用组合疗法治疗癌症的方法与流程

用组合疗法治疗癌症的方法
1.1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年6月25日提交的美国临时申请号63/044,127的优先权，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
3.2.序列表
4.本说明书与序列表的计算机可读形式(crf)副本一起提交。该crf标题为14247-544-228_seqlisting_st25.txt，创建于2021年6月21日，并且大小为11,150字节，通过引用以其整体并入本文。
3.技术领域
5.本文提供了使用本文提供的化合物(例如，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、或化合物7，或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物)与第二活性剂的组合治疗癌症的方法。
4.

背景技术：

6.癌症的主要特征是来自给定正常组织的异常细胞数量增加、这些异常细胞侵袭邻近组织、或恶性细胞通过淋巴或血液扩散到局部淋巴结以及转移。临床数据和分子生物学研究表明，癌症是一个多步骤过程，其开始于微小的肿瘤前变化，这些变化在某些条件下可能进展至瘤形成。肿瘤病变可能进行克隆性演变并发展出越来越强的侵袭、生长、转移和异质性能力，尤其是在肿瘤细胞逃避了宿主的免疫监视的条件下。目前的癌症疗法可能包括手术、化疗、激素疗法和/或放射治疗，以根除患者体内的肿瘤细胞。rajkumar等人在nature reviews clinical oncology[自然临床肿瘤学评论]11,628-630(2014)中探讨了癌症治疗的最新进展。
[0007]
目前所有的癌症疗法对患者都有显著的弊端。例如，由于患者的健康状况，手术可能是禁忌的，或可能是患者不可接受的。此外，手术可能无法完全去除肿瘤组织。放射疗法仅在肿瘤组织对放射的敏感性高于正常组织时才有效。此外，放射疗法可能会经常引起严重的副作用。激素疗法很少作为单药剂使用。虽然激素疗法可能有效，但它经常用于在其他治疗已去除大部分癌细胞之后预防或延迟癌症的复发。
[0008]
尽管有多种化疗剂可用，但化疗仍有很多缺点。几乎所有的化疗剂都有毒性，并且化疗会引起严重且通常是危险的副作用，包括严重的恶心、骨髓抑制和免疫抑制。此外，即使组合施用化疗剂，许多肿瘤细胞还是对化疗剂具有耐药性或会产生耐药性。事实证明对治疗方案中使用的特定化疗剂具有耐药性的那些细胞通常对其他药物具有耐药性，即使那些药剂的作用机制不同于特定的治疗中所用药物的机制亦是如此。这种现象被称为多向耐药性或多药耐药性。由于耐药性，对于标准化疗治疗方案，许多癌症被证明难治或变得难治。
[0009]
血液恶性肿瘤是始于造血组织(如骨髓)或免疫系统细胞的癌症。血液恶性肿瘤的
实例是白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。血液恶性肿瘤更特定的实例包括但不限于急性髓系白血病(aml)、急性淋巴细胞白血病(all)、多发性骨髓瘤(mm)、非霍奇金淋巴瘤(nhl)、弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、霍奇金淋巴瘤(hl)、t细胞淋巴瘤(tcl)、伯基特淋巴瘤(bl)、慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(cll/sll)、边缘区淋巴瘤(mzl)和骨髓增生异常综合征(mds)。
[0010]
多发性骨髓瘤(mm)是骨髓中浆细胞的癌症。正常情况下，浆细胞产生抗体，并在免疫功能中起关键作用。然而，这些细胞不受控制的生长导致骨痛和骨折、贫血、感染和其他并发症。多发性骨髓瘤是第二最常见的血液恶性肿瘤，但多发性骨髓瘤的确切病因尚不清楚。多发性骨髓瘤导致血液、尿液和器官中的蛋白质(包括但不限于m蛋白及其他免疫球蛋白(抗体)、白蛋白和β-2-微球蛋白)水平高，例外的是一些患者(估计有1％至5％)的骨髓瘤细胞不分泌这些蛋白质(称为非分泌型骨髓瘤)。m蛋白(单克隆蛋白的简称)也称为副蛋白，是由骨髓瘤浆细胞产生的特别异常的蛋白质，并且可见于几乎所有多发性骨髓瘤患者的血液或尿液中，但患有非分泌型骨髓瘤的患者或骨髓瘤细胞产生带有重链的免疫球蛋白轻链的患者除外。
[0011]
骨骼症状(包括骨痛)是多发性骨髓瘤的临床上最显著的症状之一。恶性浆细胞释放破骨细胞刺激因子(包括il-1、il-6和tnf)，这些因子导致钙从骨骼中浸出，引起溶解性病变；高钙血症是另一种症状。破骨细胞刺激因子(也称为细胞因子)可防止骨髓瘤细胞的细胞凋亡或死亡。百分之五十的患者在诊断时有放射学可检测的骨髓瘤相关骨骼病变。多发性骨髓瘤的其他常见临床症状包括多发性神经病、贫血、粘滞性过高、感染和肾功能不全。
5.

技术实现要素：

[0012]
本文提供了使用本文提供的化合物(例如，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、或化合物7，或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物)与第二活性剂的组合治疗癌症的方法，其中该第二活性剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼(trametinib))、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼(ibrutinib))、mtor抑制剂(例如，依维莫司(everolimus))、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼(linsitinib))、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索(selinexor))、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他(pinometostat))、ezh2抑制剂(例如，他泽司他(tazemetostat)、unc1999或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼(fedratinib))、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0013]
还提供了药物组合物用于在本文提供的方法中使用，这些药物组合物配制用于通过合适的途径和手段施用并含有有效浓度的本文提供的化合物，例如，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、或化合物7，或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，且任选地包含至少一种药物载体。在一个实施例中，药物组合物递送有效治疗癌症的量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。
[0014]
在一个实施例中，癌症是血液恶性肿瘤。在一个实施例中，癌症是多发性骨髓瘤(mm)。
[0015]
本文提供的化合物或组合物或其药学上可接受的衍生物可以在彼此以及上述疗法中的一种或多种施用时同时施用、在彼此以及上述疗法中的一种或多种施用之前施用、或在彼此以及上述疗法中的一种或多种施用之后施用。
[0016]
当参考以下详细说明时，本文所述的主题的这些和其他方面将变得显而易见。
6.附图说明
[0017]
图1a至1d分别显示了plk1与mmrf中的pfs、mmrf中的os、mm010中的pfs、和mm010中的os的关系。
[0018]
图1e显示了复发的患者中plk1表达显著上调。
[0019]
图1f显示了plk1在mm疾病进展和复发的各个阶段的表达模式。
[0020]
图2a和图2b分别显示了泊马度胺(pomalidomide)治疗对ejm和ejm/pr细胞系中的plk1水平及其下游效应子pcdc25c和cdc25c的影响。
[0021]
图2c显示了泊马度胺和化合物5治疗对mm1.s细胞系中plk1水平及其下游效应子pcdc25c和cdc25c的影响。
[0022]
图2d显示了泊马度胺治疗对mm1.s细胞中plk1转录物水平的影响；图2e显示了泊马度胺治疗对aiolos和ikaros与plk1的转录起始位点(tss)的结合的影响。
[0023]
图2f显示了aiolos和ikaros敲低均导致plk1水平降低。
[0024]
图3显示了用诺考达唑(nocodazole)和化合物5及其组合治疗细胞后plk1信号传导的变化。
[0025]
图4a显示了六个泊马度胺敏感和耐药等基因细胞系对中plk1、cdc25c和pcdc25c以及小脑蛋白(cereblon)的水平。
[0026]
图4b显示了六个泊马度胺耐药细胞系中的五个中g2-m细胞的比例增加。
[0027]
图5a显示了用化合物5与bi2536的组合治疗amo1细胞系；图5b显示了相应的组合指数值；图5c显示了用化合物5与bi2536的组合治疗amo1-pr细胞系的效果；并且图5d显示了相应的组合指数值。
[0028]
图5e显示了用化合物5与bi2536的组合治疗k12pe细胞系；图5f显示了相应的组合指数值；图5g显示了用化合物5与bi2536的组合治疗k12pe/pr细胞系的效果；并且图5h显示了相应的组合指数值。
[0029]
图5i和图5j分别显示了化合物5与bi2536的组合对amo1和amo1-pr细胞中早期和晚期细胞凋亡的影响。
[0030]
图5k显示了治疗后响应于bi2536和化合物5的amo1和amo1-pr细胞系中ikaros和促生存信号传导的变化。
[0031]
图6a显示了用化合物5与bi2536的组合治疗mc-car细胞；图6b显示了相应的组合指数值。
[0032]
图6c显示了治疗后响应于bi2536和化合物5的mc-car细胞系中aiolos和ikaros水平的变化。
[0033]
图7a显示了携带双等位基因p53的患者表现出明显升高的plk1表达。
[0034]
图7b显示了bi2536在双等位基因p53细胞系k12pe和p53野生型amo1细胞中的影响。
[0035]
图8a和图8b分别显示了e2f2、cks1b、top2a和nuf2在mdms8样细胞系中在蛋白质和转录物表达水平方面上调。
[0036]
图9a至图9d分别显示了cks1b与os的关系、cks1b与pfs的关系、e2f2与os的关系、和e2f2与pfs的关系。
[0037]
图9e显示了cks1b和e2f2的敲低表现出增殖显著减少和细胞凋亡增加。
[0038]
图10a和图10b分别显示了brd4抑制剂对df15pr和h929细胞系中的cks1b和e2f2及其靶基因的影响。
[0039]
图10c至图10f分别显示了brd4抑制剂对df15pr细胞系中cks1b转录物水平、df15pr细胞系中e2f2转录物水平、h929细胞系中cks1b转录物水平和h929细胞系中e2f2转录物水平的影响。
[0040]
图11a和图11b分别显示了靶向brd4的四种不同的shrna在k12pe和df15pr细胞系中一致表现出cks1b和e2f2水平降低；图11c和图11d分别显示了所有四种shrna在k12pe和mdms8样细胞中引起了细胞增殖的显著降低。
[0041]
图12显示了泊马度胺对pom敏感和耐药细胞系中cks1b和e2f2的影响。
[0042]
图13a显示了用len与jq1的组合治疗k12pe细胞系；图13b显示了相应的组合指数值；图13c显示了用pom与jq1的组合治疗k12pe细胞系；图13d显示了相应的组合指数值；图13e显示了用化合物5与jq1的组合治疗k12pe细胞系；图13f显示了相应的组合指数值；图13g显示了用化合物6与jq1的组合治疗k12pe细胞系；图13h显示了相应的组合指数值。
[0043]
图13i显示了用len与jq1的组合治疗k12pe/pr细胞系；图13j显示了相应的组合指数值；图13k显示了用pom与jq1的组合治疗k12pe/pr细胞系；图13l显示了相应的组合指数值；图13m显示了用化合物5与jq1的组合治疗k12pe/pr细胞系；图13n显示了相应的组合指数值；图13o显示了用化合物6与jq1的组合治疗k12pe/pr细胞系；图13p显示了相应的组合指数值。
[0044]
图13q显示了jq1与len、pom、化合物5、和化合物6的组合治疗对aiolos、ikaros、cks1b、e2f2、myc、存活蛋白水平的影响。
[0045]
图14a和图14b分别显示了nek2表达与无进展生存期和总生存期的关系。
[0046]
图14c显示了复发的患者中nek2表达显著上调。
[0047]
图14d显示了泊马度胺耐药细胞系中nek2表达显著上调。
[0048]
图15a至15f分别显示了nek2与mmrf中的pfs、mmrf中的os、dfci中的pfs、dfci中的os、mm0010中的pfs、和mm0010中的os的关系。
[0049]
图16a显示了用化合物5与rac-cct 250863的组合治疗amo1细胞系；图16b显示了相应的组合指数值；图16c显示了用化合物5与rac-cct 250863的组合治疗amo1/pr细胞系；图16d显示了相应的组合指数值；图16e显示了用化合物6与rac-cct 250863的组合治疗amo1细胞系；图16f显示了相应的组合指数值；图16g显示了用化合物6与rac-cct 250863的组合治疗amo1/pr细胞系；图16h显示了相应的组合指数值；图16i显示了用化合物5与jh295的组合治疗amo1细胞系；图16j显示了相应的组合指数值；图16k显示了用化合物5与jh295的组合治疗amo1/pr细胞系；图16l显示了相应的组合指数值；图16m显示了用化合物6与
jh295的组合治疗amo1细胞系；图16n显示了相应的组合指数值；图16o显示了用化合物6与jh295的组合治疗amo1/pr细胞系；图16p显示了相应的组合指数值。
[0050]
图17显示了当nek2敲低与化合物5或化合物6组合时，凋亡细胞增加。
[0051]
图18a和图18b分别显示了曲美替尼与len的组合在amo1和amo1-pr细胞系中的影响；图18c和图18d分别显示了曲美替尼与pom的组合在amo1和amo1-pr细胞系中的影响；图18e和图18f分别显示了曲美替尼与化合物5的组合在amo1和amo1-pr细胞系中的影响；图18g和图18h分别显示了曲美替尼与化合物6的组合在amo1和amo1-pr细胞系中的影响。
[0052]
图19显示了曲美替尼与化合物6的组合在amo1-pr细胞系中协同降低erk、etv4和myc信号传导。
[0053]
图20a和图20b分别显示了曲美替尼与化合物6的组合在第3天和第5天对amo1和amo1-pr细胞系中细胞凋亡的影响。
[0054]
图21a和图21b分别显示了曲美替尼与化合物6的组合在第3天和第5天对amo1-pr细胞系中细胞周期的影响。
[0055]
图22a和图22b分别显示了birc5高表达的患者表现出较差的pfs和os。
[0056]
图23a显示了几个泊马度胺耐药细胞系表现出birc5的表达增加；图23b显示了在48和72小时，响应于化合物5治疗，birc5水平降低，随后mm1.s细胞系开始细胞凋亡。
[0057]
图24a显示了用化合物5与ym155的组合治疗amo1细胞系；图24b显示了相应的组合指数值；图24c显示了用化合物5与ym155的组合治疗amo1/pr细胞系；图24d显示了相应的组合指数值；图24e显示了用化合物6与ym155的组合治疗amo1细胞系；图24f显示了相应的组合指数值；图24g显示了用化合物6与ym155的组合治疗amo1/pr细胞系；图24h显示了相应的组合指数值。
[0058]
图25a显示了birc5敲低降低了amo1-pr细胞的增殖；图25b显示了birc5敲低也下调了高风险相关基因foxm1的表达。
[0059]
图26a显示了高风险相关基因birc5和foxm1在骨髓瘤基因组项目中表现出显著的共表达，表明它们的共调节；图26b显示了ym155对birc5的抑制也以剂量依赖性方式下调amo1-pr和k12pe-pr细胞系中foxm1的表达。
具体实施方式
[0060]
a.定义
[0061]
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。所有专利、申请、公开的申请和其他出版物均通过引用以其整体并入。本文中的一个术语有多种定义时，除非另有说明，否则以本节中的定义为准。
[0062]
如本文以及说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另外清楚地指出，否则不定冠词“一个/种(a/an)”和定冠词“该/这些(the)”包括复数和单数指代物。
[0063]
如本文所用，术语“包含(comprising)”和“包括(including)”可互换使用。术语“包含”和“包括”应被解释为指定所提及的所声明的特征或组分的存在，但不排除一个或多个特征或组分或其组的存在或添加。另外，术语“包含”和“包括”旨在包括术语“由
……
组成”涵盖的实例。因此，可以使用术语“由
……
组成”来替代术语“包含”和“包括”，以提供本发明的更特定的实施例。
[0064]
术语“由
……
组成”意指主题具有其所声明的组成的特征或组分的至少90％、95％、97％、98％或99％。在另一个实施例中，术语“由
……
组成”从任何后接阐述的范围中排除任何其他特征或组分，除了那些对于要实现的技术效果不重要的特征或组分。
[0065]
如本文所用，术语“或”应被解释为包含性的“或”，意指任何一个或任何组合。因此，“a、b或c”意指以下中的任一个：“a；b；c；a和b；a和c；b和c；a、b和c”。只有当元素、功能、步骤或行为的组合以某种方式内在地相互排斥时，才会出现此定义的例外。
[0066]
如本文所用且除非另外说明，当结合组合物或剂型的成分的剂量、量或重量百分比使用时，术语“约”和“大约(approximately)”意指本领域普通技术人员公认的提供与从指定剂量、量或重量百分比获得的药理作用等效的药理作用的剂量、量或重量百分比。在某些实施例中，在本文上下文中使用时，术语“约”和“大约”考虑在指定剂量、量或重量百分比的30％、20％、15％、10％或5％范围内的剂量、量或重量百分比。
[0067]
如本文所用且除非另外说明，术语“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的相对无毒的酸(包括无机酸和有机酸)制备的盐。在某些实施例中，合适的酸包括但不限于乙酸、己二酸、4-氨基水杨酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑酸、樟脑磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、碳酸、柠檬酸、环己基氨基磺酸、二氢磷酸、2,5-二羟基苯甲酸(龙胆酸)、1,2-乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、半乳糖醛酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、乙醇酸、马尿酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸、异丁酸、羟乙基磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、单氢碳酸、单氢磷酸、单氢硫酸、粘液酸、1,5-萘二磺酸、烟酸、硝酸、草酸、扑酸、泛酸、磷酸、邻苯二甲酸、丙酸、焦谷氨酸、水杨酸、辛二酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、甲苯磺酸等(参见例如，s.m.berge等人,j.pharm.sci.[药物科学杂志]，66:1-19(1977)；和handbook of pharmaceutical salts:properties,selection and use[药用盐手册：特性、选择和使用],p.h.stahl和c.g.wermuth编辑,(2002),wiley[威利公司],weinheim[魏因海姆])。在某些实施例中，合适的酸是强酸(例如，pka小于约1)，包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸、萘二磺酸、吡啶-磺酸、或其他取代的磺酸。还包括具有酸性特征的其他相对无毒的化合物的盐，这些化合物包括氨基酸(如天冬氨酸等)和其他化合物(如阿司匹林、布洛芬、糖精等)。酸加成盐可通过使化合物的中性形式与足量的所需酸(纯酸或在合适的溶剂中)接触而获得。
[0068]
如本文所用且除非另外说明，术语活性化合物的“前药”是指在体内转化而产生该活性化合物或该活性化合物的药学上可接受的形式的化合物。当施用于受试者时，前药可以是无活性的，但在体内例如通过水解(例如，在血液中水解)转化成活性化合物。前药包括其中羟基、氨基或巯基基团与任何基团结合的化合物，当活性化合物的前药施用于受试者时，这些基团分别裂解以形成游离羟基、游离氨基或游离巯基基团。
[0069]
如本文所用且除非另外说明，术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅在原子在空间中排列方式上不同的异构体。“阻转异构体”是单键旋转受阻产生的立体异构体。“对映异构体”是互为不可重叠镜像的一对立体异构体。一对对映异构体以任何比例的混合物可以称为“外消旋”混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子，但彼此不互为镜像的立体异构体。绝对立体化学可以根据cahn-ingold-prelog r-s系统指定。当化合物是对映异构体时，每个手性碳处的立体化学可以由r或s指定。绝对构型未知的拆分化合物可以根据其在钠d线的波长下绕平面偏振光旋转的方向(右旋或左旋)
而标为(+)或(-)。然而，旋光性符号(+)和(-)与分子的绝对构型r和s无关。本文所述的某些化合物含有一个或多个不对称中心，因此可产生对映异构体、非对映异构体和可根据每个不对称原子的绝对立体化学定义为(r)-或(s)-的其他立体异构体形式。本发明的化学实体、药物组合物和方法意指包括所有此类可能的异构体，包括外消旋混合物、基本上光学纯的形式和中间体混合物。光学活性(r)-和(s)-异构体可以例如使用手性合成子或手性试剂来制备，或使用常规技术来拆分。
[0070]“立体异构体”还可以包括e和z异构体或其混合物，以及顺式和反式异构体或其混合物。在某些实施例中，本文所述的化合物分离为e或z异构体。在其他实施例中，本文所述的化合物是e和z异构体的混合物。
[0071]“互变异构体”是指彼此平衡的化合物的异构体形式。异构体形式的浓度将取决于在其中发现化合物的环境并且可以根据例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而不同。例如，在水溶液中，吡唑可能表现出以下异构体形式，它们被称为彼此的互变异构体：
[0072][0073]
还应注意，本文所述的化合物可在一个或多个原子上含有非天然比例的原子同位素。例如，这些化合物可以用放射性同位素进行放射性标记，例如像氚(3h)、碘-125(
125
i)、硫-35(
35
s)、或碳-14(
14
c)，或者可以是同位素富集的，例如氘(2h)、碳-13(
13
c)或氮-15(
15
n)富集的。如本文所用，“同位素体(isotopolog)”是同位素富集的化合物。术语“同位素富集的”是指具有不同于该原子的天然同位素组成的同位素组成的原子。“同位素富集的”还可以指含有至少一个具有不同于该原子的天然同位素组成的同位素组成的原子的化合物。术语“同位素组成”是指给定原子存在的每种同位素的量。放射性标记的和同位素富集的化合物可用作治疗剂(例如，癌症治疗剂)、研究试剂(例如，结合测定试剂)和诊断剂(例如，体内显像剂)。本文所述的化合物的所有同位素变体，无论是否具有放射性，都旨在涵盖在如本文提供的实施例的范围内。在一些实施例中，提供了本文所述的化合物的同位素体，例如，这些同位素体富含氘、碳-13和/或氮-15。如本文所用，“氘化的”意指其中至少一个氢(h)已被氘(由d或2h表示)替代的化合物，即该化合物在至少一个位置富含氘。
[0074]
需要注意的是，如果所描绘的结构与该结构的名称之间存在差异，则应以所描绘的结构为准。
[0075]
如本文所用且除非另有指示，术语“治疗”意指缓解(全部或部分)障碍、疾病或病症或者与障碍、疾病或病症相关的一种或多种症状，或者减缓或停止那些症状的进一步进展或恶化，或者缓解或根除障碍、疾病或病症本身的一个或多个病因。
[0076]
如本文所用且除非另有指示，术语“预防”意指延迟和/或阻止障碍、疾病或病症的全部或部分发作、复发或传播；阻止受试者患上障碍、疾病或病症；或降低受试者罹患障碍、疾病或病症的风险的方法。
[0077]
如本文所用且除非另有指示，术语“管理”涵盖预防曾患有特定疾病或障碍的患者的该特定疾病或障碍的复发，延长曾患有该疾病或障碍的患者保持缓解的时间，降低患者的死亡率，和/或维持与所管理的疾病或病症相关的症状的严重性降低或避免发生。
[0078]
如本文所用且除非另有指示，与化合物相关的术语“有效量”意指能够治疗、预防
或管理障碍、疾病或病症或其症状的量。
[0079]
如本文所用且除非另有指示，术语“受试者”或“患者”包括动物，包括但不限于动物如牛、猴、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔或豚鼠，在一个实施例中为哺乳动物，在另一个实施例中为人。
[0080]
如本文所用且除非另有指示，术语“复发”是指对治疗有响应(例如，达到完全响应)，然后出现进展的障碍、疾病或病症。治疗可以包括一线或多线疗法。在一个实施例中，该障碍、疾病或病症先前已经用一线或多线疗法治疗。在另一个实施例中，该障碍、疾病或病症先前已经用一线、二线、三线或四线疗法治疗。在一些实施例中，该障碍、疾病或病症是血液恶性肿瘤。
[0081]
如本文所用且除非另有指示，术语“难治性”是指对可以包括一线或多线疗法的先前治疗没有响应的障碍、疾病或病症。在一个实施例中，该障碍、疾病或病症先前已经用一线、二线、三线或四线疗法治疗。在一个实施例中，该障碍、疾病或病症先前已经用二线或更多线疗法治疗，并且对最近的含有全身疗法的方案未达到完全响应(cr)。在一些实施例中，该障碍、疾病或病症是血液恶性肿瘤。
