γ谷氨酸连接基的间隔基。
[0649]
根据实施方式13，提供了实施方式1-12中任一项的缀合物，其中，a选自由lys、dlys、ε-酰化-lys和ε-酰化-dlys组成的组，其中，所述自切割二肽经由b氨基酸的羧基末端与pth肽的n-末端α胺共价连接。
[0650]
根据实施方式14，提供了实施方式1-13中任一项的缀合物，其中，x
33
、x
35
和a中的每一个的所述酰化氨基酸包括经由间隔基与氨基酸侧链共价连接的c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸，其中，x
33
、x
35
和a中的每一个的间隔基独立地选自γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽、(xaa)-[coch2(och2ch2)knh]
q-γ谷氨酸、γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)knh]
q-γ谷氨酸，其中
[0651]
xaa选自arg、tyr(opo3h2)和hcys(so3h)；
[0652]
k是选自1-8范围的整数；以及
[0653]
q是选自1-8范围的整数，任选地，其中，k是2以及q选自1-4范围}，任选地，其中，间隔基是-{γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-。
[0654]
根据实施方式15，提供了实施方式1-14中任一项的缀合物，其中，所述间隔基包括结构：γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸，其中
[0655]
k是选自1-8范围的整数；以及
[0656]
q是选自1-8范围的整数，任选地，其中k是2、4、6或8以及q是1，任选地，其中k是2或4以及q是2或4，任选地，其中k是2或4以及q是1，任选地，其中k是2以及q选自1-8范围，任选地，其中k是2以及q是2。
[0657]
根据实施方式16，提供了实施方式1-15中任一项的缀合物，其中，a-b包括结构：
[0658][0659]
其中
[0660]
r1,包括选自由以下组成的组的侧链：c
1-c8烷基、(c
1-c4烷基)oh、(c
1-c4烷基)sh、(c
1-c4烷基)cooh和(c
1-c4烷基)nh2，任选地，其中c16-c30脂肪酸或c16-c30二酸与所述侧链共价连接，任选地经由所述间隔基；
[0661]
r2、r4和r8独立地是h或c
1-c4烷基；
[0662]
r3是c
1-c6烷基；以及
[0663]
r5是nh2，其中，所述间隔基包括氨基酸或二肽。
[0664]
根据实施方式17，提供了实施方式1-16中任一项的缀合物，其中所述间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中k是选自2-4范围的整数以及q是1或2，任选地，其中间隔基是-{γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-。
[0665]
根据实施方式18，提供了实施方式1-17中任一项的缀合物，其中，在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t
1/2
)为至少约48至168小时。
[0666]
根据实施方式19，提供了实施方式1-17中任一项的缀合物，其中，在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t
1/2
)为至少约70至140小时。
[0667]
根据实施方式20，提供了实施方式1-17中任一项的缀合物，其中，在生理条件下在标准pbs溶液中a-b从所述pth肽的化学切割半衰期(t
1/2
)为至少约90至120小时。
[0668]
根据实施方式21，提供了实施方式16的缀合物，其中
[0669]
r1,是(c
1-c4烷基)nh；
[0670]
r2和r8各自是h；
[0671]
r4是h或ch3；
[0672]
r3是ch3以及
[0673]
r5是nh2。
[0674]
根据实施方式22，提供了实施方式16的缀合物，其中
[0675]
r1,是(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh或(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3；
[0676]
r2和r8各自是h；
[0677]
r4是h或ch3；
[0678]
r3是ch3以及
[0679]
r5是nh2，其中，所述[间隔基]是选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)knh]
q-γ谷氨酸组成的组的连接部分，其中，k是选自2-4范围的整数以及q是选自1-8范围的整数。
[0680]
根据实施方式23，提供了实施方式22的缀合物，其中，r1,是(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh，其中k是2或4以及q是1、2或4，任选地，其中k和q两者均是2。
[0681]
根据实施方式24，提供了实施方式22的缀合物，其中
[0682]
r1,是(c4烷基)nh-[γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸]-co(ch2)
14-20
cooh，其中k是2-4以及q是1或2。
[0683]
根据实施方式25，提供了实施方式1-24中任一项的缀合物，其中，可切割二肽的第一个氨基酸是呈d-立体化学构型的氨基酸。
[0684]
根据实施方式26，提供了包括pth肽和经由酰胺键与所述pth肽的n-末端α胺共价连接的自切割二肽的缀合物，其中
[0685]
所述pth肽包括以下氨基酸序列
[0686]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
(seq idno:16)、svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq id no:12)，或者与seq id no:16或seq id no:12的肽具有1或2个氨基酸置换差异的肽，其中
[0687]
x
33
和x
35
各自是包括(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3的侧链的氨基酸；并且
[0688]
所述自切割二肽包括通式结构：
[0689][0690]
其中
[0691]
r1,是(c
1-c4烷基)nh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
cooh、(c
1-c4烷基)nh-co(ch2)
14-20
ch3或(c
1-c4烷基)nh-[间隔基]-co(ch2)
14-20
ch3；
[0692]
r2和r8各自是h；
[0693]
r4是h或ch3；
[0694]
r3是c
1-c3烷基以及
[0695]
r5是nh2，其中，所述间隔基选自由γ谷氨酸、γ谷氨酸-γ谷氨酸二肽和γ谷氨酸a-d
‑‑
[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸组成的组，其中，k是选自2-4范围的整数以及q是1或2，任选地，其中c-末端氨基酸经修饰以用酰胺替换羧基末端。
[0696]
根据实施方式27，权利要求26的缀合物，其中，所述pth肽包括氨基酸序列
[0697]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhnfx
35
(seq id no:12)，其中
[0698]
x
35
是包括(c
1-c4烷基)nh-[γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸]-co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸，任选地，其中x
35
是包括(c4烷基)nh-{γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸；并且
[0699]
所述自切割二肽包括通式结构：
[0700][0701]
其中
[0702]
r1,是(c
1-c4烷基)nh-[γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸]-co(ch2)
14-20
cooh；
[0703]
r2、r4和r8各自是h；
[0704]
r3是ch3；
[0705]
r5是nh2；
[0706]
q是2或4以及
[0707]
k是2，任选地，其中q是2，任选地，其中r1是(c4烷基)nh-{γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-co(ch2)
14-20
cooh，任选的条件是式i的二肽的x
35
处的酰化氨基酸和“a”氨基酸是，任选地，其中式i的二肽的x
35
处的氨基酸和“a”氨基
酸两者均是赖氨酸，但在间隔基、立体化学或附接至赖氨酸侧链的酰化基团不同，任选地，其中a是ε-酰化的dlys以及x
35
是ε-酰化的lys，任选地，其中c-末端氨基酸经修饰以用酰胺替换羧基末端。
[0708]
根据实施方式28，提供了实施方式26的缀合物，其中，所述pth肽包括氨基酸序列
[0709]
svseiqlmhnlgkhlnsmervewlrkklqdvhx
33
(seq id no:16)，其中
[0710]
x
33
是包括(c
1-c4烷基)nh-[γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸]-co(ch2)
14-20
cooh的侧链的氨基酸，任选地，包括(c4烷基)nh-{γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-co(ch2)
16-18
cooh的侧链的氨基酸；并且
[0711]
所述自切割二肽包括通式结构：
[0712][0713]
其中
[0714]
r1,是(c
1-c4烷基)nh-[γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)
k-nh]
q-γ谷氨酸]-co(ch2)
14-20
cooh，任选地(c4烷基)nh-{γ谷氨酸酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-co(ch2)
16-18
cooh；
[0715]
r2、r4和r8各自是h；
[0716]
r3是ch3；
[0717]
r5是nh2；
[0718]
q是2以及
[0719]
k是2或4。
[0720]
根据实施方式29，提供了实施方式1-28中任一项的缀合物，其中，自切割二肽的第一个氨基酸呈d-立体化学构型，并且任选地，当所述间隔基存在时，所述间隔基是-{γ谷氨酸-[coch2(och2ch2)2nh-coch2(och2ch2)2]nh-γ谷氨酸}-。
[0721]
根据实施方式30，提供了药物组合物，该药物组合物包括实施方式1-29中任一项的缀合物，或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体。
[0722]
根据实施方式31，提供了配制用于口服递送的实施方式30的药物组合物，其中，所述组合物进一步包括n[8-(2-羟基苯甲酰基)氨基辛酸]钠，任选地，其中所述组合物被配制成片剂形式。
[0723]
根据实施方式32，提供了实施方式30或31的药物组合物，该药物组合物进一步包括seq id no:7、seq id no:31或seq id no:32的肽和任选的降钙素。
[0724]
根据实施方式33，提供了治疗甲状旁腺功能减退症的方法，其中，所述方法包括向需要治疗的患者施用有效量的实施方式30、31或32中任一项的药物组合物。
[0725]
根据实施方式34，提供了实施方式30的液体药物组合物，该液体药物组合物被配制用于静脉内、皮下或肌内递送。
[0726]
根据实施方式35，提供了治疗骨质疏松症或骨质减少的方法，其中，所述方法包括向需要治疗的患者施用有效量的实施方式30、31或32中任一项的药物组合物。
[0727]
根据实施方式36，提供了根据实施方式33-35中任一项的方法，其中，每日、每隔一天、每周一次或每两周一次施用该组合物。
[0728]
根据实施方式37，提供了实施方式33、35-36中任一项的方法，其中，口服施用该组合物。
[0729]
根据实施方式38，提供了实施方式33、35-36中任一项的方法，其中，该组合物经由肺部递送施用。
[0730]
根据实施方式37，提供了实施方式1-29的缀合物的任何一种用于治疗甲状旁腺功能减退症或减轻与甲状旁腺功能减退症相关的症状的用途。
[0731]
实施例1：模型二肽切割速率的测定(在pbs中)
[0732]
使用特定六肽(hsrgtf-nh2；seq id no:28)作为模型肽以测定通过酰胺键与六肽连接的各种二肽的半衰期。在肽合成器上组装六肽，并将boc保护的肌氨酸和赖氨酸连续添加至模型肽结合树脂中以产生肽a(lys-sar-hsrgtf-nh2；seq id no:29)。肽a通过hf切割并通过制备型hplc纯化。
[0733]
使用hplc进行制备纯化：
[0734]
使用hplc分析在基于二氧化硅的1x25cm vydac c18(5μ粒径，300a
°
孔径)柱上进行纯化。使用的仪器是：waters associates 600型泵、717型注射器和486型uv检测器。所有样品均使用230nm的波长。溶剂a包含在蒸馏水中的10％ch3cn/0.1％tfa，以及溶剂b包含在ch3cn中的0.1％tfa。采用线性梯度(0至100％b，在2小时内)。流速为10ml/min，以及级分大小为4ml。从～150mg的粗肽获得30mg的纯肽。