[0082]
在癌症(例如血液恶性肿瘤)的上下文中，可通过以下情况来评估抑制：抑制疾病进展、抑制肿瘤生长、减少原发性肿瘤、缓解肿瘤相关症状、抑制肿瘤分泌因子、延缓原发性或继发性肿瘤的出现、减缓原发性或继发性肿瘤的发展、减少原发性或继发性肿瘤的发生、减缓或降低疾病继发效应的严重程度、阻止肿瘤生长和肿瘤消退、增加进展时间(ttp)、增加无进展生存期(pfs)、增加总生存期(os)等。本文所用的os意指从治疗开始到因任何病因死亡的时间。本文所用的ttp意指从治疗开始到肿瘤进展的时间；ttp不包括死亡。在一个实施例中，pfs意指从治疗开始到肿瘤进展或死亡的时间。在一个实施例中，pfs意指从第一剂化合物到第一次发生疾病进展或因任何病因死亡的时间。在一个实施例中，使用卡普兰-迈耶(kaplan-meier)估计来计算pfs率。无事件生存期(efs)意指从治疗开始到任何治疗失败(包括疾病进展、因任何原因中止治疗或死亡)的时间。在一个实施例中，总体响应率(orr)意指实现响应的患者的百分比。在一个实施例中，orr意指实现完全响应和部分响应的患者的百分比之和。在一个实施例中，orr意指最佳响应≥部分响应(pr)的患者的百分比。在一个实施例中，响应持续时间(dor)是从实现响应到复发或疾病进展的时间。在一个实施例中，dor是从实现响应≥部分响应(pr)到复发或疾病进展的时间。在一个实施例中，dor是从第一次记录响应到第一次记录疾病进展或死亡的时间。在一个实施例中，dor是从第一次记录响应≥部分响应(pr)到第一次记录疾病进展或死亡的时间。在一个实施例中，达响应时间(ttr)意指从第一剂化合物到第一次记录响应的时间。在一个实施例中，ttr意指从第一剂化合物到第一次记录响应≥部分响应(pr)的时间。在极端情况下，完全抑制在本文中称为预防或化学预防。在本文上下文中，术语“预防”包括完全预防临床上明显的癌症的发作，或预防癌症临床前明显阶段的发作。该定义还旨在涵盖预防转化为恶性细胞或阻止或逆转癌前细胞向恶性细胞的进展。这包括对那些有发展癌症风险的人进行预防性治疗。
[0083]
如本文所用，“多发性骨髓瘤”是指以恶性浆细胞为特征的血液学病症，并且包括以下障碍：意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(mgus)；低风险、中风险和高风险多发性骨髓瘤；新诊断的多发性骨髓瘤(包括低风险、中风险和高风险的新诊断的多发性骨髓瘤)；符合移植条件和不符合移植条件的多发性骨髓瘤；郁积型(惰性)多发性骨髓瘤(包括低风险、中
风险和高风险郁积型多发性骨髓瘤)；活动性多发性骨髓瘤；孤立性浆细胞瘤；髓外浆细胞瘤；浆细胞白血病；中枢神经系统多发性骨髓瘤；轻链骨髓瘤；非分泌型骨髓瘤；免疫球蛋白d骨髓瘤；和免疫球蛋白e骨髓瘤；以及以遗传异常，如细胞周期蛋白d易位(例如，t(11；14)(q13；q32)；t(6；14)(p21；32)；t(12；14)(p13；q32)；或t(6；20)；)、mmset易位(例如，t(4；14)(p16；q32))、maf易位(例如，t(14；16)(q32；q32)；t(20；22)；t(16；22)(q11；q13)；或t(14；20)(q32；q11))、或其他染色体因子(例如，缺失17p13或13号染色体；del(17/17p)、非超二倍体和增加(1q))为特征的多发性骨髓瘤。在一个实施例中，根据多发性骨髓瘤国际分期系统(iss)表征多发性骨髓瘤。在一个实施例中，多发性骨髓瘤是通过iss表征的i期多发性骨髓瘤(例如，血清β2微球蛋白《3.5mg/l且血清白蛋白≥3.5g/dl)。在一个实施例中，多发性骨髓瘤是通过iss表征的iii期多发性骨髓瘤(例如，血清β2微球蛋白》5.4mg/l)。在一个实施例中，多发性骨髓瘤是通过iss表征的ii期多发性骨髓瘤(例如，不是i期或iii期)。
[0084]
在某些实施例中，多发性骨髓瘤的治疗可以通过多发性骨髓瘤的国际统一响应标准(iurc)(参见durie bgm,harousseau j-l,miguel js,等人international uniform response criteria for multiple myeloma[多发性骨髓瘤的国际统一响应标准].leukemia[白血病],2006；(10)10:1-7)，使用以下所示的响应和终点定义来评估：
[0085]
[0086][0087]
缩写：cr，完全响应；flc，游离轻链；pr，部分响应；sd，疾病稳定；scr，严格的完全响应；vgpr，非常好的部分响应。
[0088]a所有响应类别都需要在建立任何新疗法之前任何时候进行两次连续评估；如果进行射线照相研究，则所有类别也不需要已知的进行性或新的骨病变的证据。射线照相研究不需要满足这些响应要求。
[0089]b不需要用重复骨髓活检来证实。
[0090]c克隆细胞的存在/不存在基于κ/λ比率。通过免疫组织化学和/或免疫荧光得到的异常κ/λ比率需要最少100个浆细胞用于分析。反映异常克隆存在的异常比率为κ/λ》4:1或《1:2。
[0091]d由以下测量结果中的至少一种定义的可测量的疾病：骨髓浆细胞≥30％；血清m蛋白≥1g/dl(≥10gm/l)[10g/l]；尿液m蛋白≥200mg/24h；血清flc测定：受累的flc水平≥10mg/dl(≥100mg/l)；条件是血清flc比率异常。
[0092]
如本文所用，ecog状态是指东部肿瘤协作组(eastern cooperative oncology group，ecog)体能状态(oken m,等人toxicity and response criteria of the eastern cooperative oncology group.[东部肿瘤协作组的毒性和响应标准]am j clin oncol[美国临床肿瘤学杂志]1982；5(6):649-655)，如下所示：
[0093][0094]
在某些实施例中，疾病稳定或其缺乏可以通过本领域已知的方法确定，如评估患者症状、体格检查、已成像的肿瘤的可视化，例如使用fdg-pet(氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描)、pet/ct(正电子发射断层扫描/计算机断层扫描)扫描、脑和脊柱的mri(磁共振成像)、csf(脑脊液)、眼科检查、玻璃体液取样、视网膜相片、骨髓评估和其他普遍接受的评估方式。
[0095]
如本文所用且除非另有指示，术语“共同施用”和“与
……
组合”包括同时、并行或依次施用一种或多种治疗剂(例如，本文提供的化合物和另一种抗癌剂或支持性护理剂)，没有特定的时间限制。在一个实施例中，这些药剂同时存在于细胞中或患者体内，或同时发挥其生物学或治疗作用。在一个实施例中，这些治疗剂在同一组合物或单位剂型中。在另一个实施例中，这些治疗剂在分开的组合物或单位剂型中。
[0096]
术语“支持性护理剂”是指治疗、预防或管理因使用另一种治疗剂治疗产生的不良影响的任何物质。
[0097]
如本文所用，“诱导疗法”是指针对疾病给予的第一治疗，或旨在诱导疾病(如癌症)的完全缓解而给予的第一治疗。当单独使用时，诱导疗法是一种公认的最佳可用治疗。如果检测到残留癌症，则患者用另一种疗法(称为再诱导)治疗。如果患者在诱导疗法后完全缓解，则给予另外的巩固和/或维持疗法，以延长缓解期或潜在地治愈患者。
[0098]
如本文所用，“巩固疗法”是指首次实现缓解后针对疾病给予的治疗。例如，针对癌症的巩固疗法是在初始疗法后癌症消失后给予的治疗。巩固疗法可包括放射疗法、干细胞移植或用癌症药物疗法治疗。巩固疗法也称为强化疗法和缓解后疗法。
[0099]
如本文所用，“维持疗法”是指在达到缓解或最佳响应后为了预防或延迟复发而针对疾病给予的治疗。维持疗法可包括化疗、激素疗法或靶向疗法。
[0100]
如本文所用，“缓解”是癌症(例如多发性骨髓瘤)的体征和症状的减少或消失。在部分缓解中，癌症的部分但并非全部体征和症状消失。在完全缓解中，尽管癌症可能仍在体内，但癌症的所有体征和症状都消失了。
[0101]
如本文所用，“移植”是指伴随干细胞挽救的高剂量疗法。造血(血液)或骨髓干细胞不用于治疗，而是用于在高剂量疗法(例如高剂量化疗和/或放疗)后挽救患者。移植包括“自体”干细胞移植(asct)，这是指对患者自己的干细胞进行收获并将其用作替代细胞。在一些实施例中，移植还包括串联移植或多次移植。
[0102]
术语“生物疗法”是指施用生物治疗剂，如脐带血、干细胞、生长因子等。
[0103]
b.化合物
[0104]
提供了用于在本文提供的方法中使用的化合物4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(化合物1)：
[0105][0106]
或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物。如本文所用，化合物1也称为泊马度胺或pom。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物1。
[0107]
还提供了用于在本文提供的方法中使用的化合物3-(4-氨基-1-氧代-1,3二氢-异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮(化合物2)：
[0108][0109]
或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物。如本文所用，化合物2也称为来那度胺(lenalidomide)或len。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物2。
[0110]
还提供了用于在本文提供的方法中使用的化合物2-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-1h-异吲哚-1,3(2h)-二酮(化合物3)：
[0111][0112]
或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物。如本文所用，化合物3也称为沙利度胺(thalidomide)或thal。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物3。
[0113]
还提供了用于在本文提供的方法中使用的化合物3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代-4h-喹唑啉-3-基)-哌啶-2,6-二酮(化合物4)：
[0114][0115]
或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物。用于制备化合物4的方法描述于美国专利号7,635,700中，该专利通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，本文提供的方法中使
用了化合物4。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物4的盐酸盐。
[0116]
还提供了用于在本文提供的方法中使用的化合物(s)-3-(4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧基)-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(化合物5)：
[0117][0118]
或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物。用于制备化合物5的方法描述于美国专利号8,518,972中，该专利通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物5。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物5的盐酸盐。
[0119]
还提供了用于在本文提供的方法中使用的化合物(s)-4-(4-(4-(((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)甲基)苄基)哌嗪-1-基)-3-氟苯甲腈(化合物6)：
[0120][0121]
或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物。用于制备化合物6的方法描述于美国专利号10,357,489中，该专利通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物6。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物6的氢溴酸盐。
[0122]
还提供了用于在本文提供的方法中使用的化合物2-(4-氯苯基)-n-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺(化合物7)：
[0123][0124]
或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物。用于制备化合物7的方法描述于美国专利号9,499,514中，该专利通过引用以其整体并入本文。在一个实施例中，本文提供的方法中使用了化合物7。
[0125]
在一个实施例中，本文提供的方法中使用了这些化合物的同位素富集的类似物。
[0126]
c.第二活性剂
[0127]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为polo样激酶1(plk1)抑制剂。在一个实施例中，plk1抑制剂为bi2536、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变
异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，plk1抑制剂为bi2536。bi2536具有化学名称(r)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基-n-(1-甲基哌啶-4-基)苯甲酰胺，并且具有如下结构：
[0128][0129]
在一个实施例中，plk1抑制剂为伏拉塞替(volasertib)、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，plk1抑制剂为伏拉塞替。伏拉塞替(也称为bi6727)具有如下结构：
[0130][0131]
在一个实施例中，plk1抑制剂为cyc140、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。
[0132]
在一个实施例中，plk1抑制剂为昂万塞替(onvansertib)、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，plk1抑制剂为昂万塞替。昂万塞替(也称为nms-1286937)具有如下结构：
[0133][0134]
在一个实施例中，plk1抑制剂为gsk461364、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，plk1抑制剂为gsk461364。gsk461364具有如下结构：
[0135][0136]
在一个实施例中，plk1抑制剂为tak960、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，plk1抑制剂为tak960。在一个实施例中，plk1抑制剂为tak960的盐酸盐。tak960具有如下结构：
[0137][0138]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为溴结构域蛋白4(bromodomain 4，brd4)抑制剂。brd4是bet(溴结构域和超末端结构域)家族的成员。在一个实施例中，brd4抑制剂为jq1、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，brd4抑制剂为jq1。jq1具有化学名称(s)-叔丁基2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂卓-6-基)乙酸酯，并且具有如下结构：
[0139][0140]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为bet抑制剂。在一个实施例中，bet抑制剂为比拉瑞塞(birabresib)、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，bet抑制剂为比拉瑞塞。比拉瑞塞(也称为otx015或mk-8628)具有化学名称(s)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6h-噻吩并[3,2-f][1,2,4]三唑并[4,3-a][1,4]二氮杂卓-6-基)-n-(4-羟基苯基)乙酰胺，并且具有如下结构：
[0141][0142]
在一个实施例中，bet抑制剂为化合物a、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，bet抑制剂为化合物a。化合物a具有化学名称4-[2-(环丙基甲氧基)-5-(甲磺酰基)苯基]-2-甲基异喹啉-1(2h)-酮，并且具有如下结构：
[0143][0144]
在一个实施例中，bet抑制剂为bms-986158、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，bet抑制剂为bms-986158。bms-986158具有如下结构：
[0145][0146]
在一个实施例中，bet抑制剂为ro-6870810、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，bet抑制剂为ro-6870810。ro-6870810具有如下结构：
[0147][0148]
在一个实施例中，bet抑制剂为cpi-0610、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，bet抑制剂为cpi-0610。cpi-0610具有如下结构：
[0149][0150]
在一个实施例中，bet抑制剂为莫利布雷昔布(molibresib)、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，bet抑制剂为莫利布雷昔布。莫利布雷昔布(也称为gsk-525762)具有如下结构：
[0151][0152]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶(nek2)抑制剂。在一个实施例中，nek2抑制剂为jh295、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，nek2抑制剂为jh295。jh295具有化学名称(z)-n-(3-((2-乙基-4-甲基-1h-咪唑-5-基)亚甲基)-2-氧代吲哚啉-5-基)丙炔酰胺，并且具有如下结构：
[0153][0154]
在一个实施例中，nek2抑制剂为rac-cct 250863、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，nek2抑制剂为rac-cct 250863。rac-cct 250863具有化学名称4-[2-氨基-5-[4-[(二甲基氨基)甲基]-2-噻吩基]-3-吡啶基]-2-[[(2z)-4,4,4-三氟-1-甲基-2-丁烯-1-基]氧基]苯甲酰胺，并且具有如下结构：
[0155][0156]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为极光激酶b(aurora kinase b，aurkb)抑制剂。在一个实施例中，aurkb抑制剂为巴拉塞替(barasertib)(也称为azd1152)或azd1152-hqpa，或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，aurkb抑制剂为巴拉塞替。在一个实施例中，aurkb抑制剂为azd1152-hqpa。azd1152-hqpa(也称为azd2811)具有化学名称2-(3-((7-(3-(乙基(2-羟乙基)氨基)丙氧基)喹唑啉-4-基)氨基)-1h-吡唑-5-基)-n-(3-氟苯基)乙酰胺，并且具有如下结构：
[0157][0158]
巴拉塞替为azd1152-hqpa的磷酸二氢盐前药，并且具有如下结构：
[0159][0160]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为阿立塞替(alisertib)、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为阿立塞替。阿立塞替具有化学名称4-((9-氯-7-(2-氟-6-甲氧基苯基)-5h-苯并[c]嘧啶并[4,5-e]氮杂卓-2-基)氨基)-2-甲氧基苯甲酸，并且具有如下结构：
[0161]
[0162]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为达鲁舍替(danusertib)、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，aurkb抑制剂为达鲁舍替。达鲁舍替(也称为pha-739358)具有如下结构：
[0163][0164]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为at9283、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为at9283。at9283具有如下结构：
[0165][0166]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为pf-03814735、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，aurkb抑制剂为pf-03814735。pf-03814735具有如下结构：
[0167][0168]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为amg900、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为amg900。amg900具有如下结构：
[0169][0170]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为托扎舍替(tozasertib)、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为托扎舍替。托扎舍替(也称为vx-680或mk-0457)具有如下结构：
[0171][0172]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为zm447439、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为zm447439。zm447439具有如下结构：
[0173][0174]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为mln8054、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为mln8054。mln8054具有如下结构：
[0175][0176]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为hesperadin、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为hesperadin。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为hesperadin的盐酸盐。hesperadin具有如下结构：
[0177][0178]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为sns-314、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为sns-314。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为sns-314的甲磺酸盐。sns-314具有如下结构：
[0179]
[0180]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为pha-680632、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为pha-680632。pha-680632具有如下结构：
[0181][0182]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为cyc116、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为cyc116。cyc116具有如下结构：
[0183][0184]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为gsk1070916、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为gsk1070916。gsk1070916具有如下结构：
[0185][0186]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为tak-901、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为tak-901。tak-901具有如下结构：
[0187][0188]