[0735]
将肽a以1mg/ml的浓度溶解于pbs缓冲液中。将该溶液在37℃下温育。在5h、8h、24h、31h和47h收集样品用于分析。通过用等体积的0.1％tfa降低ph来猝灭二肽切割。切割速率通过lc-ms定性监测并通过hplc定量研究。使用peak simple chromatography软件定量前药和母体模型肽的保留时间和相对峰面积。
[0736]
使用质谱分析
[0737]
使用具有标准esi离子源的sciex api-iii电喷雾四极杆质谱仪获得质谱。使用的电离条件如下：正离子模式下的esi；离子喷雾电压，3.9kv；孔电势，60v。使用的雾化和气帘气体是流速为0.9l/min的氮气。从600-1800thompsons以每步0.5th和2毫秒的停留时间记录质谱。将样品(约1mg/ml)溶解于具有1％乙酸的50％水性乙腈中，并通过外部注射泵以5μl/min的速率引入。根据生产商(millipore corporation，billerica，ma)在分析前提供的说明书，使用包含0.6μlc4树脂的ziptip固相萃取吸头将溶解在pbs中的肽脱盐。
[0738]
使用hplc分析
[0739]
使用配备有在214nm处的uv检测器和150mm x 4.6mm c8vydac柱的beckman system gold色谱法系统进行hplc分析。流速为1ml/min。溶剂a包含在蒸馏水中的0.1％tfa，以及溶剂b包含在90％ch3cn中的0.1％tfa。采用线性梯度(0％至30％b，在10分钟内)。使用peak simple色谱法软件收集和分析数据。
[0740]
将初始切割速率用于测量二肽从各自前药解离的速率常数。前药和模型母体肽的浓度由不同收集时间的每一个的它们各自的峰面积
‘
a’和
‘
b’确定。前药的零级解离速率常数通过绘制在不同时间间隔的前药浓度的对数来确定。该图的斜率提供了速率常数
‘
k’。使用式t
1/2
＝.693/k计算各种前药的切割的半衰期。这些实验中生成结果在表1中呈现。
[0741]
表1：在pbs中与在位置1(x)处的组氨酸(或组氨酸衍生物)连接的二肽a-b从模型六肽(xsrgtf-nh2；seq id no:28)的切割nh
2-a-b-xsrgtf-nh2(seq id no:28)
[0742]
[0743][0744]
实施例2：pth缀合物的合成
[0745]
使用abi-433a肽合成器和fmoc/oxyma/dic偶联方案在0.1mmol fmoc-lys(mtt)-wang树脂上组装pth肽类似物。将fmoc-sar-oh和boc-d-lys(boc)-oh依次与天然第一个氨基酸(ser1)的n-末端偶联。lys
33
的mtt侧链被脱保护，并且将得到的游离胺用于额外的延伸。该胺依次与fmoc-glu-otbu偶联，并两次重复添加fmoc-nh-peg
2-ch2cooh，随后添加fmoc-glu-otbu，并且最后是十八烷二酸单叔丁酯。通过用包含2.5％tis、2.5％2-巯基乙醇、2.5％苯甲醚和2.5％h2o的tfa溶液在室温下轻轻搅拌2小时的处理，来从合成树脂中化学去除肽。通过过滤去除树脂，并添加冷醚(50ml)来沉淀肽。通过离心收集肽沉淀物并用冷醚(3
×
50ml)洗涤。
[0746]
不纯的肽通过制备型反相hplc色谱柱(5μm c8lc色谱柱250x 21.2mm，10-50％水性acn(0.1％tfa)，流速为15ml/min)来进行纯化。通过分析型lcms评估纯肽并将合并的级分冻干以提供最终产物为白色蓬松固体。
[0747]
在采用具有两种不同结构的脂肪酰化的情况下，二肽-前药的侧链在最后一个赖氨酸处偶联为boc-d-lys(fmoc)-oh。赖氨酸fmoc侧链通过标准碱处理来脱保护。脂肪酸侧链的组装如lys
33
所述发生。为了在lys
33
处安装第二种但不同的脂肪酸，另外采用受保护的肽树脂，如上所述用于单脂肪酰化肽类似物，其中，lys
33
的mtt侧链接下来被脱保护，并且将赖氨酸侧链用于额外的化学延伸。
[0748]
对于在n和c-末端赖氨酸残基处采用相同结构的双脂肪酰化的肽类似物，将最后一个氨基酸作为boc-d-lys(fmoc)-oh添加。在树脂完全组装后，去除fmoc和mtt保护基团，从而通过上述常见的偶联程序同时延伸侧链。
[0749]
聚乙二醇化
[0750]
使用abi-433a肽合成器和fmoc/oxyma/dic偶联方案将肽[cys
35
]-pth(1-35)组装在0.1mmol rink amide树脂上。如先前在制备用于脂肪酰化的肽中所述的tfa切割和醚沉淀提供了不纯的cys
35-肽，其通过制备型hplc纯化。硫醇缀合在包含1mm edta和10mm tcep的100mm柠檬酸钠缓冲液，ph 4.0中进行。添加过量的40k马来酰亚胺甲氧基peg并将反应混合物在室温下搅拌过夜。通过使用sp-sepharose树脂和线性盐梯度的阳离子交换色谱法来去除未反应的peg试剂，以20mm乙酸钠ph 4.0作为缓冲液a，以包含1mnacl的相同缓冲液作为缓冲液b。合并的级分用c2 spe柱脱盐并冻干得到期望的聚乙二醇化pth。根据本公开制备的化合物列表在表2中提供。
[0751]
表2：pth类似物
[0752]
[0753]
[0754]
[0755]
[0756]
[0757]
[0758]
[0759][0760]
实施例3：切割半衰期的评估
[0761]
pth前药溶解于pbs缓冲液中并调节获得ph为7.4。将所得溶液在37℃下温育。在设计的时间点取出等分试样并通过lc-ms进行分析。使用具有phenomenex kinetex c8 2.6μ100a(75
×
4.6mm)柱的agilent 1260infinity仪器进行分析。流速为1ml/min，以及梯度为10％-80％乙腈在水中，10min内加入0.1％三氟乙酸。使用214nm处的吸收来收集数据。使用agilent 6120四极杆lc/ms获得正模式ms数据。前药和药物的浓度由它们的相对峰面积确定。通过绘制不同时间点前药浓度的对数来确定前药的零级解离速率常数。该图的斜率提供了速率常数
‘
k’。基于式t
1/2
＝0.693/k来计算切割的半衰期。表3呈现了本公开的pth缀合物的各种实施方式的切割半衰期。
[0762][0763]
实施例4：生物测定实验设计：用于camp检测的基于荧光素酶的报道基因测定
[0764]
每种pth类似物或前药诱导camp的能力在基于萤火虫荧光素酶的报道基因测定中
进行测量。诱导的camp产生与pth与其受体的结合成正比。采用共转染pth1受体和与camp反应元件相连的荧光素酶基因的hek293细胞来用于生物测定。结果如图3a、3b、4和表4中示出。
[0765]
通过在补充有0.3％fetalclone iii(hyclone,logan,ut)的dulbecco最低必需培养基(gibco,life technologies,grand island,ny)中培养16小时使细胞剥夺血清，并且然后在37℃、5％co2下与pth类似物或前药的系列稀释液在96孔“costar 3610”检测板(corning,kennebunk,me)中一起温育5小时。在温育结束时，将50μl的steady-lite plus(perkinelmer,waltham,ma)添加至每个孔中。将板短暂振荡，温育四分钟，并在enspire alpha多功能酶标仪(perkinelmer,waltham,ma)上测量光输出。使用origin 2019b软件(originlab,northampton,ma)计算有效50％浓度(ec50)。
[0766]
表4：药物和前药形式的pth类似物的体外分析
[0767][0768]
实施例5：正常大鼠的药理学评估
[0769]
将溶媒和化合物seq id no:102(剂量为20、40和80nmol/kg)皮下注射到四组六只大鼠(性别；雌性；品系；sprague dawley；平均体重；267.3g；年龄：20-22周龄；饮食：标准食物(chow))。每组大鼠在注射前立即取血以及在6、24、48和72小时后取血。旋转血液并收集血清并储存在-20℃。按照生产商的说明书，使用市售测定来确定钙和磷浓度。结果在图5a和5b中示出。
[0770]
实施例6：正常小鼠的药理学评估
[0771]
将溶媒和化合物seq id no:102、seq id no:74和seq id no:77(每个剂量为20或40nmol/kg)皮下注射到七组八只小鼠(性别：雄性；品系：c57bl6/j；平均体重：24.8g；年龄：8-10周龄；饮食：标准食物)。每组小鼠在注射前立即取血以及在24和48小时后取血。将血液离心并收集血清并储存在-20℃。按照生产商的说明书，使用市售测定来确定钙浓度。结果示出在图5c中，证明了包括在pth肽的c-末端处的酰化氨基酸的pth类似物在小鼠体内降低血清钙水平的功效。
[0772]
实施例7：正常小鼠的药代动力学评估——通过lcms测量血浆肽浓度
[0773]
将化合物seq id no:78、seq id no:79和seq id no:84以100nmol/kg的剂量皮下注射到小鼠(性别：雄性；品系：c57bl6/j；平均体重：34.8g；年龄：42-44周龄；饮食：标准食物)。将每种化合物注射到20只小鼠中，并在1、4、8、24和48小时的时间从每次治疗的4只小鼠的edta包被管上收集血液。离心后收集血浆并储存在-20℃。
[0774]
在分析当天通过用cd-1小鼠血浆连续稀释来制备标准曲线样品。将标准曲线和研究样品的等分试样(40μl)转移到96孔板中，并与160μl甲醇:乙腈(acn)(1:1,v/v)内标溶液混合。离心10分钟后，将上清液用酸化(0.1％甲酸)acn:水(3:1,v/v)稀释2倍，并通过lc-ms/ms分析。
[0775]
shimadzu cbm-20a nexera uplc系统和ctc pal自动进样器构成lc-ms/ms系统的前端。色谱法是基于accurcore c8柱，2.6μm、2.1mm x30mm(thermo 17226-032130)以及0.1％甲酸(aq)和0.1％甲酸在acn中的二元梯度程序。流动相溶剂a由微滤水：甲酸(1000:1v/v)组成，溶剂b由acn:甲酸(1000:1)组成。流速为0.8ml/min.，柱温为环境温度，以及注入体积为5μl。两针冲洗液是acn:水(25:75,v/v)和acn:异丙醇:丙酮在0.1％甲酸溶液中(5:4:1,v/v/v)。梯度循环从15％b(浓度)开始，在0.75分钟内线性增加到65％b。用98％b清洗谱0.25min，并在1.20分钟的采集时间期间恢复至初始b％。每次注入的总循环时间，包括初始b％的重新平衡，为大约3分钟。将每次运行的前0.3min转为废液。
[0776]
使用analyst软件在正离子模式下控制sciex api 6500plus三重四极杆质谱仪(型号5060743-j)生成质谱数据。表5中提供了每个测试物质和内标(is)的多反应监测(mrm)、碰撞能量、去簇电势和碰撞退出电势设置。图6a和6b示出了每个类似物随时间的浓度。
[0777]
表5：pth类似物的质谱评估
[0778][0779]
实施例8：pth类似物:单次皮下给药后食蟹猴(cynomolgus monkey)中的比较药代动力学
[0780]
研究了对食蟹猴单次皮下给药后pth类似物的药代动力学特征以及对血清钙和磷的药效学反应的评价。在该测试中使用了总计六只猴，2只雄性和4只雌性在研究开始时年龄在2-4岁，具有的体重为至少2.5kg。
[0781]
实验设计：施用途径、频率和持续时间
[0782]
如下表6所示，将动物分配至各组。动物通过皮下注射给药。剂量施用交错进行。第
1组
[0783]
表6
[0784][0785]
雄性给药一次，大约四天后，并且其余两只第1组雌性和所有第2组动物给药一次。对于每只动物，给药的第一天被指定为研究日(sd)1。剂量体积为0.3ml/kg。基于动物最近记录的体重计算个体剂量体积。观察动物并记录数据，如表7所示。
[0786]
表7：动物观察
[0787][0788]
在给药前以及给药后第1、2、4、8、24、48、72、96、120、144、168和192小时，从所有动物中收集至少0.5ml的血液样品。动物在收集前不禁食。经由股静脉(或另一个合适的部位)收集血液。将血液样品保持在5
±
3℃(湿冰或同等温度)，并在收集每个血液样品的1小时内在5
±
3℃下离心。将所得血浆转移到管中，并然后在设定为保持-75
±
15℃的条件下储存直至分析。
[0789]
药代动力学评价
[0790]
基于施用途径，使用非分区方法(7.0版本或更高版本)分析药代动力学平均浓度-时间数据。在数据允许的情况下，尽可能计算以下参数：cmax、tmax和auc。使用phoenix winnonlin生成描述性统计数据。
[0791]
结果
[0792]
为了在评价pth类似物(低效力丙氨酸置换的pth激动剂)的药代动力学的同时将猴研究中的死亡率降至最低
[0793]
将seq id no:93pth(1-33)，a8，k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)以其两种前药形式进行研究：向猴施用seq id no:94pth(1-33)，a8，具有dk-1的k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)，n(me)g0和seq id no:95pth(1-33)，a8，具有dk-1(γe-2xoeg-γe-二酸c18)的k33
(γe-2xoeg-γe-二酸c18)，n(me)g0。用丙氨酸置换第8位使体外效力降低近100分之一。
[0794]