在一个实施例中，aurkb抑制剂为cct137690、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，极光a激酶抑制剂为cct137690。cct137690具有如下结构：
[0189][0190]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mek)抑制剂。在一个实施例中，mek抑制剂中断raf/ras/mek信号转导级联的功能。在一个实施例中，mek抑制剂为曲美替尼、曲美替尼二甲基亚砜、考比替尼(cobimetinib)、比美替尼(binimetinib)、或司美替尼(selumetinib)，或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，mek抑制剂为曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，mek抑制剂为曲美替尼。在一个实施例中，mek抑制剂为曲美替尼二甲基亚砜。在一个实施例中，mek抑制剂为考比替尼。在一个实施例中，mek抑制剂为比美替尼。在一个实施例中，mek抑制剂为司美替尼。曲美替尼二甲基亚砜具有化学名称n-[3-[3-环丙基-5-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-3,4,6,7-四氢-6,8-二甲基-2,4,7-三氧代吡啶并[4,3-d]嘧啶-1(2h)-基]苯基]-乙酰胺，为与二甲基亚砜的化合物(1:1)。曲美替尼二甲基亚砜具有如下结构：
[0191][0192]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为phd指蛋白19(phf19)抑制剂。
[0193]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为布鲁顿酪氨酸激酶(btk)抑制剂。在一个实施例中，btk抑制剂为依鲁替尼、或阿卡替尼(acalabrutinib)，或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，btk抑制剂为依鲁替尼、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，btk抑制剂为依鲁替尼。在一个实施例中，btk抑制剂为阿卡替尼。依鲁替尼具有化学名称1-[(3r)-3-[4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基]-1-哌啶基]-2-丙烯-1-酮，并且具有如下结构：
[0194][0195]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mtor)抑制剂。在一个实施例中，mtor抑制剂为雷帕霉素或其类似物(也称为雷帕霉素类似物(rapalog))。在一个实施例中，mtor抑制剂为依维莫司、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，mtor抑制剂为依维莫司。依维莫司具有化学名称40-o-(2-羟乙基)-雷帕霉素，并且具有如下结构：
[0196][0197]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为莫洛尼鼠白血病激酶的前病毒整合位点(pim)抑制剂。在一个实施例中，pim抑制剂为泛pim抑制剂。在一个实施例中，pim抑制剂为lgh-447、azd1208、sgi-1776、或tp-3654，或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，pim抑制剂为lgh-447、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，pim抑制剂为lgh-447。在一个实施例中，pim抑制剂为lgh-447的药学上可接受的盐。在一个实施例中，pim抑制剂为lgh-447的盐酸盐。在一个实施例中，lgh-447的盐酸盐为二盐酸盐。在一个实施例中，lgh-447的盐酸盐为单盐酸盐。在一个实施例中，pim抑制剂为azd1208。在一个实施例中，pim抑制剂为sgi-1776。在一个实施例中，pim抑制剂为tp-3654。lgh-447具有化学名称n-[4-[(1r,3s,5s)-3-氨基-5-甲基环己基]-3-吡啶基]-6-(2,6-二氟苯基)-5-氟-2-吡啶甲酰胺，并且具有如下结构：
[0198]
[0199]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为胰岛素样生长因子1受体(igf-1r)抑制剂。在一个实施例中，igf-1r抑制剂为林西替尼、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，igf-1r抑制剂为林西替尼。林西替尼具有化学名称顺式-3-[8-氨基-1-(2-苯基-7-喹啉基)咪唑并[1,5-a]吡嗪-3-基]-1-甲基环丁醇，并且具有如下结构：
[0200][0201]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为输出蛋白1(xpo1)抑制剂。在一个实施例中，xpo1抑制剂为塞利尼索、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，xpo1抑制剂为塞利尼索。塞利尼索具有化学名称(2z)-3-{3-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1h-1,2,4-三唑-1-基}-n
’‑
(吡嗪-2-基)丙-2-烯酰肼，并且具有如下结构：
[0202][0203]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为类端粒沉默干扰体1(dot1l)抑制剂。在一个实施例中，dot1l抑制剂为sgc0946、或匹诺司他，或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，dot1l抑制剂为sgc0946、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，dot1l抑制剂为sgc0946。sgc0946具有化学名称5溴-7-[5-脱氧-5-[[3-[[[[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]氨基]羰基]氨基]丙基](1-甲基乙基)氨基]-β-d-呋喃核糖基]-7h-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺，并且具有如下结构：
[0204][0205]
在一个实施例中，dot1l抑制剂为匹诺司他、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，dot1l抑制剂为匹诺司他。
匹诺司他(也称为epz-5676)具有化学名称(2r,3r,4s,5r)-2-(6-氨基-9h-嘌呤-9-基)-5-((((1r,3s)-3-(2-(5-(叔丁基)-1h-苯并[d]咪唑-2-基)乙基)环丁基)(异丙基)氨基)甲基)四氢呋喃-3,4-二醇，并且具有如下结构：
[0206][0207]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为zeste同源物增强子2(ezh2)抑制剂。在一个实施例中，ezh2抑制剂为他泽司他、3-去氮腺嘌呤(deazaneplanocin)a(dznep)、epz005687、ei1、gsk126、unc1999、cpi-1205、或西奈芬净(sinefungin)，或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，ezh2抑制剂为他泽司他、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，ezh2抑制剂为他泽司他。在一个实施例中，ezh2抑制剂为3-去氮腺嘌呤a。在一个实施例中，ezh2抑制剂为epz005687。在一个实施例中，ezh2抑制剂为ei1。在一个实施例中，ezh2抑制剂为gsk126。在一个实施例中，ezh2抑制剂为西奈芬净。他泽司他(也称为epz-6438)具有化学名称n-[(1,2-二氢-4,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶基)甲基]-5-[乙基(四氢-2h-吡喃-4-基)氨基]-4-甲基-4
’‑
(4-吗啉基甲基)-[1,1
’‑
联苯]-3-甲酰胺，并且具有如下结构：
[0208][0209]
在一个实施例中，ezh2抑制剂为unc1999、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，ezh2抑制剂为unc1999。unc1999具有化学名称1-异丙基-6-(6-(4-异丙基哌嗪-1-基)吡啶-3-基)-n-((6-甲基-2-氧代-4-丙基-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-1h-吲唑-4-甲酰胺，并且具有如下结构：
[0210]
[0211]
在一个实施例中，ezh2抑制剂为cpi-1205、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，ezh2抑制剂为cpi-1205。cpi-1205具有化学名称(r)-n-((4-甲氧基-6-甲基-2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-1h-吲哚-3-甲酰胺，并且具有如下结构：
[0212][0213]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为janus激酶2(jak2)抑制剂。在一个实施例中，jak2抑制剂为菲卓替尼、鲁索替尼(ruxolitinib)、巴瑞替尼(baricitinib)、冈多替尼(gandotinib)、来妥替尼(lestaurtinib)、莫洛替尼(momelotinib)、或帕瑞替尼(pacritinib)，或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，jak2抑制剂为菲卓替尼、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，jak2抑制剂为菲卓替尼。在一个实施例中，jak2抑制剂为鲁索替尼。在一个实施例中，jak2抑制剂为巴瑞替尼。在一个实施例中，jak2抑制剂为冈多替尼。在一个实施例中，jak2抑制剂为来妥替尼。在一个实施例中，jak2抑制剂为莫洛替尼。在一个实施例中，jak2抑制剂为帕瑞替尼。菲卓替尼具有化学名称n-叔丁基-3-[(5-甲基-2-{4-[2-(吡咯烷-1-基)乙氧基]苯胺基}嘧啶-4-基)氨基]苯磺酰胺，并且具有如下结构：
[0214][0215]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为存活蛋白(也称为含杆状病毒凋亡抑制因子重复蛋白5(baculoviral inhibitor of apoptosis repeat-containing 5)或birc5)抑制剂。在一个实施例中，birc5抑制剂为ym155、或其互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，birc5抑制剂为ym155。ym155具有化学名称1-(2-甲氧基乙基)-2-甲基-4,9-二氧代-3-(吡嗪-2-基甲基)-4,9-二氢-1h-萘并[2,3-d]咪唑-3-鎓溴化物，并且具有如下结构：
[0216][0217]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为dna甲基转移酶抑制剂。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂为阿扎胞苷、或其立体异构体、立体异构体混合物、互变异构体、同位素体、或药学上可接受的盐。在一个实施例中，低甲基化剂为阿扎胞苷。阿扎胞苷(也称为氮杂胞苷或5-氮杂胞苷)具有化学名称4-氨基-l-β-d-呋喃核糖基-1,3,5-三嗪-2(1h)-酮，并且具有如下结构：
[0218][0219]
d.使用方法
[0220]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物1、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，与第二药剂的组合，其中该第二药剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0221]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物2、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与第二药剂的组合，其中该第二药剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0222]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物3、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异
构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与第二药剂的组合，其中该第二药剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0223]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物4、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与第二药剂的组合，其中该第二药剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0224]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与第二药剂的组合，其中该第二药剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0225]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与第二药剂的组合，其中该第二药剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0226]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的患者施用
治疗有效量的化合物7、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与第二药剂的组合，其中该第二药剂是plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)中的一种或多种。
[0227]
在一个实施例中，癌症是血液恶性肿瘤。
[0228]
在一个实施例中，癌症为白血病。在一个实施例中，癌症为急性髓系白血病。在一个实施例中，该急性髓系白血病为b-细胞急性髓系白血病。在一个实施例中，癌症为急性淋巴细胞白血病。在一个实施例中，癌症为慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤。
[0229]
在一个实施例中，癌症为b细胞恶性肿瘤。
[0230]
在一个实施例中，癌症为淋巴瘤。在一个实施例中，癌症为非霍奇金淋巴瘤。在一个实施例中，癌症为弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcl)。在一个实施例中，癌症为套细胞淋巴瘤(mcl)。在一个实施例中，癌症为边缘区淋巴瘤(mzl)。在一个实施例中，该边缘区淋巴瘤为脾边缘区淋巴瘤(smzl)。在一个实施例中，癌症为惰性滤泡性细胞淋巴瘤(ifcl)。在一个实施例中，癌症为伯基特淋巴瘤。
[0231]
在一个实施例中，癌症为t细胞淋巴瘤。在一个实施例中，该t细胞淋巴瘤为间变性大细胞淋巴瘤(alcl)。在一个实施例中，该t细胞淋巴瘤为塞扎里综合征(sezary syndrome)。
[0232]
在一个实施例中，癌症为霍奇金淋巴瘤。
[0233]
在一个实施例中，癌症为骨髓增生异常综合征。
[0234]
在一个实施例中，癌症为骨髓瘤。在一个实施例中，癌症为多发性骨髓瘤。在一个实施例中，多发性骨髓瘤为浆细胞白血病(pcl)。
[0235]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤为新诊断的多发性骨髓瘤。
[0236]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤是复发性的或难治性的。在一个实施例中，多发性骨髓瘤对来那度胺难治。在一个实施例中，多发性骨髓瘤对泊马度胺难治。在一个实施例中，多发性骨髓瘤对与蛋白酶体抑制剂组合使用的泊马度胺难治。在一个实施例中，蛋白酶体抑制剂选自硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)和伊沙佐米(ixazomib)。在一个实施例中，多发性骨髓瘤对与炎性类固醇组合使用的泊马度胺难治。在一个实施例中，炎性类固醇选自地塞米松或泼尼松(prednisone)。在一个实施例中，多发性骨髓瘤对与cd38导向的单克隆抗体组合使用的泊马度胺难治。
[0237]
在一个实施例中，本文提供了用于在患者中实现完全响应、部分响应或疾病稳定的方法，这些方法包括向患有本文提供的癌症的患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。
[0238]
在一个实施例中，本文还提供了用于诱导患者的治疗响应的方法，该治疗响应用多发性骨髓瘤的国际统一响应标准(iurc)(参见durie bgm,harousseau j-l,miguel js,
等人international uniform response criteria for multiple myeloma.[多发性骨髓瘤的国际统一响应标准]leukemia[白血病],2006；(10)10:1-7)评估，这些方法包括向患有多发性骨髓瘤的患者施用有效量的或治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。
[0239]
在另一个实施例中，本文提供了用于在患者中实现严格完全响应、完全响应或非常好的部分响应(如通过多发性骨髓瘤的国际统一响应标准(iurc)所确定的)的方法，这些方法包括向患有多发性骨髓瘤的患者施用有效量的或治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。
[0240]
在另一个实施例中，本文提供了用于在患者中实现总生存期、无进展生存期、无事件生存期、进展时间、或无疾病生存期增加的方法，这些方法包括向患有多发性骨髓瘤的患者施用有效量的或治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。
[0241]
在一个实施例中，本文提供了鉴定可能对治疗化合物与第二药剂的组合有响应的患有血液学癌症的受试者，或预测患有血液学癌症的受试者对治疗化合物与第二药剂的组合的响应性的方法，该方法包括：
[0242]
a.从该受试者获得样品；
[0243]
b.确定该样品中的生物标志物水平；
[0244]
c.如果该生物标志物水平相对于该生物标志物的参考水平是改变的水平，则诊断该受试者可能对该治疗化合物与该第二药剂的组合有响应。
[0245]
在一个实施例中，本文提供了选择性治疗患有血液学癌症的受试者的血液学癌症的方法，该方法包括：
[0246]
a.从该受试者获得样品；
[0247]
b.确定该样品中的生物标志物水平；
[0248]
c.如果该生物标志物水平相对于该生物标志物的参考水平是改变的水平，则诊断该受试者可能对该治疗化合物与该第二药剂的组合有响应；以及
[0249]
d.向被诊断为可能对该治疗化合物与该第二药剂的组合有响应的受试者施用治疗有效量的该治疗化合物与该第二药剂的组合。
[0250]
在一个实施例中，生物标志物是选自brd4、plk1、aurkb、phf19、nek2、mek、btk、mtor、pim、igf-1r、xpo1、dot1l、ezh2、jak2、和birc5的基因或基因组合的表达。
[0251]
在一个实施例中，改变的水平是相对于生物标志物的参考水平增加的水平。在一个实施例中，改变的水平是相对于生物标志物的参考水平降低的水平。
[0252]
在一个实施例中，治疗化合物为本文提供的化合物(例如，化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6、或化合物7，或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物)。
[0253]
在一个实施例中，第二药剂为本文提供的第二药剂：plk1抑制剂(例如，bi2536)、brd4抑制剂(例如，jq1)、bet抑制剂(例如，化合物a)、nek2抑制剂(例如，jh295)、aurkb抑制剂(例如，azd1152)、mek抑制剂(例如，曲美替尼)、phf19抑制剂、btk抑制剂(例如，依鲁替尼)、mtor抑制剂(例如，依维莫司)、pim抑制剂(例如，lgh-447)、igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)、xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)、dot1l抑制剂(例如，sgc0946或匹诺司他)、ezh2抑制剂(例如，他泽司他、unc1999、或cpi-1205)、jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)、birc5抑制剂(例
如，ym155)、或dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)。
[0254]
在一个实施例中，生物标志物为plk1的基因，治疗化合物为化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，并且第二药剂为plk1抑制剂。
[0255]
在一个实施例中，生物标志物为plk1的基因，治疗化合物为化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，并且第二药剂为plk1抑制剂。
[0256]
在一个实施例中，生物标志物为brd4的基因，治疗化合物为化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，并且第二药剂为brd4抑制剂。
[0257]
在一个实施例中，生物标志物为brd4的基因，治疗化合物为化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，并且第二药剂为brd4抑制剂。
[0258]
在一个实施例中，生物标志物为nek2的基因，治疗化合物为化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，并且第二药剂为nek2抑制剂。
[0259]
在一个实施例中，生物标志物为nek2的基因，治疗化合物为化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物，并且第二药剂为nek2抑制剂。
[0260]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与plk1抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1与bi2536的组合。
[0261]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与brd4抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1与jq1的组合。
[0262]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与bet抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1与化合物a的组合。
[0263]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与nek2抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物1与jh295的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者
施用治疗有效量的化合物1与rac-cct250863的组合。
[0264]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与plk1抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2与bi2536的组合。
[0265]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与brd4抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2与jq1的组合。
[0266]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与bet抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2与化合物a的组合。