这些药代动力学(pk)研究的结果在图7a和7b中提供，其中随时间测量施用的前药形式及其活化药物形式(在二肽前药元件的体内非酶促切割后产生)的浓度。将前药pth-类似物(图7a中的seq id no:94和图7b中的肽19)以25nmol/kg向猴施用单次皮下给药，并且在施用后接下来的192小时内测量前药seq id no:94和seq id no:95连同其相应的切割产物seq id no:93(“药物”)的浓度。
[0795]
具体地，图7a是证明以下的图：前药pth类似物seq id no:94pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)dk-1
、n(me)g0；及其活化形式seq id no:93pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)在施用单次给药的前药(seq id no:94)之后随时间的检测水平。图7b是证明以下的图：前药pth类似物seq id no:95：pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)dk-1
(γe-2xoeg-γe-二酸c18)、n(me)g0及其活化形式：seq id no:93pth(1-33)、a8、k33(γe-2xoeg-γe-二酸c18)在施用单次给药的前药(seq id no:95)之后随时间的检测水平。数据表明活性形式随时间的蓄积，对应于前药形式的减少，导致在延长的时间段内活性形式的量相对一致。
[0796]
实施例9：在皮下施用20或40nm/kg的seq id no:77之后24和48小时测量c57bl/6j小鼠中的血清钙水平
[0797]
将雌性c57bl/6j小鼠随机分配到三组(每组n＝8)并皮下注射溶媒(无菌pbs溶液)或在pbs中的seq id no:77(20或40nmol/kg)一次。在pbs，ph 7.4中以150μm的浓度制备seq id no:77。在施用前(0小时)和施用后(24和48小时)经由尾部撕裂从每只小鼠收集血液样品用于血清钙确定。
[0798]
使用根据生产商的建议的市售的比色测定(calcium liquicolor#10155，stanbio laboratory)来确定血清ca浓度。ca测定包含显色试剂(货号0156)和ca标准品(10mg/dl；货号0157)。在650nm波长处测量吸光度(ab)。提供的生产商线性度高达15mg/dl。结果计算如下：ab(未知)/ab(标准)x10
[0799]
在时间0、24和48小时记录对照组和治疗组的血清钙水平，并总结在表8-10中。与对照组或接受20nmol/kg的seq id no:77的小鼠相比，接受40nmol/kg的seq id no:77单次皮下给药的小鼠在治疗后24和48小时表现出显著增加的血清ca水平(图14a)。当考虑初始基线水平时，这种差异在24小时具有统计学意义(图14b)。在40nmol/kg的剂量后24小时血清ca增加。从2.4105nmol/ul(9.6421mg/dl)的起始水平增加0.631nmol/ul(2.524mg/dl)表示浓度升高26.2％。
[0800]
每个研究组的血清ca水平变化百分数总结在表11中。40nmol/kg剂量组的血清ca水平增加是20nmol/kg seq id no:77的较低剂量下增加(13.8％)的几乎两倍。在该剂量下，从2.2704nmol/ul(9.0816mg/dl)的水平开始，增加了0.3131nmol/ul(1.252mg/dl)。溶媒治疗后血清ca的增加低于用seq id no:77治疗的任一组。溶媒组动物的血清ca增加9.7％代表0.2174nmol/ul(0.898mg/dl)的值，从2.2512nmol/ul(9.0049mg/dl)的水平开始。在所有治疗中，血清ca在治疗后48小时恢复到接近起始水平。
[0801]
表8：时间点0小时的血清钙水平
[0802][0803]
表9：24小时时间点的血清钙水平
[0804][0805]
表10：48小时时间点的血清钙水平
[0806][0807]
表11：血清钙水平的百分比变化
[0808][0809]
实施例10：sprague dawley大鼠在单次个体皮下施用seq id no:77或seq id no:87后的血清钙、无机磷酸盐、体重、摄食量和药物水平
[0810]
该实验测量了雌性sprague-dawley大鼠皮下注射30或60nmol/kg的甲状旁腺激素类似物前药seq id no:87后血清钙和无机磷的特征。另外，在接受30nmol/kg seq id no:87的组中测量前药seq id no:87的药代动力学(pk)及其向活性seq id no:77的转化，并与接受30nmol/kg seq id no:77的大鼠组进行比较。
[0811]
雌性sprague-dawley大鼠在四组中随机分布，每组5或6只大鼠。制剂由seq id no:87和seq id no:77的冻干粉末和稀释剂pbs制备，以获得seq id no:77在pbs中的50μm溶液以及seq id no:87在pbs中的100μm和50μm溶液，并且在给药期间将它们保持在湿冰上。剂量体积基于体重并在给药前记录。将每个受试者皮下注射溶媒(无菌pbs溶液；n＝6)、seq id no:77(30nmol/kg；n＝5)或seq id no:87(30或60nmol/kg；分别n＝5和6)一次。在施用前(0小时)和施用后(24、48、72、96、120和168小时)经由尾部撕裂从每只大鼠收集血液样品。这些样品用于在溶媒和所有seq id no:87治疗的动物中测定血清钙和无机磷。在seq id no:87和seq id no:77 30nmol/kg组中抽取单独的血液样品用于pk测定，并且在这两个pk组中在2和7小时收集额外的血液样品。数据总结在图15、16a、16b、17a和17b以及表12和13中。
[0812]
通过lcms进行血清seq id no:87和seq id no:77的测量。药代动力学结果总结在图15中。
[0813]
在以30nmol/kg单次给药后，观察到seq id no:77和seq id no:87血浆浓度增加。pth激动剂的前药形式(seq id no:87)在24h表现出cmax，其相对浓度在48h降低1/3，并且在72h降低2/3，一周后恢复至基线值。在施用seq id no:87后通过n-末端二肽的体内转化和释放观察到seq id no:77。它在24h达到峰值，浓度略低于seq id no:87 20％。它在48小时维持在几乎相同的水平，并且在72小时具有与seq id no:87相当的浓度，一周后恢复至基线。以与seq id no:87相同的30nmol/kg剂量施用后，对seq id no:77血清浓度的类似pk
分析显示，在给药后2小时出现具有浓度超过100nm的出现更快速的表现，并在7小时达到峰值并持续24小时，但在48h降至大约1/3的cmax以及在96h降至基线水平。当比较第一天相对于96h内seq id no:77的浓度时，峰谷比率显示出差异，这取决于它是通过直接施用肽还是其从seq id no:87转化的结果而实现的。
[0814]
结果表明seq id no:87在体内以与体外确定一致的速率转化为seq id no:77并且该肽在大鼠中持续近一周，其中相对于灵长类，脂肪酰化肽的清除是加速的。在可以通过lcms测量前药和药物的剂量下，血清钙和磷的变化在生理范围内，并且未对大鼠产生不利影响。
[0815]
血清钙和无机磷测量
[0816]
使用经由尾部撕裂收集血液样品，使用根据生产商的建议的市售比色测定(stanbio实验室：钙liquicolor#10155；磷liqui-uv，#0830)来确定血清中的总钙(ca)和无机磷(pi)。采用96孔板分光光度计(spectramax m5,分子装置)进行检测。在第0、1、2、4、5和7天测量血清ca和pi。
[0817]
在650nm处测量ca和在340nm处测量pi的吸光度(ab)。生产商提供的ca的线性度高达15mg/dl，pi的线性度高达10mg/dl。结果计算如下：ab(未知)/ab(标准)x10
[0818]
在48至96小时的时间范围内，观察到血清钙相对于溶媒治疗显著增加，在120和240小时恢复至与对照值相当的水平(图16a、16b和表12)。施用seq id no:87后血清钙的测量显示在生理范围内增加，在3天达到峰值。肽的最低剂量提供了相对于较高剂量没有统计学意义的略微增强的增加。
[0819]
表12：血清钙变化0vs 72小时
[0820]
溶媒mg/dlnmol/ul变化mg/dl变化nmol/ul0小时8.57262.1432
ꢀꢀ
72小时7.69981.9250.87280.2182
ꢀꢀꢀꢀꢀ
60nmol/kgmg/dlnmol/ul
ꢀꢀ
0小时8.42742.1068
ꢀꢀ
72小时9.19882.29970.77140.1929
ꢀꢀꢀꢀꢀ
30nmol/kgmg/dlnmol/ul
ꢀꢀ
0小时8.29852.0746
ꢀꢀ
72小时9.93062.48271.63210.4081
[0821]
仅当相对于溶媒治疗进行评估时，血清磷酸盐水平的增加较小，这具有统计学意义。这种差异归因于溶媒治疗的大鼠中较低的起始浓度(图17a、17b和表13)。
[0822]
表13：血清磷酸盐变化0vs 72小时
[0823][0824][0825]
实施例11：通过lcms和体外测定来测定前药及其转化成药物。
[0826]
在与eurofins-discover rx corporation签订合同的专有商业测定campteriparatide bioassay(95-0118y2)中评估前药相对于其药物形式的生物活性。对每个单独的肽或温育条件进行激动剂模式下的11点剂量曲线。每个样品在每个剂量下运行重复三次。表14中的结果在图8a-8c中提供，并且它们支持以下结论：seq id no 87是具有高nm效力的全pth激动剂(图8a)，并且seq id no.87的延伸具有由seq id no.79(图8b)构成的非可切割二肽或如seq id no.77(图8c)构成的二肽使pth激动失活。
[0827]
表14：与图8a、8b和8c相关的体外结果
[0828]
样品s/b斜率(hillslope)ec
50 pmseq id no:778.02.19631pth 1-346.12.01717.3
ꢀꢀꢀꢀ
seq id no:798.0-无活性pth 1-347.82.01718.1
ꢀꢀꢀꢀ
seq id no:878.02.38712,730pth 1-349.02.22918.6
[0829]
前药向药物转化的评估通过lc-ms分析确定，其中方法论在实施例3中呈现。峰面积和前药百分比的计算在表15中示出。各个色谱图谱在图9a-9f中示出。反应速率的计算通过将实验结果拟合成零级方程来进行，该方程显示了高度相关的拟合，r2值为0.9988(图10)。
[0830]
表15：如图9a-9f和10所示出的前药和药物的峰面积结果
[0831][0832][0833]
在与eurofins-discover rx corporation签订合同的专有商业测定campteriparatide bioassay(95-0118y2)中额外进行了前药向药物转化的评估。对每个单独的肽或温育条件进行激动剂模式下的11点剂量曲线。每个样品在每个剂量下运行重复三次。使用campteriparatide bioassay对通过lcms评估的相对前药/药物浓度的相同温育样品(图9a-9f和图10)进行分析。表16中的结果呈现在图11中，并且它们支持上述lcms确定的结论。
[0834]
表16：与图11相关的体外结果。
[0835]
样品s/b斜率(hillslope)ec
50 pmseq id no:7713.81.87410.0seq id no:87-1天13.61.42167.6seq id no:87-2天14.12.10230.0seq id no:87-3天9.81.82531.3seq id no:87-5天10.32.10217.4seq id no:87-8天8.52.17214.4
[0836]
实施例12：通过体外测定来测定met(0)和脱酰胺类似物。
[0837]
对我们通过氧化成甲硫氨酸亚砜进行位点特异性修饰(seq id no 109和110)或从天然asn或gln脱氨化为相应的羧酸asp或glu(seq id no1118、120、122和124)的pth类似物的生物活性的评估在与eurofins-discover rx corporation签订合同的专有商业测定campteriparatide bioassay(95-0118y2)中进行。在每个浓度下对每个单独的肽进行激动剂模式下的11点剂量曲线。每个样品在每个剂量下运行重复三次。结果咋表17、18和19，以及图12、13a和13b中。
[0838]
表17：与图12相关的体外结果
[0839][0840]
[0841]
表18：与图13a相关的体外结果
[0842]
样品s/b斜率(hillslope)ec
50 pmseq id no:7710.42.68710.7seq id no:1189.41.64880.3seq id no:120102.80410.9
[0843]
表19：与图13b相关的体外结果
[0844]
样品s/b斜率(hillslope)ec
50 pmseq id no:777.22.68719.3seq id no:1228.22.52214.3seq id no:1248.91.79743.1
[0845]
实施例13：重复皮下施用20nmol/kg的seq id no:77、20或40nmol/kg的seq id no:87后sprague dawley大鼠的血清钙、磷酸盐、体重、摄食量和药物水平