[0267]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与nek2抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2与jh295的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物2与rac-cct250863的组合。
[0268]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与plk1抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3与bi2536的组合。
[0269]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与brd4抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3与jq1的组合。
[0270]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与bet抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3与化合物a的组合。
[0271]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前
药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与nek2抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3与jh295的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物3与rac-cct250863的组合。
[0272]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与plk1抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4或其药学上可接受的盐(例如，化合物4的盐酸盐)与bi2536的组合。
[0273]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与brd4抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4或其药学上可接受的盐(例如，化合物4的盐酸盐)与jq1的组合。
[0274]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与bet抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4或其药学上可接受的盐(例如，化合物4的盐酸盐)与化合物a的组合。
[0275]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与nek2抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4或其药学上可接受的盐(例如，化合物4的盐酸盐)与jh295的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物4或其药学上可接受的盐(例如，化合物4的盐酸盐)与rac-cct 250863的组合。
[0276]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与plk1抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5或其药学上可接受的盐(例如，化合物5的盐酸盐)与bi2536的组合。
[0277]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与brd4抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5或其药学上可接受的盐(例如，化合物5的盐酸盐)与jq1的组合。
[0278]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与bet抑制剂的组合。在一个实施例中，
本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5或其药学上可接受的盐(例如，化合物5的盐酸盐)与化合物a的组合。
[0279]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与nek2抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5或其药学上可接受的盐(例如，化合物5的盐酸盐)与jh295的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物5或其药学上可接受的盐(例如，化合物5的盐酸盐)与rac-cct 250863的组合。
[0280]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与plk1抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6或其药学上可接受的盐(例如，化合物6的氢溴酸盐)与bi2536的组合。
[0281]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与brd4抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6或其药学上可接受的盐(例如，化合物6的氢溴酸盐)与jq1的组合。
[0282]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与bet抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6或其药学上可接受的盐(例如，化合物6的氢溴酸盐)与化合物a的组合。
[0283]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与nek2抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6或其药学上可接受的盐(例如，化合物6的氢溴酸盐)与jh295的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物6或其药学上可接受的盐(例如，化合物6的氢溴酸盐)与rac-cct 250863的组合。
[0284]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与plk1抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7与bi2536的组合。
[0285]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与brd4抑制剂的组合。在一个实施例中，
本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7与jq1的组合。
[0286]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与bet抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7与化合物a的组合。
[0287]
在一个实施例中，本文提供了治疗癌症的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7、或其立体异构体或立体异构体混合物、药学上可接受的盐、互变异构体、前药、溶剂化物、水合物、共晶体、笼合物、或多晶型物与nek2抑制剂的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7与jh295的组合。在一个实施例中，本文提供了治疗多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的化合物7与rac-cct250863的组合。
[0288]
本文还提供了治疗先前接受过多发性骨髓瘤治疗但对标准疗法无响应的患者以及先前未接受治疗的患者的方法。还涵盖治疗为治疗多发性骨髓瘤而接受过手术的患者以及未接受手术的患者的方法。本文还提供了治疗先前接受过移植疗法的患者以及未接受移植疗法的患者的方法。
[0289]
本文提供的方法包括治疗复发、难治或耐药的多发性骨髓瘤。本文提供的方法包括预防复发、难治或耐药的多发性骨髓瘤。本文提供的方法包括管理复发、难治或耐药的多发性骨髓瘤。在一些此类实施例中，骨髓瘤是原发的、继发的、三次复发的、四次复发的或五次复发的多发性骨髓瘤。在一个实施例中，本文提供的方法减少、维持或消除了微量残留病(mrd)。在一个实施例中，本文提供了在多发性骨髓瘤患者中增加mrd阴性率和/或持久性的方法，该方法包括施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。在一个实施例中，本文提供的方法涵盖通过施用治疗有效量的本文所述的化合物来治疗、预防或管理各种类型的多发性骨髓瘤，如意义未明的单克隆丙种球蛋白血症(mgus)，低风险、中风险和高风险多发性骨髓瘤，新诊断的多发性骨髓瘤(包括低风险、中风险和高风险的新诊断的多发性骨髓瘤)，符合移植条件和不符合移植条件的多发性骨髓瘤，郁积型(惰性)多发性骨髓瘤(包括低风险、中风险和高风险郁积型多发性骨髓瘤)，活动性多发性骨髓瘤，孤立性浆细胞瘤，髓外浆细胞瘤，浆细胞白血病，中枢神经系统多发性骨髓瘤，轻链骨髓瘤，非分泌型骨髓瘤，免疫球蛋白d骨髓瘤，和免疫球蛋白e骨髓瘤。在另一个实施例中，本文提供的方法涵盖通过施用治疗有效量的本文所述的化合物来治疗、预防或管理以遗传异常，如细胞周期蛋白d易位(例如，t(11；14)(q13；q32)；t(6；14)(p21；32)；t(12；14)(p13；q32)；或t(6；20)；)、mmset易位(例如，t(4；14)(p16；q32))、maf易位(例如，t(14；16)(q32；q32)；t(20；22)；t(16；22)(q11；q13)；或t(14；20)(q32；q11))、或其他染色体因子(例如，缺失17p13或13号染色体；del(17/17p)、非超二倍体和增加(1q))为特征的多发性骨髓瘤。在一个实施例中，根据多发性骨髓瘤国际分期系统(iss)表征多发性骨髓瘤。在一个实施例中，多发性骨髓瘤是通过iss表征的i期多发性骨髓瘤(例如，血清β2微球蛋白《3.5mg/l且血清白蛋白≥3.5g/dl)。在一个实施例中，多发性骨髓瘤是通过iss表征的iii期多发性骨髓瘤(例如，血清β2微球蛋白》5.4mg/l)。在一个实施例中，多发性骨髓瘤是通过iss表征的ii
期多发性骨髓瘤(例如，不是i期或iii期)。
[0290]
在一些实施例中，这些方法包括施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合作为诱导疗法。在一些实施例中，这些方法包括施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合作为巩固疗法。在一些实施例中，这些方法包括施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合作为维持疗法。
[0291]
在本文所述方法的一个特定实施例中，多发性骨髓瘤为浆细胞白血病。
[0292]
在本文所述方法的一个实施例中，多发性骨髓瘤为高风险多发性骨髓瘤。在一些此类实施例中，高风险多发性骨髓瘤是复发性的或难治性的。在一个实施例中，高风险多发性骨髓瘤是在首次治疗后12个月内复发的多发性骨髓瘤。在又一个实施例中，高风险多发性骨髓瘤是以遗传异常(例如，del(17/17p)和t(14；16)(q32；q32)中的一种或多种)为特征的多发性骨髓瘤。在一些此类实施例中，高风险多发性骨髓瘤是复发性的或对一种、两种或三种先前治疗难治。
[0293]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于p53突变。在一个实施例中，p53突变为q331突变。在一个实施例中，p53突变为r273h突变。在一个实施例中，p53突变为k132突变。在一个实施例中，p53突变为k132n突变。在一个实施例中，p53突变为r337突变。在一个实施例中，p53突变为r337l突变。在一个实施例中，p53突变为w146突变。在一个实施例中，p53突变为s261突变。在一个实施例中，p53突变为s261t突变。在一个实施例中，p53突变为e286突变。在一个实施例中，p53突变为e286k突变。在一个实施例中，p53突变为r175突变。在一个实施例中，p53突变为r175h突变。在一个实施例中，p53突变为e258突变。在一个实施例中，p53突变为e258k突变。在一个实施例中，p53突变为a161突变。在一个实施例中，p53突变为a161t突变。
[0294]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于p53的纯合性缺失。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于野生型p53的纯合性缺失。
[0295]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于野生型p53。
[0296]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于一种或多种致癌驱动因子的激活。在一个实施例中，该一种或多种致癌驱动因子选自由以下组成的组：c-maf、mafb、fgfr3、mmset、细胞周期蛋白d1和细胞周期蛋白d。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于c-maf的激活。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于mafb的激活。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于fgfr3和mmset的激活。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于c-maf、fgfr3和mmset的激活。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于细胞周期蛋白d1的激活。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于mafb和细胞周期蛋白d1的激活。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于细胞周期蛋白d的激活。
[0297]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于一种或多种染色体易位。在一个实施例中，染色体易位是t(14；16)。在一个实施例中，染色体易位是t(14；20)。在一个实施例中，染色体易位是t(4；14)。在一个实施例中，染色体易位是t(4；14)和t(14；16)。在一个实施例中，染色体易位是t(11；14)。在一个实施例中，染色体易位是t(6；20)。在一个实施例中，染色体易位是t(20；22)。在一个实施例中，染色体易位是t(6；20)和t(20；22)。在一个实施例中，染色体易位是t(16；22)。在一个实施例中，染色体易位是t(14；16)和t(16；22)。在一个
实施例中，染色体易位是t(14；20)和t(11；14)。
[0298]
在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于q331 p53突变、c-maf的激活以及t(14；16)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于p53的纯合性缺失、c-maf的激活以及t(14；16)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于k132n p53突变、mafb的激活以及t(14；20)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于野生型p53、fgfr3和mmset的激活以及t(4；14)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于野生型p53、c-maf的激活以及t(14；16)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于p53的纯合性缺失，fgfr3、mmset和c-maf的激活以及t(4；14)和t(14；16)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于p53的纯合性缺失、细胞周期蛋白d1的激活以及t(11；14)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于r337l p53突变、细胞周期蛋白d1的激活以及t(11；14)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于w146 p53突变、fgfr3和mmset的激活以及t(4；14)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于s261t p53突变、mafb的激活以及t(6；20)和t(20；22)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于e286k p53突变、fgfr3和mmset的激活以及t(4；14)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于r175h p53突变、fgfr3和mmset的激活以及t(4；14)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于e258k p53突变、c-maf的激活以及t(14；16)和t(16；22)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于野生型p53、mafb和细胞周期蛋白d1的激活以及t(14；20)和t(11；14)处的染色体易位。在一个实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于a161t p53突变、细胞周期蛋白d的激活以及t(11；14)处的染色体易位。
[0299]
在本文所述方法的一些实施例中，多发性骨髓瘤是符合移植条件的新诊断的多发性骨髓瘤。在另一个实施例中，多发性骨髓瘤是不符合移植条件的新诊断的多发性骨髓瘤。
[0300]
在又其他实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于初始治疗后的早期进展(例如少于12个月)。在仍其他实施例中，多发性骨髓瘤的特征在于自体干细胞移植后的早期进展(例如少于12个月)。在另一个实施例中，多发性骨髓瘤对来那度胺难治。在另一个实施例中，多发性骨髓瘤对泊马度胺难治。在一些此类实施例中，预测多发性骨髓瘤对泊马度胺难治(例如，通过分子表征)。在另一个实施例中，多发性骨髓瘤是复发性的，或者对3种或更多种治疗难治，并且暴露于蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、奥泼佐米(oprozomib)或马里佐米(marizomib)和免疫调节化合物(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、伊贝度胺(iberdomide)或阿伐度胺(avadomide))，或者对蛋白酶体抑制剂和免疫调节化合物双重难治。在仍其他实施例中，多发性骨髓瘤是复发性的，或者对3种或更多种既往疗法(包括例如cd38单克隆抗体(cd38 mab，例如，达雷木单抗(daratumumab)或伊沙妥昔单抗(isatuximab))、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、或马里佐米)和免疫调节化合物(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、伊贝度胺或阿伐度胺))难治，或者对蛋白酶体抑制剂或免疫调节化合物和cd38 mab双重难治。在仍其他实施例中，多发性骨髓瘤是三重难治的，例如，多发性骨髓瘤对蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、奥泼佐米或马里佐米)、免疫调节化合物(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、伊贝度胺、或阿伐度胺)和一种如本文所述的其他活性剂难治。
[0301]
在某些实施例中，本文提供了在肾功能受损的患者中治疗、预防和/或管理多发性骨髓瘤(包括复发性/难治性多发性骨髓瘤)或其症状的方法，这些方法包括向肾功能受损的患有复发性/难治性多发性骨髓瘤的患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。
[0302]
在某些实施例中，本文提供了在虚弱患者中治疗、预防和/或管理多发性骨髓瘤(包括复发性或难治性多发性骨髓瘤)或其症状的方法，这些方法包括向患有多发性骨髓瘤的虚弱患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合。在一些此类实施例中，虚弱患者的特征在于不符合诱导疗法条件、或者对地塞米松治疗不耐受。在一些此类实施例中，虚弱患者是老年人，例如，年龄超过65岁。
[0303]
在某些实施例中，本文提供了治疗、预防或管理多发性骨髓瘤的方法，这些方法包括向患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合，其中该多发性骨髓瘤为四线复发性/难治性多发性骨髓瘤。
[0304]
在某些实施例中，本文提供了治疗、预防或管理多发性骨髓瘤的方法，这些方法包括向患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合作为诱导疗法，其中该多发性骨髓瘤为新诊断的符合移植条件的多发性骨髓瘤。
[0305]
在某些实施例中，本文提供了治疗、预防或管理多发性骨髓瘤的方法，这些方法包括向患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合作为其他疗法或移植后的维持疗法，其中该多发性骨髓瘤为新诊断的、在其他疗法或移植之前符合移植条件的多发性骨髓瘤。
[0306]
在某些实施例中，本文提供了治疗、预防或管理多发性骨髓瘤的方法，这些方法包括向患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合作为其他疗法或移植后的维持疗法。在一些实施例中，多发性骨髓瘤是新诊断的、在其他疗法和/或移植之前符合移植条件的多发性骨髓瘤。在一些实施例中，移植前的其他疗法是用化疗或本文提供的化合物进行的治疗。
[0307]
在某些实施例中，本文提供了治疗、预防或管理多发性骨髓瘤的方法，这些方法包括向患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合，其中该多发性骨髓瘤为复发性的或对一种、两种或三种先前治疗难治的高风险多发性骨髓瘤。
[0308]
在某些实施例中，本文提供了治疗、预防或管理多发性骨髓瘤的方法，这些方法包括向患者施用治疗有效量的本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合，其中该多发性骨髓瘤为新诊断的、不符合移植条件的多发性骨髓瘤。
[0309]
在某些实施例中，要用本文提供的方法中的一种治疗的患者在施用本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合之前未接受过多发性骨髓瘤疗法治疗。在某些实施例中，要用本文提供的方法中的一种治疗的患者在施用本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合之前接受过多发性骨髓瘤疗法治疗。在某些实施例中，要用本文提供的方法中的一种治疗的患者已经对抗多发性骨髓瘤疗法产生耐药性。在一些此类实施例中，患者已经对一种、两种或三种抗多发性骨髓瘤疗法产生耐药性，其中这些疗法选自cd38单克隆抗体(cd38 mab，例如，达雷木单抗或伊沙妥昔单抗)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、或马里佐米)和免疫调节化合物(例如，沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、伊贝度胺、或阿伐度胺)。
[0310]
本文提供的方法涵盖治疗患者，不考虑患者的年龄。在一些实施例中，受试者为18岁或更大。在其他实施例中，受试者超过18、25、35、40、45、50、55、60、65或70岁。在其他实施例中，受试者小于65岁。在其他实施例中，受试者超过65岁。在一个实施例中，受试者是老年多发性骨髓瘤受试者，如年龄大于65岁的受试者。在一个实施例中，受试者是老年多发性骨髓瘤受试者，如年龄大于75岁的受试者。
[0311]
e.第二活性剂的给药
[0312]
在一个实施例中，如在本文提供的方法中使用的本文提供的第二活性剂的特定量(剂量)由以下因素确定，例如所使用的特定药剂、正在接受治疗或管理的多发性骨髓瘤的类型、疾病的严重程度和阶段、本文提供的化合物的量、和并行施用于患者的任何任选的另外的活性剂。
[0313]
在一个实施例中，如在本文提供的方法中使用的本文提供的第二活性剂的剂量基于fda或美国以外国家的类似监管机构对所述活性剂批准的药物商业包装插页(例如，标签)确定。在一个实施例中，如在本文提供的方法中使用的本文提供的第二活性剂的剂量为fda或美国以外国家的类似监管机构对所述活性剂批准的剂量。在一个实施例中，如在本文提供的方法中使用的本文提供的第二活性剂的剂量为所述活性剂在人临床试验中的剂量。在一个实施例中，如在本文提供的方法中使用的本文提供的第二活性剂的剂量低于fda或美国以外国家的类似监管机构对所述活性剂批准的剂量或所述活性剂在人临床试验中的剂量，这取决于例如，本文提供的第二活性剂与化合物之间的协同作用。
[0314]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为btk抑制剂。在一个实施例中，btk抑制剂(例如，依鲁替尼)以约140mg至约700mg、约280mg至约560mg、或约420mg至约560mg范围内的剂量每日一次施用。在一个实施例中，btk抑制剂(例如，依鲁替尼)以不超过约700mg、不超过约560mg、不超过约420mg、不超过约280mg、或不超过约140mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，btk抑制剂(例如，依鲁替尼)以约560mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，btk抑制剂(例如，依鲁替尼)以约420mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，btk抑制剂(例如，依鲁替尼)以约280mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，btk抑制剂(例如，依鲁替尼)以约140mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，口服施用btk抑制剂(例如，依鲁替尼)。
[0315]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为mtor抑制剂。在一个实施例中，mtor抑制剂(例如，依维莫司)以约1mg至约20mg、约2.5mg至约15mg或约5mg至约10mg范围内的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mtor抑制剂(例如，依维莫司)以不超过约20mg、不超过约15mg、不超过约10mg、不超过约5mg、或不超过约2.5mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mtor抑制剂(例如，依维莫司)以约10mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mtor抑制剂(例如，依维莫司)以约5mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mtor抑制剂(例如，依维莫司)以约2.5mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，口服施用mtor抑制剂(例如，依维莫司)。
[0316]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为pim抑制剂。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以约30mg至约1000mg、约70mg至约700mg、约150mg至约500mg、约200mg至约350mg或约250mg至约300mg范围内的剂量每日一次施用。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以不超过约700mg、不超过约500mg、不超过约350mg、不超过
约300mg、不超过约250mg、不超过约200mg、不超过约150mg、或不超过约70mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以约500mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以约350mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以约300mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以约250mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以约200mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，pim抑制剂(例如，lgh-447)以约150mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，口服施用pim抑制剂(例如，lgh-447)。
[0317]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为igf-1r抑制剂。在一个实施例中，igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)以约100mg至约500mg、约150mg至约450mg、约200mg至约400mg、或约250mg至约300mg范围内的剂量每日施用。在一个实施例中，igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)以约50mg至约250mg、约75mg至约225mg、约100mg至约200mg、或约125mg至约150mg范围内的剂量每日两次(bid)施用。在一个实施例中，igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)以不超过约450mg、不超过约400mg、不超过约300mg、不超过约250mg、不超过约200mg、或不超过约150mg的剂量每日施用。在一个实施例中，igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)以不超过约450mg、不超过约400mg、不超过约300mg、不超过约250mg、不超过约200mg、或不超过约150mg的剂量每日施用。在一个实施例中，igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)以不超过约225mg、不超过约200mg、不超过约150mg、不超过约125mg、不超过约100mg、或不超过约75mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)以约450mg、约400mg、约300mg、约250mg、约200mg、或约150mg的剂量每日施用。在一个实施例中，igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)以约225mg、约200mg、约150mg、约125mg、约100mg、或约75mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，在每7天的第1至3天施用igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)。在一个实施例中，口服施用igf-1r抑制剂(例如，林西替尼)。
[0318]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为mek抑制剂。在一个实施例中，mek抑制剂(例如，曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜)以约0.25mg至约3mg、约0.5mg至约2mg、或约1m至约1.5mg范围内的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mek抑制剂(例如，曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜)以不超过约2mg、不超过约1.5mg、不超过约1mg、或不超过约0.5mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mek抑制剂(例如，曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜)以约2mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mek抑制剂(例如，曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜)以约1.5mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mek抑制剂(例如，曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜)以约1mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，mek抑制剂(例如，曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜)以约0.5mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，口服施用mek抑制剂(例如，曲美替尼或曲美替尼二甲基亚砜)。
[0319]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为xpo1抑制剂。在一个实施例中，xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)以约30mg至约200mg范围内的剂量每周两次施用，以约45mg至约150mg范围内的剂量每周两次施用，或以约60mg至约100mg范围内的剂量每周两次施用。在一个实施例中，xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)以不超过约100mg、不超过约80mg、不超过约60mg、或不超过约40mg的剂量每周两次施用。在一个实施例中，xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)以约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、或约100mg的剂量每周两次施用。在一个实施例中，剂量约为40mg，每周两次。在一个实施例中，
剂量约为60mg，每周两次。在一个实施例中，剂量约为80mg，每周两次。在一个实施例中，剂量约为100mg，每周两次。在一个实施例中，口服施用xpo1抑制剂(例如，塞利尼索)。
[0320]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为dot1l抑制剂。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，sgc0946)以约10mg至约500mg、约25mg至约400mg、约50mg至约300mg、约75mg至约200mg或约100mg至约150mg范围内的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，sgc0946)以不超过约500mg、不超过约400mg、不超过约300mg、不超过约200mg、不超过约150mg、不超过约100mg、不超过约75mg、不超过约50mg、或不超过约25mg的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，sgc0946)以约25mg、约50mg、约75mg、约100mg、约150mg、约200mg、约300mg、约400mg、或约500mg的剂量施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，sgc0946)以约18mg/m2至约126mg/m2、约36mg/m2至约108mg/m2、或约54mg/m2至约90mg/m2范围内的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，sgc0946)以不超过约126mg/m2、不超过约108mg/m2、不超过约90mg/m2、不超过约72mg/m2、不超过约54mg/m2、不超过约36mg/m2、或不超过约18mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，sgc0946)以约18mg/m2、约36mg/m2、约54mg/m2、约72mg/m2、约90mg/m2、约108mg/m2、或约126mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，口服施用dot1l抑制剂(例如，sgc0946)。在一个实施例中，静脉内施用dot1l抑制剂(例如，sgc0946)。
[0321]
在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约18mg/m2至约108mg/m2、约36mg/m2至约90mg/m2、或约54mg/m2至约72mg/m2范围内的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以不超过约108mg/m2、不超过约90mg/m2、不超过约72mg/m2、不超过约54mg/m2、不超过约36mg/m2、或不超过约18mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约18mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约36mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约54mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约70mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约72mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约90mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)以约108mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，静脉内施用dot1l抑制剂(例如，匹诺司他)。
[0322]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为ezh2抑制剂。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，他泽司他)以约50mg至约1600mg、约100mg至约800mg、或约200mg至约400mg范围内的剂量每日两次(bid)施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，他泽司他)以不超过约800mg、不超过约600mg、不超过约400mg、不超过约200mg、或不超过约100mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，他泽司他)以约800mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，他泽司他)以约600mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，他泽司他)以约400mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，他泽司他)以约200mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，口服施用ezh2抑制剂(例如，他泽司他)。
[0323]
在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以约100mg至约3200mg、约200mg至约1600mg、或约400mg至约800mg范围内的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以不超过约3200mg、不超过约1600mg、不超过约800mg、不超过约400mg、不
超过约200mg、或不超过约100mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以约3200mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以约1600mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以约800mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以约400mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以约200mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)以约100mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，施用ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)一个或多个28天周期。在一个实施例中，口服施用ezh2抑制剂(例如，cpi-1205)。
[0324]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为jak2抑制剂。在一个实施例中，jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)以约120mg至约680mg、约240mg至约500mg、或约300mg至约400mg范围内的剂量每日一次施用。在一个实施例中，jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)以不超过约680mg、不超过约500mg、不超过约400mg、不超过约300mg、或不超过约240mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)以约500mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)以约400mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，jak2抑制剂(例如，菲卓替尼)以约300mg的剂量每日一次施用。
[0325]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为plk1抑制剂。在一个实施例中，plk1抑制剂(例如，bi2536)以约20mg至约200mg、约40mg至约100mg、或约50mg至约60mg范围内的剂量每天施用。在一个实施例中，plk1抑制剂(例如，bi2536)以不超过约200mg、不超过约100mg、不超过约60mg、不超过约50mg、不超过约40mg、或不超过约20mg的剂量每天施用。在一个实施例中，plk1抑制剂(例如，bi2536)以约200mg、约100mg、约60mg、约50mg、约40mg、或约20mg的剂量每天施用。在一个实施例中，plk1抑制剂(例如，bi2536)以约200mg的剂量每21天周期一次施用。在一个实施例中，plk1抑制剂(例如，bi2536)在21天周期的第1天和第8天以约100mg的剂量每天施用。在一个实施例中，plk1抑制剂(例如，bi2536)在21天周期的第1至3天以约50mg的剂量每天施用。在一个实施例中，plk1抑制剂(例如，bi2536)在21天周期的第1至3天以约60mg的剂量每天施用。在一个实施例中，静脉内施用plk1抑制剂(例如，bi2536)。
[0326]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为aurkb抑制剂。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)以约50mg至约200mg、约75mg至约150mg、或约100mg至约110mg范围内的剂量每天施用。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)以不超过约200mg、不超过约150mg、不超过约110mg、不超过约100mg、不超过约75mg、或不超过约50mg的剂量每天施用。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)以约200mg、约150mg、约110mg、约100mg、约75mg、或约50mg的剂量每天施用。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)在28天周期的第1天、第2天、第15天和第16天以本文所述的剂量施用。在一个实施例中，静脉内施用aurkb抑制剂(例如，azd1152)。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)在28天周期中每14天以48小时连续输注的形式以约150mg的剂量施用。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)在28天周期中每14天以2
×
2小时输注的形式以约220mg的剂量施用(例如，在第1天、第2天、第15天和第16天施用110mg/天)。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)每7天以2小时输注的形式以约200mg的剂量施用。在一个实施例中，aurkb抑制剂(例如，azd1152)每14天以2小时输注的形式以约450mg的剂量施用。
[0327]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为birc5抑制剂。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)以约2mg/m2至约15mg/m2、或约4mg/m2至约10mg/m2范围内的剂量每天施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)以不超过约15mg/m2、不超过约10mg/m2、不超过约4.8mg/m2、不超过约4mg/m2、或不超过约2mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)以约15mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)以约10mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)以约4.8mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)以约4mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)以约2mg/m2的剂量每天施用。在一个实施例中，静脉内施用birc5抑制剂(例如，ym155)。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)每3周通过约168小时连续iv输注以约4.8mg/m2/天的剂量施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)每3周通过约168小时连续iv输注以约5mg/m2/天的剂量施用。在一个实施例中，birc5抑制剂(例如，ym155)每3周通过约72小时连续iv输注以约10mg/m2/天的剂量施用。
[0328]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为bet抑制剂。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以约10mg至约160mg、约20mg至约120mg、或约40mg至约80mg范围内的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以不超过约160mg、不超过约120mg、不超过约80mg、不超过约40mg、不超过约20mg、或不超过约10mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以约160mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以约120mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以约80mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以约40mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以约20mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)以约10mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)在21天周期的第1至7天以本文所述的剂量施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)在21天周期的第1至14天以本文所述的剂量施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)在21天周期的第1至21天以本文所述的剂量施用。在一个实施例中，bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)在7天周期的第1至5天以本文所述的剂量施用。在一个实施例中，口服施用bet抑制剂(例如，比拉瑞塞)。