[0846]
该实验测量了每日重复给药seq id no:77和seq id no:87对sprague-dawley大鼠血清钙和磷酸盐的影响。如表20中所述，将雌性sprague-dawley大鼠单独饲养或成对饲养并随机分配到四组(每组n＝5-6)，并然后称重。
[0847]
表20：治疗组和取样时间
[0848][0849]
大鼠皮下注射溶媒(无菌0.9％nacl溶液；n＝5)、seq id no:77(20nmol/kg；n＝6)或seq id no:87(20或40nmol/kg，分别n＝5和6)每日一次，持续7天。治疗停止后，在第9天和第11天(洗脱期)监测动物。
[0850]
在溶媒、seq id no:77或seq id no:87施用之前(0小时)和施用之后(1、2、3、4、7天)，经由尾部撕裂从所有动物收集血液样品，用于血清钙和磷酸盐分析，使用市售比色测定来确定血清中的总钙(ca)和无机磷(pi)。在第0、1、3、5和7天测量体重和摄食量。在第0、1、2、3、4、7、9和11天测量ca。除了第9天和第11天外，在相同样品上测定pi。通过lcms进行血清seq id no:87和seq id no:77的测量，并且数据示出在图18a和18b中。
[0851]
在治疗时段期间，所有三个治疗组的血清钙水平逐渐增加，并在洗脱时段结束时恢复至初始值(图18a)。除了第3天，血清pi的变化没有显著差异，其中seq id no:77组的水平与溶媒和以40nmol/kg治疗的seq id no:87大鼠具有显著差异。
[0852]
seq id no:77和seq id no:87的血浆水平显示在给药后呈剂量比例增加(图19a和19b)。每日施用四次后，每种肽均达到稳态水平。seq id no:77的相对浓度为seq id no:87水平的大约四分之一。当源自施用前药seq id no:87时，seq id no:77在稳态时的相对浓度为通过直接施用seq idno:77所达到的浓度的大约70％。
[0853]
实施例14：在皮下施用4、8或12nmol/kg的seq id no:87后测量sprague dawley大鼠的血清钙、体重和摄食量
[0854]
该实验测量了在雌性sprague-dawley大鼠中以4、8和12nmol/kg重复每日给药seq id no:87持续28天的影响。还测量了体重和摄食量的变化。
[0855]
将大鼠在四组(n＝10)中随机分布，并且每日一次皮下注射溶媒或seq id no:87(4、8、12nmol/kg)，持续21天。在第0天(即在肽施用前立即)、第1、3、7、10、14、17、21、24、28、31和35天测量体重和摄食量。在实验开始时以及第7、14、21、28、29、30、31、32和34天测量血清ca。经由尾部撕裂收集血液样品，使用市售的比色测定来确定血清中的总ca。收集血清样品用于seq id no:87和所得药物seq id no:77的药代动力学测量。
[0856]
研究中的所有大鼠，包括溶媒治疗的动物，经历总体体重略有增加，基于272.6gm的起始体重，不超过2％。与溶媒治疗的大鼠相比，累积摄食量按与体重相对增加一致的量级成比例增加。
[0857]
在所有治疗的大鼠中，包括溶媒对照，血清ca在研究过程中增加(图20a)。溶媒、4、8和12nmol/kg治疗的大鼠的绝对增加分别为0.636、1.356、1.452和2.072mg/dl。所有血清ca水平保持在正常范围内，并且作为百分比增加，溶媒治疗的大鼠为6.6％。对于增加剂量的seq id no:87(分别为4、8、12nmol/kg)，记录增加14.7％、16.7％和23％。在该剂量范围内，ca的相对增加与剂量的增加不成比例，因为剂量从4至12nmol/kg增加了三倍，表明血清ca的相对增加小于两倍(增加56％)。在第34天，所有seq id no:87大鼠的血清ca水平浓度均降低(图20b)。溶媒治疗的动物没有变化，ca水平相对于研究初始增加了6.9％。相对于研究开始，低剂量治疗的大鼠示出血清ca增加6.9％。中剂量和高剂量大鼠的血清钙分别增加了11.7％和12.2％。所有动物看起来很健康。
[0858]
每周测定seq id no:87和随后的seq id no:77，在通过每日给药达到稳态水平后的第7天开始血浆浓度。在三个施用剂量中的任何一个下，两种肽与前药(seq id no:87)的剂量成比例增加，是所得药物(seq id no:77)的四倍高。在7-28天时段中三个剂量中两种肽的绝对和相对浓度保持，每日重复给药。在随后的7天时程中，通过lcms监测这两种肽的消失。在末次给药后的第一个24小时时段，在给药后第2、7和24小时测量每种肽的血浆浓度。结果表明，一旦达到稳定浓度，每次后续给药的每日药物暴露几乎没有变化。这些结果在图21和22中示出。
[0859]
实施例15：在重复皮下施用15、25或40nmol/kg的seq id no:87后测量甲状旁腺切除的sprague-dawley大鼠的血清钙水平
[0860]
该实验测量了在手术移除其甲状旁腺的雌性sprague-dawley大鼠中，在重复皮下注射甲状旁腺激素类似物前药seq id no:87后对血清和尿钙的血清钙特征。大鼠在5组中随机分布，并且连续4天皮下注射溶媒(无菌0.9％nacl溶液；n＝6)或seq id no:87(10、25、40nmol/kg；n＝8)。研究了两个单独的溶媒治疗的大鼠组。第一个代表对照大鼠如同其余大鼠一样进行手术管理，但没有移除它们的甲状旁腺(假手术对照)。第二溶媒对照组代表以与seq id no:87治疗的大鼠相同的方式进行手术管理的大鼠。手术后和测试前一周，所有大鼠进食特定钙浓度的特定饲料。
[0861]
在溶媒或seq id no:87施用前(0小时)和施用后(24、48、72、96、144小时)经由尾部撕裂收集血液样品，使用根据生产商的建议的市售比色测定(stanbio laboratory：
calcium liquicolor#0155)来确定血清中的总钙(ca)。采用96孔板分光光度计(spectramax m5,分子装置)进行检测。钙测定包含显色试剂(货号0156)和钙标准品(10mg/dl；货号0157)。在650nm波长处测量吸光度(ab)。生产商提供的线性高达15mg/dl。在注射前立即测量血清钙(时间0小时)，随后在24、48、72和96小时测量血清钙。结果(mg/dl)计算如下：ab(未知)/ab(标准)
×
10。
[0862]