[0329]
在一个实施例中，在本文提供的方法中使用的第二活性剂为dna甲基转移酶抑制剂。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约25mg/m2至约150mg/m2、约50mg/m2至约125mg/m2、或约75mg/m2至约100mg/m2范围内的剂量每日施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以不超过约150mg/m2、不超过约125mg/m2、不超过约100mg/m2、不超过约75mg/m2、不超过约50mg/m2、或不超过约25mg/m2的剂量每日施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约150mg/m2的剂量每日施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约125mg/m2的剂量每日施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约100mg/m2的剂量每日施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约75mg/m2的剂量每日施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约50mg/m2的剂量每日施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约25mg/m2的剂量每日施用。在一个
实施例中，皮下施用dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)。在一个实施例中，静脉内施用dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)。
[0330]
在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约100mg至约500mg或约200mg至约400mg范围内的剂量每日一次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以不超过约500mg、不超过约400mg、不超过约300mg、不超过约200mg或不超过约100mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约500mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约400mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约300mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约200mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约100mg的剂量每日一次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约100mg至约300mg或约150mg至约250mg范围内的剂量每日两次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以不超过约300mg、不超过约250mg、不超过约200mg、不超过约150mg或不超过约100mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约300mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约250mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约200mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约150mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)以约100mg的剂量每日两次施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)在28天周期的第1至14天以本文所述的剂量施用。在一个实施例中，dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)在28天周期的第1至21天以本文所述的剂量施用。在一个实施例中，口服施用dna甲基转移酶抑制剂(例如，阿扎胞苷)。
[0331]
f.与另外的活性剂的组合疗法
[0332]
在一个实施例中，本文提供的方法(本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合使用)还包括向患者施用另外的活性剂(第三药剂)。在一个实施例中，第三药剂为类固醇。
[0333]
本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合使用还可以进一步与常规疗法组合或结合使用(例如，在常规疗法之前、期间或之后使用)，该常规疗法包括但不限于手术，生物疗法(包括免疫疗法，例如使用检查点抑制剂)，放射疗法，化疗，干细胞移植，细胞疗法，或目前用于治疗、预防或管理癌症(例如，多发性骨髓瘤)的其他非基于药物的疗法。本文提供的化合物、本文提供的第二活性剂和常规疗法的组合使用在某些患者中可提供出乎意料地有效的独特治疗方案。不受理论的限制，据信本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂在与常规疗法并行给予时可提供附加或协同作用。
[0334]
如本文别处所讨论的，本文涵盖降低、治疗和/或预防与常规疗法(包括但不限于手术、化疗、放射疗法、生物疗法和免疫疗法)相关的不良或不希望的影响的方法。本文提供的化合物、本文提供的第二活性剂和另外的活性成分可以在与常规疗法相关的不良影响发生之前、期间或之后施用于患者。在一个这种实施例中，另外的活性剂为地塞米松。
[0335]
本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合使用也可以进一步与本文所述的可用于治疗和/或预防多发性骨髓瘤的其他治疗剂组合或组合使用。在一个这种实施
例中，另外的活性剂为地塞米松。
[0336]
在一个实施例中，本文提供了治疗、预防或管理多发性骨髓瘤的方法，该方法包括向患者施用本文提供的化合物与本文提供的第二活性剂的组合，进一步与一种或多种另外的活性剂的组合，并且任选地进一步与放射疗法、输血或手术的组合。
[0337]
如本文所用，术语“组合”包括多于一种疗法(例如，一种或多种预防剂和/或治疗剂)的使用。然而，术语“组合”的使用不限制将疗法(例如，预防剂和/或治疗剂)施用于患有疾病或障碍的患者的顺序。可以在向受试者施用第二疗法(例如，本文提供的第二活性剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、与其伴随地、或继其之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)施用第一疗法(例如，预防剂或治疗剂，如本文提供的化合物)。可以在向受试者施用第三疗法(例如，另外的预防剂或治疗剂)之前(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周前)、与其伴随地、或继其之后(例如，5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周后)独立地施用第一疗法和第二疗法。本文还考虑了四联疗法以及五联疗法。在一个实施例中，第三疗法为地塞米松。
[0338]
可通过相同或不同的施用途径同时或依次向患者施用本文提供的化合物、本文提供的第二活性剂和一种或多种另外的活性剂。用于特定活性剂的特定施用途径的适用性将取决于活性剂本身(例如，其是否可以口服施用，且在进入血流之前不分解)。
[0339]
本文提供的化合物的施用途径独立于本文提供的第二活性剂和另外的疗法的施用途径。在一个实施例中，口服施用本文提供的化合物。在另一个实施例中，静脉内施用本文提供的化合物。在一个实施例中，口服施用本文提供的第二活性剂。在一个实施例中，静脉内施用本文提供的第二活性剂。因此，根据这些实施例，口服或静脉内施用本文提供的化合物，口服或静脉内施用本文提供的第二活性剂，并且可以口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、经皮、舌下、肌内、直肠、经口含化、鼻内、经脂质体、经由吸入、阴道内、眼内、经由局部递送(通过导管或支架)、皮下、脂肪内、关节内、鞘内或以缓释剂型施用另外的疗法。在一个实施例中，通过相同的施用方式(口服或iv)施用本文提供的化合物、本文提供的第二活性剂和另外的疗法。在另一个实施例中，通过一种施用方式(例如，通过iv)施用本文提供的化合物，而通过另一种施用方式(例如，口服)施用本文提供的第二活性剂或另外的药剂(抗多发性骨髓瘤药剂)。
[0340]
在一个实施例中，静脉内或皮下施用另外的活性剂，每天一次或两次，用量为约1至约1000mg、约5至约500mg、约10至约350mg或约50至约200mg。另外的活性剂的特定量将取决于所用的特定药剂、正在治疗或管理的多发性骨髓瘤的类型、疾病的严重程度和阶段、本文提供的化合物的量、本文提供的第二活性剂的量、以及并行向患者施用的任何任选的另外的活性剂。
[0341]
一种或多种另外的活性成分或药剂可与本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂一起在本文提供的方法和组合物中使用。另外的活性剂可以是大分子(例如，蛋白质)、
小分子(例如，合成无机、有机金属或有机分子)或细胞疗法(例如，car细胞)。
[0342]
可在本文所述的方法和组合物中使用的另外的活性剂的实例包括以下中的一个或多个：美法仑、长春新碱、环磷酰胺、依托泊苷、多柔比星、苯达莫司汀、奥比妥珠单抗(obinutuzmab)、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米、卡非佐米、伊沙佐米、奥泼佐米或马里佐米)、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如，帕比司他(panobinostat)、acy241)、bet抑制剂(例如，gsk525762a、otx015、bms-986158、ten-010、cpi-0610、incb54329、bay1238097、ft-1101、abbv-075、bi 894999、gs-5829、gsk1210151a(i-bet-151)、cpi-203、rvx-208、xd46、ms436、pfi-1、rvx2135、zen3365、xd14、arv-771、mz-1、plx5117、4-[2-(环丙基甲氧基)-5-(甲磺酰基)苯基]-2-甲基异喹啉-1(2h)-酮、ep11313和ep11336)、bcl2抑制剂(例如，维奈托克或那维托克莱克斯(navitoclax))、mcl-1抑制剂(例如，azd5991、amg176、mik665、s64315或s63845)、lsd-1抑制剂(例如，ory-1001、ory-2001、incb-59872、img-7289、tak-418、gsk-2879552、4-[2-(4-氨基-哌啶-1-基)-5-(3-氟-4-甲氧基-苯基)-1-甲基-6-氧代-1,6-二氢嘧啶-4-基]-2-氟-苄腈或其盐)、皮质类固醇(例如，泼尼松)、地塞米松；抗体(例如，cs1抗体，如埃洛妥珠单抗(elotuzumab)；cd38抗体，如达雷木单抗或伊沙妥昔单抗；或bcma抗体或抗体-缀合物，如gsk2857916或bi 836909)、检查点抑制剂(如本文所述)或car细胞(如本文所述)。
[0343]
在一个实施例中，在本文所述的方法和组合物中，与本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂一起使用的另外的活性剂是地塞米松。
[0344]
在一些实施例中，在21天周期的第1天和第8天以4mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天以4mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天和第15天以4mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在28天周期的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天以4mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天以4mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第10天、第15天和第22天以4mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第3天、第15天和第17天以4mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第3天、第14天和第17天以4mg的剂量施用地塞米松。
[0345]
在一些其他实施例中，在21天周期的第1天和第8天以8mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天以8mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天和第15天以8mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在28天周期的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天以8mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天以8mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第10天、第15天和第22天以8mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第3天、第15天和第17天以8mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第3天、第14天和第17天以8mg的剂量施用地塞米松。
[0346]
在一些实施例中，在21天周期的第1天和第8天以10mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天以10mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天和第15天以10mg的剂量施用地塞米松。在一些
其他实施例中，在28天周期的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天以10mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天以10mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第10天、第15天和第22天以10mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第3天、第15天和第17天以10mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第3天、第14天和第17天以10mg的剂量施用地塞米松。
[0347]
在一些实施例中，在21天周期的第1天和第8天以20mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天以20mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天和第15天以20mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在28天周期的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天以20mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天以20mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第10天、第15天和第22天以20mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第3天、第15天和第17天以20mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第3天、第14天和第17天以20mg的剂量施用地塞米松。
[0348]
在一些实施例中，在21天周期的第1天和第8天以40mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在21天周期的第1天、第4天、第8天和第11天以40mg的剂量施用地塞米松。在一些实施例中，在28天周期的第1天、第8天和第15天以40mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第10天、第15天和第22天以40mg的剂量施用地塞米松。在一些其他实施例中，在28天周期的第1天、第4天、第8天、第11天、第15天和第18天以40mg的剂量施用地塞米松。在其他此类实施例中，在28天周期的第1天、第8天、第15天和第22天以40mg的剂量施用地塞米松。在其他此类实施例中，在28天周期的第1天、第3天、第15天和第17天以40mg的剂量施用地塞米松。在一个这种实施例中，在周期1的第1天、第3天、第14天和第17天以40mg的剂量施用地塞米松。
[0349]
在另一个实施例中，在本文所述的方法和组合物中，与本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂一起使用的另外的活性剂是硼替佐米。在又一个实施例中，在本文所述的方法和组合物中，与本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂一起使用的另外的活性剂是达雷木单抗。在一些此类实施例中，这些方法另外包括施用地塞米松。在一些实施例中，这些方法包括施用本文提供的化合物、和本文提供的第二活性剂与如本文所述的蛋白酶体抑制剂、如本文所述的cd38抑制剂和如本文所述的皮质类固醇。
[0350]
在某些实施例中，本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂与检查点抑制剂组合施用。在一个实施例中，将一种检查点抑制剂与和本文提供的方法有关的本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂组合使用。在另一个实施例中，将两种检查点抑制剂与和本文提供的方法有关的本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂组合使用。在又一个实施例中，将三种或更多种检查点抑制剂与和本文提供的方法有关的本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂组合使用。
[0351]
如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”或“检查点抑制剂”是指完全或部分地减少、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白的分子。在不受特定理论限制的情况下，检查点蛋白调节t细胞的激活或功能。许多检查点蛋白是已知的，如ctla-4及其配体cd80和
cd86；以及pd-1与其配体pd-ll和pd-l2(pardoll,nature reviews cancer[自然癌症综述],2012,12,252-264)。这些蛋白质似乎负责t细胞响应的共刺激或抑制相互作用。免疫检查点蛋白似乎调节和维持自身耐受性以及生理免疫响应的持续时间和幅度。免疫检查点抑制剂包括抗体或衍生自抗体。
[0352]
在一个实施例中，检查点抑制剂是ctla-4抑制剂。在一个实施例中，ctla-4抑制剂是抗ctla-4抗体。抗ctla-4抗体的实例包括但不限于美国专利号5,811,097、5,811,097、5,855,887、6,051,227、6,207,157、6,682,736、6,984,720和7,605,238中描述的那些，所有这些美国专利以其整体并入本文。在一个实施例中，抗ctla-4抗体是曲美利木单抗(tremelimumab)(也称为替西木单抗(ticilimumab)或cp-675,206)。在另一个实施例中，抗ctla-4抗体是伊匹单抗(ipilimumab)(也称为mdx-010或mdx-101)。伊匹单抗是与ctla-4结合的全人单克隆igg抗体。伊匹单抗以商品名yervoy
tm
出售。
[0353]
在一个实施例中，检查点抑制剂是pd-1/pd-l1抑制剂。pd-l/pd-l1抑制剂的实例包括但不限于在美国专利号7,488,802、7,943,743、8,008,449、8,168,757、8,217,149，和pct专利申请公开号wo 2003042402、wo 2008156712、wo 2010089411、wo 2010036959、wo 2011066342、wo 2011159877、wo 2011082400和wo 2011161699中所述的那些，将其全部以其整体并入本文。
[0354]
在一个实施例中，检查点抑制剂是pd-1抑制剂。在一个实施例中，pd-1抑制剂是抗pd-1抗体。在一个实施例中，抗pd-1抗体是bgb-a317、纳武单抗(nivolumab)(也称为ono-4538、bms-936558或mdx1106)或派姆单抗(pembrolizumab)(也称为mk-3475、sch 900475或拉姆布罗力珠单抗(lambrolizumab))。在一个实施例中，抗pd-1抗体是纳武单抗。纳武单抗是人igg4抗pd-1单克隆抗体，并且以商品名opdivo
tm
出售。在另一个实施例中，抗pd-1抗体是派姆单抗。派姆单抗是人源化单克隆igg4抗体并且以商品名keytruda
tm
出售。在又一个实施例中，抗pd-1抗体是人源化抗体ct-011。单独施用ct-011在治疗复发性急性髓系白血病(aml)时没有表现出响应。在又一个实施例中，抗pd-1抗体是融合蛋白amp-224。在另一个实施例中，pd-1抗体是bgb-a317。bgb-a317是单克隆抗体，其结合fcγ受体i的能力是专门设计出来的，该单克隆抗体与pd-1具有独特的结合特征，具有高亲和力和优异的靶特异性。
[0355]
在一个实施例中，检查点抑制剂是pd-l1抑制剂。在一个实施例中，pd-l1抑制剂是抗pd-l1抗体。在一个实施例中，抗pd-l1抗体为medi4736(得瓦鲁单抗(durvalumab))。在另一个实施例中，抗pd-l1抗体是bms-936559(也称为mdx-1105-01)。在又一个实施例中，pd-l1抑制剂为阿特珠单抗(atezolizumab)(也称为mpdl3280a和)。
[0356]
在一个实施例中，检查点抑制剂是pd-l2抑制剂。在一个实施例中，pd-l2抑制剂是抗pd-l2抗体。在一个实施例中，抗pd-l2抗体为rhigm12b7a。
[0357]
在一个实施例中，检查点抑制剂是淋巴细胞激活基因-3(lag-3)抑制剂。在一个实施例中，lag-3抑制剂是可溶性ig融合蛋白imp321(brignone等人,j.immunol.[免疫学杂志],2007,179,4202-4211)。在另一个实施例中，lag-3抑制剂为bms-986016。
[0358]
在一个实施例中，检查点抑制剂为b7抑制剂。在一个实施例中，b7抑制剂为b7-h3抑制剂或b7-h4抑制剂。在一个实施例中，b7-h3抑制剂是mga271，一种抗b7-h3抗体(loo等人,clin.cancer res.[临床癌症研究],2012,3834)。
[0359]
在一个实施例中，检查点抑制剂为tim3(t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域
3)抑制剂(fourcade等人,j.exp.med.[实验医学杂志],2010,207,2175-86；sakuishi等人,j.exp.med.[实验医学杂志],2010,207,2187-94)。
[0360]
在一个实施例中，检查点抑制剂为ox40(cd134)激动剂。在一个实施例中，检查点抑制剂是抗ox40抗体。在一个实施例中，抗ox40抗体是抗ox-40。在另一个实施例中，抗ox40抗体是medi6469。
[0361]
在一个实施例中，检查点抑制剂是gitr激动剂。在一个实施例中，检查点抑制剂是抗gitr抗体。在一个实施例中，抗gitr抗体是trx518。
[0362]
在一个实施例中，检查点抑制剂是cd137激动剂。在一个实施例中，检查点抑制剂是抗cd137抗体。在一个实施例中，抗cd137抗体是尤尔单抗(urelumab)。在另一个实施例中，抗cd137抗体是pf-05082566。
[0363]
在一个实施例中，检查点抑制剂是cd40激动剂。在一个实施例中，检查点抑制剂是抗cd40抗体。在一个实施例中，抗cd40抗体是cf-870,893。
[0364]
在一个实施例中，检查点抑制剂是重组人白介素-15(rhil-15)。
[0365]
在一个实施例中，检查点抑制剂是ido抑制剂。在一个实施例中，ido抑制剂是incb024360。在另一个实施例中，ido抑制剂是印朵目德(indoximod)。
[0366]
在某些实施例中，本文提供的组合疗法包括本文所述的检查点抑制剂中的两个或更多个(包括相同或不同类别的检查点抑制剂)。此外，本文所述的组合疗法可与本文所述的一种或多种第二活性剂组合使用，在适当的情况下用于治疗本文所述和本领域所理解的疾病。
[0367]
在某些实施例中，本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂可与在自身表面上表达一个或多个嵌合抗原受体(car)的一个或多个免疫细胞(例如，修饰免疫细胞)组合使用。通常，car包含来自第一蛋白(例如抗原结合蛋白)的细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在某些实施例中，一旦细胞外结构域与靶蛋白(如肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa))结合，则经由活化免疫细胞的细胞内信号传导结构域生成信号，例如，以靶向并杀死表达靶蛋白的细胞。
[0368]
细胞外结构域：car的细胞外结构域与目的抗原结合。在某些实施例中，car的细胞外结构域包含与所述抗原结合的受体或受体的一部分。在某些实施例中，细胞外结构域包含或是抗体或其抗原结合部分。在特定实施例中，细胞外结构域包含或是单链fv(scfv)结构域。单链fv结构域可包含例如通过柔性接头连接到vh的v
l
，其中所述v
l
和vh来自结合所述抗原的抗体。
[0369]
在某些实施例中，本文所述多肽的细胞外结构域识别的抗原是肿瘤相关抗原(taa)或肿瘤特异性抗原(tsa)。在各种特定实施例中，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是但不限于her2、前列腺干细胞抗原(psca)、甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、癌症抗原-125(ca-125)、ca19-9、钙网膜蛋白、muc-1、b细胞成熟抗原(bcma)、上皮膜蛋白(ema)、上皮肿瘤抗原(eta)、酪氨酸酶、黑色素瘤-24相关抗原(mage)、cd19、cd22、cd27、cd30、cd34、cd45、cd70、cd99、cd117、egfrviii(表皮生长因子变体iii)、间皮素、pap(前列腺酸性磷酸酶)、前列腺特异性蛋白(prostein)、tarp(t细胞受体γ替代性阅读框蛋白)、trp-p8、steapi(前列腺六跨膜上皮抗原1)、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、肌间线蛋白、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、囊泡病液体蛋白(gcdfp-15)、hmb-45抗原、蛋白melan-a(t淋巴细胞识别的黑色素瘤抗原；
mart-i)、myo-d1、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶、突触素(synaptophysis)、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1、丙酮酸激酶同工酶m2型(肿瘤m2-pk)的二聚体形式、异常ras蛋白或异常p53蛋白。在某些其他实施例中，car的细胞外结构域识别的taa或tsa是整合素αvβ3(cd61)、促乳素或ral-b。
[0370]
在某些实施例中，car的细胞外结构域识别的taa或tsa是癌/睾丸(ct)抗原，例如，bage、cage、ctage、fate、gage、hca661、hom-tes-85、magea、mageb、magec、na88、ny-es0-1、ny-sar-35、oy-tes-1、spanxbi、spa17、ssx、sycpi或tpte。
[0371]
在某些其他实施例中，car的细胞外结构域识别的taa或tsa是碳水化合物或神经节苷脂，例如，fuc-gmi、gm2(癌胚抗原-免疫原性-1；ofa-i-1)；gd2(ofa-i-2)、gm3、gd3等。
[0372]
在某些其他实施例中，car的细胞外结构域识别的taa或tsa是α-辅肌动蛋白-4、bage-l、bcr-abl、bcr-abl融合蛋白、β-连环蛋白、ca 125、ca 15-3(ca 27.29\bcaa)、ca 195、ca 242、ca-50、cam43、casp-8、cdc27、cdk4、cdkn2a、cea、coa-l、dek-can融合蛋白、ebna、ef2、爱泼斯坦-巴尔二氏(epstein barr)病毒抗原、etv6-aml1融合蛋白、hla-a2、hla-all、hsp70-2、kiaa0205、mart2、mum-1、2和3、新pap、i类肌球蛋白、os-9、pml-rarα融合蛋白、ptprk、k-ras、n-ras、磷酸丙糖异构酶、gage 3,4,5,6,7、gntv、herv-k-mel、lage-1、na-88、ny-eso-1/lage-2、sp17、ssx-2、trp2-int2、gp100(pmel17)、酪氨酸酶、trp-1、trp-2、mage-l、mage-3、rage、gage-l、gage-2、p15(58)、rage、scp-1、hom/mel-40、prame、p53、hras、her-2/neu、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar、人乳头瘤病毒(hpv)抗原e6和e7、tsp-180、mage-4、mage-5、mage-6、p185erbb2、p180erbb-3、c-met、nm-23h1、psa、tag-72-4、ca 19-9、ca 72-4、cam 17.1、numa、k-ras、13-连环蛋白、mum-1、p16、tage、psma、ct7、端粒酶、43-9f、5t4、791tgp72、13hcg、bca225、btaa、cd68\kp1、c0-029、fgf-5、g250、ga733(epcam)、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb\70k、ny-c0-1、rcas1、sdccag16、ta-90、taal6、tag72、tlp或tps。
[0373]
在各种特定实施例中，肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原是aml相关肿瘤抗原，如s.anguille等人,leukemia[白血病](2012),26,2186-2196中所述。
[0374]
其他肿瘤相关和肿瘤特异性抗原对于本领域技术人员来说是已知的。
[0375]
与tsa和taa结合的受体、抗体和scfv，以及编码它们的核苷酸序列在构建嵌合抗原受体中是有用的并且在本领域是已知的。
[0376]
在某些特定实施例中，嵌合抗原受体的细胞外结构域识别的抗原是通常不被认为是tsa或taa的抗原，但它仍然与肿瘤细胞或肿瘤引起的损伤相关。在某些实施例中，例如，抗原是例如生长因子、细胞因子或白介素，例如，与血管生成或血管发生相关的生长因子、细胞因子或白介素。此类生长因子、细胞因子或白介素可包括例如，血管内皮生长因子(vegf)、碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)、血小板源生长因子(pdgf)、肝细胞生长因子(hgf)、胰岛素样生长因子(igf)或白介素-8(il-8)。肿瘤也会在肿瘤局部产生缺氧环境。因此，在其他特定实施例中，抗原是缺氧相关因子，例如hif-1α、hif-1β、hif-2α、hif-2β、hif-3α或hif-3β。肿瘤还可以对正常组织造成局部损伤，导致释放称为损伤相关分子模式分子(damp，也称为警报素)的分子。因此，在某些其他特定实施例中，抗原是damp，例如，热休克蛋白、染色质相关蛋白高迁移率族蛋白1(hmgb 1)、s100a8(mrp8，钙粒蛋白a)、s100a9(mrp14，钙粒蛋白b)、血清淀粉样蛋白a(saa)，或者可以是脱氧核糖核酸、三磷酸腺苷、尿酸
或硫酸肝素。
[0377]
跨膜结构域：在某些实施例中，car的细胞外结构域通过接头、间隔子或铰链多肽序列(例如，来自cd28的序列或来自ctla4的序列)连接到多肽的跨膜结构域。跨膜结构域可以获得或衍生自任何跨膜蛋白的跨膜结构域，并且可以包括这种跨膜结构域的全部或部分。在特定实施例中，跨膜结构域可获得或衍生自例如cd8、cd16、细胞因子受体、白介素受体或生长因子受体等。
[0378]
细胞内信号传导结构域：在某些实施例中，car的细胞内结构域是或包含在t细胞表面表达并触发所述t细胞的激活和/或增殖的蛋白质的细胞内结构域或基序。这样的结构域或基序能够传递主要抗原结合信号，该抗原结合信号是响应于抗原与car的细胞外部分的结合而激活t淋巴细胞所必需的。典型地，该结构域或基序包含或是itam(基于免疫受体酪氨酸的激活基序)。适用于car的含itam的多肽包括例如，ζcd3链(cd3ζ)或其含itam的部分。在特定的实施例中，细胞内结构域是cd3ζ细胞内信号传导结构域。在其他特定实施例中，细胞内结构域来自淋巴细胞受体链、tcr/cd3复合蛋白、fe受体亚单位或il-2受体亚单位。在某些实施例中，car还包含一个或多个共刺激结构域或基序，例如，作为多肽的细胞内结构域的一部分。该一个或多个共刺激结构域或基序可以是，或可以包含共刺激cd27多肽序列、共刺激cd28多肽序列、共刺激ox40(cd134)多肽序列、共刺激4-1bb(cd137)多肽序列或共刺激诱导的t细胞共刺激(icos)多肽序列中的一个或多个，或其他共刺激结构域或基序，或其任何组合。
[0379]
car还可以包含t细胞生存基序。t细胞生存基序可以是在抗原刺激后促进t淋巴细胞生存的任何多肽序列或基序。在某些实施例中，t细胞生存基序是或衍生自cd3、cd28、il-7受体(il-7r)的细胞内信号传导结构域、il-12受体的细胞内信号传导结构域、il-15受体的细胞内信号传导结构域、il-21受体的细胞内信号传导结构域或转化生长因子β(tgfβ)受体的细胞内信号传导结构域。
[0380]
表达car的修饰免疫细胞可以是例如，t淋巴细胞(t细胞，例如cd4+t细胞或cd8+t细胞)、细胞毒性淋巴细胞(ctl)或自然杀伤(nk)细胞。在本文提供的组合物和方法中使用的t淋巴细胞可以是初始t淋巴细胞或mhc限制性t淋巴细胞。在某些实施例中，t淋巴细胞是肿瘤浸润淋巴细胞(til)。在某些实施例中，t淋巴细胞已经从肿瘤活检中分离出来，或者已经由分离自肿瘤活检的t淋巴细胞中扩增出来。在某些其他实施例中，t细胞已经从外周血、脐带血或淋巴中分离出来，或由分离自外周血、脐带血或淋巴中的t淋巴细胞中扩增出来。用于生成表达car的修饰免疫细胞的免疫细胞可以使用现有技术所接受的常规方法来分离，例如，血液采集，随后单采，以及任选地抗体介导的细胞分离或分选。
[0381]
修饰免疫细胞优选地是将接受修饰免疫细胞施用的个体自体的。在某些其他实施例中，修饰免疫细胞与将接受修饰免疫细胞施用的个体是同种异体的。在使用同种异体的t淋巴细胞或nk细胞制备修饰的t淋巴细胞时，优选地选择能降低个体发生移植物抗宿主病(gvhd)可能性的t淋巴细胞或nk细胞。例如，在某些实施例中，选择病毒特异性t淋巴细胞用于制备修饰的t淋巴细胞；预期此类淋巴细胞与任何接受者抗原结合的原生能力将大大降低，从而被任何接受者抗原活化。在某些实施例中，通过向宿主共同施用一种或多种免疫抑制剂(例如环孢素、他克莫司、西罗莫司、环磷酰胺等)，可减少接受者介导的同种异体的t淋巴细胞排斥反应。
[0382]
t淋巴细胞，例如未修饰的t淋巴细胞、或表达cd3和cd28的t淋巴细胞、或包含含有cd3ζ信号传导结构域和cd28共刺激结构域的多肽的t淋巴细胞，可以使用抗cd3和cd28的抗体，例如附接至珠的抗体来扩增；参见例如，美国专利号5,948,893、6,534,055、6,352,694、6,692,964、6,887,466、和6,905,681。
[0383]
修饰的免疫细胞(例如修饰的t淋巴细胞)，可任选地包含“自杀基因”或“安全开关”，当需要时，该“自杀基因”或“安全开关”能够杀死基本上所有的修饰免疫细胞。例如，在某些实施例中，修饰的t淋巴细胞可包含hsv胸苷激酶基因(hsv-tk)，该hsv胸苷激酶基因在与更昔洛韦(gancyclovir)接触时导致修饰的t淋巴细胞死亡。在另一个实施例中，修饰的t淋巴细胞包括诱导型半胱天冬酶，例如，诱导型半胱天冬酶9(i半胱天冬酶9)，例如，半胱天冬酶9与人fk506结合蛋白之间的融合蛋白，允许使用特定的小分子药物进行二聚化。参见straathof等人,blood[血液]1 05(11):4247-4254(2005)。
[0384]
在某些实施例中，将本文提供的化合物和本文提供的第二活性剂与嵌合抗原受体(car)t细胞组合施用于患有各种类型或阶段的多发性骨髓瘤的患者。在某些实施例中，组合中的car t细胞靶向b细胞成熟抗原(bcma)，并且在更特定的实施例中，该car t细胞是bb2121或bb21217。在一些实施例中，car t细胞是jcarh125。
[0385]
应当理解，前面的具体实施方式和所附实例仅仅是说明性的，并且不应被视为对主题范围的限制。对披露的实施例的各种改变和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。在不脱离本发明精神和范围的情况下，可以作出此类改变和修改，包括但不限于与本文提供的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、制剂和/或使用方法有关的改变和修改。本文引用的美国专利和出版物通过引用并入。
[0386]
8.实例
[0387]
通过以下非限制性实例来说明本发明的某些实施例。
[0388]
实例1：plk1抑制减少多发性骨髓瘤细胞系中的细胞增殖细胞系。所有的mm细胞系(atcc，美国弗吉尼亚州马纳萨斯(manassas,va,usa))都经过常规的支原体检测，并在补充有l-谷氨酰胺、胎牛血清、青霉素和链霉素(均来自英杰公司(invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca))的rpmi 1640培养基中维持。将这些细胞系定期进行验证。
[0389]
抗体。在这些实验中，将几种抗体用于免疫印迹和流式细胞术，这些抗体包括plk1(目录号4513)、aiolos(目录号15103)、ikaros(目录号14859)、cdc25c(目录号4688)、pcdc25c(目录号4901)、裂解的半胱天冬酶3(目录号9664)、存活蛋白(目录号2803)、bcl2(目录号2872)、brd4(目录号13440)、c-myc(目录号5605)、perk(目录号4376)、erk(目录号4695)、irf7(目录号13014)、foxm1(目录号5436)、磷酸化组蛋白h3(ser10)(d2c8)(alexa
ꢀꢀ
594缀合物)(目录号8481)(均来自细胞信号传导技术公司(cell signaling technologies)(美国马萨诸塞州丹佛斯(danvers,ma,usa)))、e2f2(目录号ab-138515，艾博抗公司(abcam)，美国马萨诸塞州坎布里奇(cambridge,ma,usa))、cks1b(目录号36-6800，英杰公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma,usa))、nuf2(目录号nbp2-43779，诺伟思公司(novus)，美国密苏里州圣查尔斯(saint charles,mo,usa))、top2a(目录号pa5-46814，英杰公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、etv4(目录号10684-1，英杰公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、irf5(目录号10547-1-ap，proteintech公司(proteintech)，伊利诺伊州罗斯蒙特(rosemont,il))。
[0390]
增殖和活力测定：通过在vi-cell-xr(贝迪公司(becton dickinson)，美国新泽西州富兰克林湖(franklin lakes,nj,usa))上用台盼蓝排斥监测细胞的活力来确定细胞生长曲线。使用(3h)-胸苷掺入进行增殖测定，一式三份，至少三次(n＝3)。将所有数据用graphpad prism 7(graphpad软件公司(graphpad software)，美国加利福尼亚州拉荷亚(la jolla,ca,usa))软件进行绘制并分析，以平均值与确定为
±
s.d的误差表示。
[0391]
免疫印迹：使用wes试剂盒(protein simple公司，美国加利福尼亚州圣何塞(san jose,ca,usa))进行免疫印迹分析，每个至少两次(n≥2)，其中显示了最佳代表。
[0392]
rna提取、逆转录和实时pcr分析：使用rneasy plus试剂盒(凯杰公司(qiagen)，美国马里兰州日耳曼敦(germantown,md,usa))提取总rna，并使用iscrip逆转录试剂盒(伯乐公司(bio-rad)，美国宾夕法尼亚州费城(philadelphia,pa,usa))进行逆转录。使用taqman pcr master mix和viia 7实时pcr系统(应用生物系统公司(applied biosystems)，美国加利福尼亚州福斯特城(foster city,ca,usa))进行定量实时pcr(qpcr)分析。使用比较ct法(δδct法)在对gapdh水平进行归一化后计算基因表达。qpcr的引物序列如下：plk1 rt f：cacagtgtcaatgcctccaa(seq id no:1)，plk1 rt r：gacccagaagatggggatg(seq id no:2)，actb rt f：ctcttccagccttccttcct(seq id no:3)，actb rt r：ggatgtccacgtcacacttc(seq id no:4)。
[0393]
chip-pcr和chip-seq研究：使用标准方法进行h929和df15细胞系的chip-pcr和chip-序列实验。chip-pcr的引物序列如下：plk1转录起始位点(tss)chip f：gcgcaggcttttgtaacg(seq id no:5)，plk1 tss chip r：ctcctccccgaattcaaac(seq id no:6)。
[0394]
流式细胞术：根据制造商的方案，使用膜联蛋白v alexa fluor 488-缀合抗体(赛默飞世尔科技公司(thermo scientific)，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和to-pro-3(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，并使用flow jo软件进行处理，进行至少三个独立实验。对于细胞周期分析，将细胞用碘化丙啶(pi)染色试剂盒(艾博抗公司，美国马萨诸塞州坎布里奇)染色，并在flow jo v10软件上进行分析。还通过phh3-ser
10
和pi双重染色进行有丝分裂标志物phh3-ser
10
的染色。
[0395]
共聚焦成像：将细胞培养在腔室玻片中，并且固定透化用于显微镜检查。将细胞与靶向plk1、cdc25c的一抗在1x细胞内染色缓冲液中于冷室中孵育2小时。然后将细胞用alexa flour 488和594缀合的二抗在rt下染色30分钟，洗涤，并用dapi复染。使用nikon a1r(美国纽约梅尔维尔(melville,ny,usa))拍摄共聚焦图像。
[0396]
单细胞转录物分析：使用10x genomics公司(10x genomics)(美国加利福尼亚州普莱森顿(pleasanton,ca,usa))试剂盒，按照制造商的说明进行单细胞测序。使用seurat算法，用10x genomics公司的cell ranger系列分析数据集。
[0397]
shrna敲低：由cellecta公司(cellecta)(美国加利福尼亚州山景城(mountain view,ca,usa))使用prsitep-u6tet-(sh)-ef1-tetrep-2a-puro质粒生成多西环素(dox)诱导的靶向plk1的shrna构建体。如先前所述(pmid：21189262)生成荧光素酶阴性对照。简而言之，将293t细胞与慢病毒包装质粒混合物(cellecta公司，目录号cpcp-k2a)和prsitep-shrna构建体共转染。转染后48收集病毒颗粒，然后通过amicon ultra-15离心过滤器将其浓缩10倍。感染时，将细胞与浓缩的病毒上清液在8μg/ml的聚凝胺存在下孵育过夜。然后洗
涤细胞以去除聚凝胺。在感染后48小时，在实验前用嘌呤霉素(1μg/ml)筛选细胞，进行3周以上。shrna靶序列为：plk1 shrna1：gttctttacttctggctatat(seq id no:7)；plk1 shrna2：ctgcaccgaaaccgagttatt(seq id no:8)。
[0398]
结果。
[0399]
plk1上调与mm患者的高风险疾病和复发相关。在新诊断的(mmrf)和复发难治性(mm010)数据集中分析plk1的表达。按无进展生存期和总生存期描绘生存期的变化。在这两个数据集中，较高的plk1表达与明显较低的无进展生存期和总生存期相关(图1a-图1d)。进一步评估了plk1在骨髓瘤基因组项目(mgp)的各个集群中的表达。发现plk1的表达在高风险集群中上调最多(数据未显示)。通过rna-seq分析来那度胺治疗开始前和发展耐药性后获得的12对mm患者分选的cd138+细胞样品的plk1表达。plk1表达在复发患者中显著上调(fdr《0.00001)(图1e)。12名复发患者中的每一个都表现出复发时plk1水平上调。对梅奥诊所(mayo clinic)基因表达数据集中plk1在mm疾病进展和复发的各个阶段的表达模式进行分析，结果显示plk1在复发患者队列中的表达显著增加，并在疾病进展后有增加的趋势(图1f)。
[0400]
在敏感细胞中，plk1信号传导响应于抗增殖化合物而下调。分析了泊马度胺对等基因敏感(ejm)和耐药(ejm-pr)以及mm1.s细胞系的影响。基于增殖的变化，mm1.s细胞系显示出对泊马度胺的最高敏感性，而ejm-pr的耐药性最强。为了确定plk1在泊马度胺响应中的作用，用泊马度胺治疗ejm和ejm-pr细胞系，并分析plk1水平和下游信号传导的变化。仅在敏感细胞中，泊马度胺治疗引起plk1水平及其下游效应子pcdc25c和cdc25c的剂量依赖性降低(图2a和图2b)。cdc25c基因的表达与mgp中plk1的表达显著相关。响应于泊马度胺，小脑蛋白底物ikaros和aiolos在泊马度胺敏感细胞中也下调。已证明抗增殖药剂(如化合物5)在介导底物降解中更有效。用浓度渐增的泊马度胺和化合物5处理的mms.1细胞显示出两种抑制剂对plk1信号传导的剂量依赖性降低(图2c)。与这两种抑制剂的活性差异一致，在与泊马度胺相比低十倍的剂量下，化合物5表现出plk1水平及其下游信号传导的降低。与ejm细胞相比，mms.1细胞系在匹配剂量的泊马度胺下表现出更突出的plk1水平降低，这与这两个细胞系对泊马度胺的敏感性差异相关。在mm1.s细胞中，进一步检验了plk1转录物水平响应于泊马度胺治疗的变化，并且治疗以剂量依赖性方式降低了plk1转录物水平(图2d)。进行共聚焦显微镜检查以研究mm1.s细胞中plk1和cdc25c染色的变化，并且观察到响应于泊马度胺和化合物5治疗，plk1水平降低，同时cdc25c染色也降低。此外，chip-pcr分析揭示aiolos和ikaros与plk1的转录起始位点(tss)结合，响应于泊马度胺，这种结合被消除(图2e)。对aiolos的chip-seq数据集的进一步分析证实了aiolos与plk1的tss的结合具有重叠的转录激活h3k27ac特征，该特征从gm12878细胞系的公开可用的chip-seq数据集(encode项目)推断。由于plk1水平的变化是由于响应于抗增殖化合物的plk1转录的降低，因此使用可诱导表达aiolos和ikaros shrna的mm1.s细胞分析了aiolos和ikaros敲低对plk1水平的影响。aiolos和ikaros敲低均导致plk1水平降低(图2f)，这表明小脑蛋白的底物对plk1的转录调节。
[0401]
化合物5治疗引起细胞周期的g2-m期减少。由于plk1在细胞周期的g2期和有丝分裂期起着重要作用，因此检验了响应于化合物5的细胞周期变化，结果显示化合物5治疗引起亚g1(对于媒介物、10nm的化合物5、30nm的化合物5和100nm的化合物5分别为5.02、4.98、
11.3和13.9)和g0-g1群体(对于媒介物、10nm的化合物5、30nm的化合物5和100nm的化合物5分别为69.2、75.8、78.3和75.1)的剂量依赖性增加，以及同时g2-m群体(对于媒介物、10nm的化合物5、30nm的化合物5和100nm的化合物5分别为16.3、12.3、6.94和6.27)的剂量依赖性减少。使用流式细胞术测量了磷酸化ser10-组蛋白h3(g2-m期的特定标志物)的变化。与整体细胞周期分布一致，响应于化合物5治疗，磷酸化ser10-组蛋白h3的水平也以剂量依赖性方式降低(对于媒介物、10nm的化合物5、30nm的化合物5和100nm的化合物5分别为16.5、9.3、6.37和4.53)。为了证明观察到的plk1信号传导的变化不是有丝分裂退出的结果，对诺考达唑和化合物5以及它们的组合处理细胞后各个时间点plk1信号传导的变化进行分析。诺考达唑使细胞同步处于细胞周期的g2-m期。在过夜诺考达唑处理挽救后30分钟、2小时和6小时的时间点，与媒介物条件相比，plk1水平更高(图3)。然后，由于诺考达唑处理后细胞周期同步化的挽救，plk1水平恢复正常。响应于化合物5处理，ikaros降解在处理30分钟后开始发生，而plk1和cdc25c水平的下调在治疗后48小时明显。响应于诺考达唑和化合物5的组合处理，plk1水平的降低加速。裂解的半胱天冬酶3的变化与plk1水平负相关，在化合物5处理后48和72小时，裂解的半胱天冬酶3增加，而plk1水平降低。细胞周期研究与这些时间点相匹配。诺考达唑处理显示了在挽救的早期时间点，g2-m细胞增加。化合物5处理引起g1细胞的初始增加，随后在48和72小时亚-g1细胞增加，g2-m细胞减少(数据未显示)。在诺考达唑与化合物5组合处理的情况下，观察到g2-m细胞的加速减少和亚g1细胞的更高增加。