假手术对照大鼠表现出相对于溶媒治疗的ptx大鼠显著增加的起始血清钙。与ptx大鼠的溶媒对照组中的1.085nmol/ul相比，起始钙水平为1.495nmol/ul。这代表了37.8％的相对较高的浓度。两个对照组之间的差异在整个实验过程中基本保持不变，尽管两个对照组均增加了近0.3nmol/ul。seq id no:87治疗的大鼠开始以介于两个溶媒对照组之间的血清钙浓度进行治疗，对于治疗组10、25、40nmol/kg为1.185、1.354和1.251nmol/ul。这比构成溶媒治疗组的相当ptx大鼠分别高出9.2％、24.8％和15.3％的水平。48小时后和第三次给药前立即，在ptx治疗的大鼠中观察到明显的剂量效应，最高剂量为40nmol/kg，略高于假手术对照大鼠。这种关系在72小时保持，其中25nmol/kg的中间剂量与假手术对照大鼠没有显著差异。在144小时(末次给药后的72小时)，ptx大鼠继续表现出血清钙的剂量比例差异。ptx溶媒治疗大鼠的起始水平与中剂量组之间的差异在此疗法时段加倍，并且对于最高剂量组，它增加了超过三倍，超过假手术对照0.2nmol/ml，并且结果在图23中示出。
[0863]
实施例16：在重复皮下施用15、25或40nmol/kg seq id no:87后测量甲状旁腺切除的sprague-dawley大鼠的血清和尿钙水平
[0864]
该实验测量了在手术移除其甲状旁腺的雌性sprague-dawley大鼠中，在重复皮下注射甲状旁腺激素类似物前药seq id no:87后对血清钙特征。大鼠在5组中随机分布，并且连续10天皮下注射溶媒或seq id no；87(10、25、40nmol/kg；n＝8)。研究了两个单独的溶媒治疗的大鼠组。第一个代表对照大鼠如同其余大鼠一样进行手术管理，但没有移除它们的甲状旁腺(假手术对照)。第二溶媒对照组代表以与seq id no:87治疗的大鼠相同的方式进行手术管理的大鼠。手术后和测试前一周，所有大鼠进食特定钙浓度的特定饲料。
[0865]
经由尾部撕裂收集血液样品，利用根据生产商的建议的市售比色测定(stanbio实验室：钙liquicolor；磷liqui-uv，#0155)来确定血清中的总钙(ca)。采用96孔板分光光度计(spectramax m5,分子装置)进行检测。钙测定包含显色试剂(货号0156)和钙标准品(10mg/dl；货号0157)。在650nm波长处测量吸光度(ab)。生产商提供的线性高达15mg/dl。在注射前立即测量血清钙(时间0小时)，随后在24、48、72和96小时测量血清钙。结果(mg/dl)计算如下：
[0866]
ab(未知)/ab(标准)
×
10。
[0867]
假手术对照大鼠表现出相对于溶媒治疗的ptx大鼠显著增加的起始血清钙。与ptx大鼠的溶媒对照组中的4.66mg/dl相比，起始钙水平为5.896mg/dl。这代表了26.5％的相对较高的浓度。这两个对照组之间的差异在整个实验过程中基本保持不变。seq id no:87治疗的大鼠开始以介于两个溶媒对照组之间的血清钙浓度进行治疗，对于治疗组10、25、40nmol/kg为4.5、5.028和5.108mg/dl(图24)。这分别代表最低剂量组降低了3.4％的水平，以及中剂量组和更高剂量组增加了7.9％和9.6％的水平。两天后，并且立即在第三次给药之前，所有经seq id no:87治疗的大鼠显示出与假手术对照大鼠几乎相同的血清钙水平。在第4天和第7天，中剂量和高剂量ptx大鼠显示处的血清钙水平与在假手术对照大鼠中观
察到的水平相匹配或超过。在用seq id no:87治疗的大鼠中存在剂量比例差异，最高剂量的大鼠在量级上最大，并且最低剂量的大鼠在血清钙中最低。ptx治疗的大鼠在第10天和第11天保持提高的血清钙，与假手术处理的大鼠平行。在第14天和第21天之后，ptx大鼠恢复到彼此匹配的血清钙水平，包括溶媒治疗的大鼠。相对于假手术大鼠，在第21天血清钙中的这些钙值同样降低，正如研究开始时第0天存在的差异。
[0868]
磷酸盐水平的确定是在与血清钙几乎相同的时间取样进行的，仅在洗脱时段的最后几天有所不同。对seq id no:87的反应与之前对血清钙描述的反应相似，但相对于用溶媒治疗的ptx大鼠，在每个剂量下磷酸盐降低(图25)。随着治疗时间的增加，seq id no:87治疗大鼠中的磷酸盐水平与假手术对照大鼠的磷酸盐水平相匹配。假手术对照大鼠表现出相对于溶媒治疗的ptx大鼠显著降低的起始血清磷酸盐。与ptx大鼠的溶媒对照组中的11.317mg/dl相比，起始磷酸盐水平为7.003mg/dl。这代表38.1％的相对较低的浓度。两个对照组之间的差异在整个实验过程中保持不变。seq idno:87治疗的大鼠开始以介于两个溶媒对照组之间的血清磷酸盐浓度进行治疗，对于治疗组10、25、40nmol/kg为11.412、10.673和8.152mg/dl。这分别代表低剂量增加1.0％，以中剂量和高剂量分别降低5.7％和28％。在7天后，所有seq id no:87ptx治疗的大鼠都表现出与假手术对照大鼠相当的血清磷酸盐水平。在末次使用剂量后的第10天，通过观察，完全维持功效。两周后，中剂量和高剂量大鼠呈现的磷酸盐水平相对降低，而最低剂量大鼠在十天时相对于它们的最低点有所增加。研究初始后25天，与假手术对照大鼠相比，所有ptx大鼠都与磷酸盐增加的一组一致。
[0869]
实施例17：单次皮下给药seq id 87后食蟹猴中的比较药代动力学
[0870]
在向食蟹猴单次皮下给药施用后通过实施例8中详述的方法论研究pth类似物seq id no 87的药代动力学特征。每个测试剂量使用总计三只猴。猴的年龄范围在研究开始时为2-4岁，并且具有的体重为至少2.5kg。剂量体积为0.3ml/kg。基于动物最近记录的体重计算个体剂量体积。
[0871]
在给药前以及在给药后第6、24、48、72、96、120、144、168、192、216、240、264、336小时，从所有动物收集至少0.5ml血液样品。动物在收集前不禁食。经由股静脉(或另一个合适的部位)收集血液。将血液样品保持在5
±
3℃(湿冰或同等温度)，并在收集每个血液样品的1小时内在5
±
3℃下离心。将所得血浆转移到管中，并然后在设定为保持-75
±
15℃的条件下储存直至分析。
[0872]
药代动力学评价
[0873]
基于施用途径，使用非分区方法(7.0版本或更高版本)分析药代动力学平均浓度-时间数据。在数据允许的情况下，尽可能计算以下参数：cmax、tmax和auc。使用phoenix winnonlin生成描述性统计数据。
[0874]
结果
[0875]
这些药代动力学(pk)研究的结果在图26a和26b中提供，其中随时间测量施用的前药形式及其活性药物形式(在二肽前药元件的体内非酶促切割后产生)的浓度。将前药pth-类似物seq id no 87以2.5、3.75和5nmol/kg向猴施用单次皮下给药，并且在施用后接下来的336小时内测量前药(seq id no 87，图26a)连同其相应的切割产物seq id no:77(“药物”)的浓度。seq id no:87的浓度呈剂量比例增加，在24小时达到峰值，并且直至一周后才恢复至起始浓度(图26a)。由seq id no:87转化产生的肽seq idno:77在48-72小时达到峰
值，并且在一周评估时其浓度保持在cmax浓度的大约2/3。即使在给药后两周，seq id no:77的浓度相对于起始浓度仍保持升高(图26b)。