[0402]
泊马度胺耐药细胞表现出激活的plk1信号传导和增加的有丝分裂。为了研究plk1在泊马度胺耐药性中的作用，分析了六个泊马度胺敏感和耐药等基因细胞系对，即amo1和amo1-pr(泊马度胺耐药的)、h929和h929-pr、k12pe和k12pe-pr、k12bm和k12bm-pr、ejm和ejm-pr以及mms.1和mms.1pr中的plk1、cdc25c和pcdc25c以及小脑蛋白的水平。这些细胞系是通过使它们在三-四个月的时间里暴露于浓度渐增的泊马度胺而开发的。在六个细胞系中的四个耐药版本中，plk1水平适度上调(图4a)。与亲本细胞相比，耐药细胞系还表现出不同程度的小脑蛋白水平损失。比较亲本和耐药细胞系的异步细胞周期分布研究证明在六个耐药细胞系中的五个中，g2-m细胞的比例增加(图4b)。为了进一步分析敏感和耐药细胞系之间plk1在细胞周期各阶段的表达变化，对amo1和amo1-pr细胞系进行了单细胞rna测序。基于细胞周期特征基因的基因表达聚类分析显示，plk1在细胞周期g2-m期的表达受到很大限制，并证实与amo1-亲本相比，plk1在amo1-pr细胞中的表达上调(数据未显示)。发现aiolos和ikaros在细胞周期的不同阶段都有更普遍的表达(数据未显示)。
[0403]
plk1抑制剂与化合物5的组合在amo1-pr细胞中表现出比amo-1亲本更强的活性。测试了plk1抑制剂bi2536和化合物5在amo1亲本和amo1-pr细胞系中作为单独药剂和组合的活性。bi2536与化合物5组合时，显示出增殖的剂量依赖性降低(图5a、图5c)。使用calcusyn软件进行的协同作用分析表明，在bi2536和化合物5的几个浓度下，组合处理具有协同作用(图5b、图5d)。响应于bi2536，amo1-pr细胞表现出更大幅度的增殖降低，并且在这些细胞中几个浓度的bi2536与化合物5是协同的。这些结果表明amo1-pr细胞对plk1信号传导的依赖性更高。另一个泊马度胺敏感和耐药细胞系对k12pe和k12pe-pr表现出bi2536和化合物5组合的类似协同活性(图5e、图5f、图5g、图5h)。使用单药剂处理及其组合，用膜联蛋白v和topro染色分析细胞凋亡的变化。与媒介物相比，bi2536的单药剂处理导致amo-1细胞的早期细胞凋亡(10.9％相对于2.69％)和晚期细胞凋亡(4.25％相对于2.24％)适度增
加(图5i)。与媒介物相比，化合物5处理显示早期细胞凋亡略有增加(4.86％相对于2.69％)，并且对晚期细胞凋亡几乎没有影响(3.07％相对于2.24％)。与媒介物相比，bi2536和化合物5的组合处理表现出早期细胞凋亡(22.7％相对于2.69％)和晚期细胞凋亡(7.09％相对于2.24％)更明显的增加。在amo1-pr细胞的情况下，bi2536单药剂相较于在amo-1亲本细胞中更有效，其中与媒介物相比，早期变化(23.2％相对于3.82％)和晚期变化(7.55％相对于2.77％)更明显。同样，在这些细胞中，与媒介物相比，bi2536与化合物5的组合表现出更高的早期(33.3％相对于3.82％)和晚期(11.8％相对于2.77％)细胞凋亡(图5j)。通过研究细胞周期和有丝分裂保真度的变化，探究了bi2536和化合物5处理的协同作用机制。在amo1细胞中，bi2536处理诱导了g2-m和多倍体群体的适度增加，这与报道的抑制剂的作用机制一致。化合物5引起g0-g1的适度增加和g2-m细胞的减少。与单药剂处理相比，组合处理表现出亚g1细胞的增加，这与细胞凋亡的变化一致。在amo1-pr细胞的情况下，与在amo1亲本细胞中相比，bi2536引起g2-m和多倍体以及亚g1细胞更显著的增加。与单独治疗相比，bi2536与化合物5的组合表现出亚g1细胞的更高的增加。在处理24和72小时后，分析了这些细胞系中响应于bi2536和化合物5的ikaros和促生存信号传导的变化(图5k)。在amo1和amo-1pr细胞中，ikaros水平响应于化合物5均降低。bi2536与化合物5的组合使得其在24小时的水平降低更多。因此，在amo1和amo1-pr细胞系中，组合处理后72小时，裂解的半胱天冬酶3水平增加更显著。在24小时时，与使用单药剂相比，使用bi2536与化合物5的组合时促生存信号传导标记物、存活蛋白和bcl2表现出更大的下降，这可能导致随后的细胞凋亡增强，通过裂解的半胱天冬酶3水平可见。存活蛋白基因的表达与plk1的表达显著相关。此外，为了研究amo1和amo1pr细胞中dapi染色响应于这些处理的变化而进行的共聚焦成像表明这些细胞系中bi2536和bi2536与化合物5组合的有丝分裂错误更高(数据未显示)。
[0404]
bi2536与化合物5的组合在难治性细胞中的协同细胞毒性。由于plk1在mgp的高风险群中表达更高，因此在难治性细胞系mc-car中分析了plk1抑制剂与化合物5的组合的活性。在mc-car细胞中，bi2536与化合物5的组合在不同浓度下表现出协同降低细胞增殖(图6a、图6b)。与单独处理相比，组合处理引起aiolos和ikaros水平更明显的降低(图6c)，以及随后亚g1停滞的增加(数据未显示)。
[0405]
plk1敲低使amo1和amo1-pr细胞的增殖下降、细胞凋亡增加。为了进一步确定plk1在耐药性中的作用，在amo1和amo1-pr细胞系中进行了可诱导的plk1敲低。两种可诱导的plk1 shrna在amo1和amo1-pr细胞系中表现出强大的plk1蛋白敲低，并且与对照shrna相比，在诱导敲低后的48和72小时引起细胞增殖的显著降低。在这两个细胞系中，敲低引起g2-m的停滞，以及48和72小时时的亚g1群体增加。细胞凋亡的分析进一步证实，在amo1和amo1-pr细胞系中由于使用plk1 shrna的敲低，细胞凋亡增加，其中amo1-pr细胞系表现出整体更高的细胞凋亡。
[0406]
在p53失调节段靶向plk1。为了进一步确定用于plk1靶向的临床可操作的mm患者节段，分析了plk1在双等位基因p53节段中的表达，因为plk1调节p53的稳定性。在mgp中，携带双等位基因p53的患者表现出plk1的表达显著升高(图7a)，表明这两种蛋白的拮抗关系。此外，与p53野生型amo1细胞相比，在双等位基因p53细胞系k12pe中plk1抑制剂bi2536显示出更高的活性(图7b)，表明了靶向功能失调的p53节段的潜力。
[0407]
实例2：bet抑制减少多发性骨髓瘤细胞系中的细胞增殖
[0408]
方法。
[0409]
患者和数据集。骨髓瘤基因组项目(mgp)是一项合作研究计划，旨在汇编和统一分析从mm患者获得的样品上产生的基因数据集。mgp数据集中来自ndmm患者的下一代测序(ngs)数据以所述的统一方式进行处理和分析。具有来自完整的mgp数据集(n＝1273)的完整数据集(n＝514)的患者用于本分析，该mgp数据集包括全外显子组和基因组测序(wes和wgs)、rna测序(rnaseq)、无进展生存期(pfs)和总生存期(os)。研究设计、数据收集和测序方法之间的差异导致mgp数据集中所有患者的所有数据特征的可用性不一致。
[0410]
细胞系：所有的mm细胞系(atcc，美国弗吉尼亚州马纳萨斯)都经过常规的支原体检测，并按照先前在实例1中的描述进行维持。
[0411]
抗体：在这些实验中，将几种抗体用于免疫印迹，这些抗体包括aiolos(目录号15103)、ikaros(目录号14859)、brd4(目录号13440)、c-myc(目录号5605)、裂解的半胱天冬酶3(目录号9664)、存活蛋白(目录号2803)、gapdh(目录号14c10)(均来自细胞信号传导技术公司(美国马萨诸塞州丹佛斯))、e2f2(目录号ab-138515，艾博抗公司，美国马萨诸塞州坎布里奇)、cks1b(目录号36-6800，英杰公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、prkdc(目录号4602，细胞信号传导公司(cell signaling)，美国马萨诸塞州丹佛斯)、nup93(目录号a303-979a，bethyl实验室(bethyl laboratories)，美国德克萨斯州蒙哥马利(montgomery,tx,usa))、rusc1(目录号nbp1-81006，诺伟思公司，美国密苏里州圣查尔斯)、rbl1(目录号ta811337，美国马里兰州罗克维尔(rockville,md,usa))、nuf2(目录号nbp2-43779，诺伟思公司，美国密苏里州圣查尔斯)、top2a(目录号pa5-46814，英杰公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)、ki67-fitc(目录号nbp2-2211f，诺伟思公司，美国密苏里州圣查尔斯)和裂解的半胱天冬酶3-af488(目录号ic835g，美国明尼苏达州明尼阿波利斯(minneapolis,mn,usa))。
[0412]
增殖和活力测定：通过在vi-cell-xr(贝迪公司(becton dickinson)，美国新泽西州富兰克林湖(franklin lakes,nj,usa))上用台盼蓝排斥监测细胞的活力来确定细胞生长曲线。使用(3h)-胸苷掺入进行增殖测定，一式三份，至少三次(n＝3)。将所有数据用graphpad prism 7(graphpad软件公司(graphpad software)，美国加利福尼亚州拉荷亚(la jolla,ca,usa))软件进行绘制并分析，以平均值与确定为
±
s.d的误差表示。
[0413]
免疫印迹：按照wes试剂盒(protein simple公司，美国加利福尼亚州圣何塞)的建议进行免疫印迹分析，每个至少两次(n≥2)，其中显示了最佳代表。
[0414]
rna提取、逆转录和实时pcr分析：使用rneasy plus试剂盒(凯杰公司，美国马里兰州日耳曼敦)提取总rna，并使用iscrip逆转录试剂盒(伯乐公司，美国宾夕法尼亚州费城)进行逆转录。使用taqman pcr master mix和viia 7实时pcr系统(应用生物系统公司，美国加利福尼亚州福斯特城)进行定量实时pcr(qpcr)分析。使用比较ct法(δδct法)在对gapdh水平进行归一化后计算基因表达。qpcr的引物序列列于下表中。
[0415]
用于转录物研究的mr和靶基因的引物及其序列列表
[0416][0417]
chip-seq研究：使用标准方法在df15、mm1.s和amo1细胞系中进行chip-序列实验。
[0418]
流式细胞术：根据制造商的方案，使用膜联蛋白v alexa fluor 488-缀合抗体(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和to-pro-3(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，并使用flow jo软件进行处理，进行至少三个独立实验。对于细胞周期分析，将细胞用pi染色试剂盒(艾博抗公司，美国马萨诸塞州坎布里奇)染色，并在flow jo v10软件上进行分析。
[0419]
共聚焦成像：将细胞培养在腔室玻片中，并且固定透化用于显微镜检查。将细胞与靶向cks1b、e2f2和ki67-fitc的一抗在1x细胞内染色缓冲液中在冷室中孵育2小时。然后将细胞用alexa flour 488和594缀合的二抗在rt下染色30分钟用于cks1b和e2f2，洗涤，并用dapi复染。使用nikon a1r(美国纽约梅尔维尔)拍摄共聚焦图像。
[0420]
shrna敲低：由cellecta公司(美国加利福尼亚州山景城)使用prsitep-u6tet-(sh)-ef1-tetrep-2a-puro质粒生成多西环素(dox)诱导的靶向cks1b、e2f2和brd4的shrna构建体。如先前所述(pmid：21189262)生成荧光素酶阴性对照。简而言之，将293t细胞与慢病毒包装质粒混合物(cellecta公司，目录号cpcp-k2a)和prsitep-shrna构建体共转染。转染后48收集病毒颗粒，然后通过amicon ultra-15离心过滤器将其浓缩10倍。感染时，将细胞与浓缩的病毒上清液在8μg/ml的聚凝胺存在下孵育过夜。然后洗涤细胞以去除聚凝胺。在感染后48小时，在实验前用嘌呤霉素(1μg/ml)筛选细胞，进行3周以上。shrna靶序列为：cks1b shrna1：5’gacccacagcctaagctgagt 3’(seq id no:53)；e2f2 shrna2：5’gtacgggtgaggagtggataa 3’(seq id no:54)，brd4 shrna1：5’gacgtgggaggaaagaaacag 3’(seq id no:55)，brd4 shrna2：5’gtgctgacgtccgattgatgt 3’(seq id no:56)，brd4 shrna3：5’cgcaagctccaggatgtgttc 3’(seq id no:57)，brd4 shrna4：5’gctcctctgacagcgaagact 3’(seq id no:58)。
[0421]
结果。
[0422]
mr在mdms8样细胞中的表达。mr的鉴定为探索它们在高风险mm生物学中的作用提供了机会。对一组骨髓瘤细胞系进行基于mdms8基因特征的富集评分，以推断样品中该特征的激活。这种方法确定了与mdms8的ge表型显著相关的各种细胞系。一个mdms8样细胞系(df15pr)和非mdms8样细胞系(mm1.s)被选作进一步功能实验的对照。qrt-pcr和蛋白质印迹实验显示，在mdms8样细胞系中，其中的两个mr(e2f2和cks1b)和下游基因(包括top2a和nuf2)在蛋白质和转录物表达水平上与对照组细胞系相比都有所上调(图8a和图8b)。cks1b和e2f2与它们的靶基因nuf2和top2a在mgp中的表达显示出显著的相关性(数据未显示)。mdms8样细胞增殖更快，并且平均加倍时间约为12.55
±
0.8小时，而对照组细胞系的平均加倍时间为17.6
±
2.2小时(p《0.05)。在异步细胞培养中，对mdms8样细胞系相对于对照细胞系之间的细胞周期阶段分布的分析显示，s1(16.9％相对于8.14％)和g2/m(23.5％相对于17％)的细胞比例增加，同时亚g1的部分减少(1.1％相对于7.7％)，显示出过度增殖行为。
[0423]
单细胞水平的mdms8 ge表型。为了进一步了解高风险表型和mr的功能，使用单细胞基因表达分析来探索mdms8 mr调节子是在全身内表达还是在肿瘤细胞的一个子集中表达。使用10x单细胞基因表达平台对对照和mdms8样细胞系进行转录分析。检查了异步生长的对照和mdms8细胞系，随后分析了e2f2和cks1b调节子，以及每个细胞中的mdms8 ge特征活性。tsne图(数据未显示)显示了富含mdms8特征的细胞，并且该分析证实，在mdms8样细胞系中，并非所有的细胞对这种表型呈现阳性，这表明mr活性仅限于整个细胞群体中的一部
分。活性细胞(那些具有mdms8表型的细胞)是根据经验阈值选择的，并且与对照细胞系相比，mdms8样细胞系中出现了其更高的子集(分别为》40％和《20％)。这些发现还表明，cks1b和e2f2这两个mr在控制mdms8样细胞的细胞周期谱方面更为重要(数据未显示)。
[0424]
cks1b和e2f2的预后和功能作用。分析了mgp患者中cks1b和e2f2表达与总生存期和无进展生存期(os、pfs)的关系，并且发现它们的较高表达与较低的os和pfs显著相关(图9a、图9b、图9c和图9d)。建立了shrna细胞系来进行cks1b和e2f2的敲低研究。敲低cks1b和e2f2后，mdms8样细胞的增殖明显降低，并且细胞凋亡增加(图9e)，这表明这两个mr在这些细胞的活力中的功能作用。
[0425]
brd4抑制剂对cks1b和e2f2及其靶基因的影响。cks1b和e2f2已被列为mm中的超级增强子(se)相关基因(loven,j.,等人,cell[细胞],2013,153(2):p.320-34)。为了从药理学上靶向cks1b和e2f2，在mdms8样和h929细胞系中使用了bet抑制剂jq1和化合物a。jq1和化合物a都表现出cks1b和e2f2蛋白水平的剂量和时间依赖性降低(图10a和图10b)。作为活性的替代物，分别针对cks1b和e2f2的靶基因nuf2和top2a的蛋白表达也减少了。bet抑制剂还促进了小脑蛋白底物、ikaros、aiolos和c-myc水平的降低。此外，还观察到p27水平的增加，它是cks1b信号传导的负调控因子。进行免疫荧光染色以分析cks1b和e2f2响应于jq1的定位和表达，并证实它们在mdms8样细胞中的核表达降低(数据未显示)。由于bet抑制剂主要在转录物水平上介导cks1b和e2f2的变化，因此分析了cks1b和e2f2响应于bet抑制剂的转录物水平。在mdms8样和h929细胞系中，bet抑制剂促进了cks1b和e2f2转录物水平的降低(图10c、图10d、图10e和图10f)。响应于bet抑制剂，nuf2、top2a、ikaros和aiolos的表达在转录物水平上也下调了(数据未显示)。为了确定se介导的cks1b和e2f2的调节，利用了靶向mm细胞系中se相关复合物的cdk7抑制剂。cdk7抑制剂thz1通过下调cks1b、e2f2、myc、aiolos和ikaros，显示了几个mm细胞系增殖的有效降低(数据未显示)。
[0426]
brd4与cks1b和e2f2上的se相关区域的结合。使用amo1和mm1.s细胞系的brd4-chip-seq数据，分析了brd4与cks1b和e2f2上的se相关区域的结合。观察到brd4与cks1b和e2f2上的se相关区域的稳健结合，并且响应于jq1，这种结合在两种细胞系中都被消除(数据未显示)。
[0427]
brd4敲低对cks1b和e2f2表达的影响。在k12pe和mdms8样细胞的背景下，建立了多西环素诱导的brd4敲低细胞系。在这两个细胞系中，四种不同的靶向brd4的shrna一致表现出cks1b和e2f2水平的降低(图11a、图11b)。brd4敲低也导致aiolos、ikaros和c-myc水平的降低，这与brd4抑制剂的发现一致。还分析了响应于brd4敲低的细胞增殖、细胞凋亡和细胞周期的变化。在k12pe和mdms8样细胞中，所有四种shrna都导致细胞增殖明显降低(图11c、图11d)。作为敲低的结果，细胞凋亡和细胞周期测定显示，细胞周期中g2-m期细胞凋亡增加，细胞比例减少，亚g1期的细胞比例增加(数据未显示)。
[0428]
1q扩增的mm细胞系中的brd4抑制。cks1b定位于1q 21.3，并且1q扩增是mm的高风险节段。对几个携带1q扩增的1q细胞系(u266、mm1.s、mdms8样、h929、kms11)与非1q扩增细胞系(mc-car)中的brd4抑制活性进行比较分析。如下表所示，观察到brd4抑制剂在1q扩增细胞系中的效力是非1q扩增细胞系的两倍至五倍。
[0429]
mm细胞系1q扩增细胞系jq1 ic
50
(μm)化合物a ic
50
(μm)mccar正常0.083520.09344
u2663x0.014820.03394mm1.s3x0.015210.02815df15/pr3x0.037820.03589h9293-4x0.051670.05407kms116-8x0.036180.04035
[0430]
泊马度胺(pom)对pom敏感和耐药细胞系中cks1b和e2f2的影响。据报道，cks1b和e2f2主要是通过分别调节p27和rb-cdk4-cdk6-ccnd1信号传导通路参与细胞周期，而免疫调节化合物通过促进mm细胞系的g1停滞而证实了细胞周期影响。基于这些报道，在等基因pom敏感和耐药ejm和ejm-pr细胞系中分析了cks1b和e2f2响应于pom的变化，并且发现这两个蛋白仅在pom敏感细胞中转录水平下调(图12)。由于aiolos在ejm-pr细胞系中没有被降解，这与cks1b和e2f2没有下调一致，分析了aiolos在cks1b和e2f2的转录起始位点(tss)上的结合。df15细胞系的chip-seq数据表明，aiolos在cks1b和e2f2的tss上与h3k27ac激活标志物结合(来自encode项目的gm12878细胞系的支持性数据)，表明了这两个蛋白在aiolos下游的作用(数据未显示)。分析了brd4抑制剂对四个等基因pom敏感和耐药细胞系对(k12pe、k12pe-pr、amo1、amo1-pr、h929、h929-pr、df15、df15-pr)的影响，结果显示无论其对pom的耐药性如何，这些细胞系对brd4抑制剂都同样敏感(数据未显示)。
[0431]
brd4抑制剂和抗增殖化合物的组合活性。基于brd4抑制剂和pom对cks1b、e2f2和小脑蛋白底物的活性，通过将brd4抑制剂与这些化合物组合，探究了增殖的变化。jq1与len、pom、化合物5和化合物6组合在k12pe细胞中显示增殖的剂量依赖性降低(图13a、图13c、图13e、图13g)。使用calcusyn软件进行的协同作用分析表明，在jq1和len、pom、化合物5和化合物6的几个浓度下，组合治疗具有协同作用(图13b、图13d、图13f、图13h)。该组合还能协同降低pom耐药性的k12pe-pr细胞系的增殖(图13i至图13p)。分析了信号传导响应于brd4抑制剂与len、pom、化合物5和化合物6的组合治疗的变化。与单一疗法相比，在组合治疗中，jq1与len、pom、化合物5和化合物6的组合引起aiolos、ikaros、cks1b、e2f2、myc、存活蛋白水平更大幅度的降低，以及裂解的半胱天冬酶3更高的增加(图13q)。此外，细胞周期和细胞凋亡测定证实，与单一疗法相比，brd4抑制剂与len、pom、化合物5和化合物6组合治疗时，g2-m的降低和细胞凋亡的增加更为显著(数据未显示)。
[0432]
实例3：nek2抑制减少多发性骨髓瘤细胞系中的细胞增殖
[0433]
细胞系。本研究中使用的细胞系是amo1、h929、k12pe、mmis，购自美国atcc。将细胞在补充有l-谷氨酰胺、丙酮酸钠、胎牛血清、青霉素和链霉素(均来自英杰公司)的rpmi 1640培养基中培养。泊马度胺耐药细胞系amo1、h929、k12pe、mmis如先前所述生成(bjorklund等人,j biol chem.[生物化学杂志]2011,286(13):11009-11020)。
[0434]
nek 2抑制剂。使用两种nek2的抑制剂——不可逆抑制剂jh295和可逆抑制剂rac-cct 250863(图克里斯生物科学公司(tocris bioscience))。jh295和rac-cct 250863都是nek2的选择性抑制剂，并且对其他激酶(包括cdk1和极光b)的影响较小。另外，jh295和rac-cct 250863不影响plk1、双极纺锤体组装或纺锤体组装检查点。(henise等人,j med chem.[医药化学杂志]2011,54(12):4133-4146；innocenti等人,j med chem.[医药化学杂志]2012,55(7):3228-3241)。
[0435]
抗体。在这个实例中，将抗体用于免疫印迹和流式细胞术。使用的抗体是：nek2(圣
克鲁斯生物技术公司(santa cruz biotechnologies)，目录号55601)、aiolos(细胞信号传导技术公司，目录号15103)、ikaros(细胞信号传导技术公司，目录号14859)、zfp91(内部抗体)、gapdh(细胞信号传导技术公司，目录号2118)。
[0436]
共聚焦成像。将细胞培养在腔室玻片中，并且固定透化用于显微镜检查。将细胞与nek2特异性的一抗在1x细胞内染色缓冲液中于冷室中孵育2小时。然后将细胞用alexa flour 488缀合的二抗在rt下染色30分钟，洗涤，并用dapi复染。使用nikon a1r(美国纽约梅尔维尔)拍摄共聚焦图像。
[0437]
增殖和活力测定。通过在vi-cell-xr(贝迪公司(becton dickinson)，美国新泽西州富兰克林湖(franklin lakes,nj,usa))上用台盼蓝排斥监测细胞的活力来确定细胞生长曲线。将细胞系一式三份在96孔圆底板中用指定的药物浓度或敲低细胞进行铺板。使用根据制造商规格使用的wst-1四唑盐(罗氏应用科学公司(roche applied science))试剂或通过先前所述的(3h)-胸苷掺入(bjorklund等人,blood cancer journal[血液癌症杂志]5,e354,2015)进行增殖测定，一式三份，至少三次(n＝3)。将所有数据用graphpad prism 7(graphpad软件公司(graphpad software)，美国加利福尼亚州拉荷亚(la jolla,ca,usa))软件进行绘制并分析，以平均值与确定为
±
s.d的误差表示。
[0438]
免疫印迹。按照wes试剂盒(protein simple公司，美国加利福尼亚州圣何塞(san,ca,usa))的建议进行免疫印迹分析，每个至少两次(n≥2)，其中显示了最佳代表。
[0439]
流式细胞术。根据制造商的方案，使用膜联蛋白v alexa fluor 488-缀合抗体(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)和to-pro-3(赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)，并如前所述，使用flow jo软件进行处理，进行至少三个独立实验。对于细胞周期分析，将细胞用碘化丙啶(pi)染色试剂盒(艾博抗公司，美国马萨诸塞州坎布里奇)染色，并在flow jo v10软件上进行分析。
[0440]
双参数测定法用于检测细胞周期和细胞凋亡。根据公开的方案周期(rieger等人,j vis exp.[视频实验期刊]2011,(50):2597；l
é
once等人,mol pharmacol.[分子药理学]2001,60(6):1383-1391)用膜联蛋白v-fitc和碘化丙啶进行细胞活力测定。
[0441]
结果：
[0442]
nek2上调与mm患者的高风险疾病和复发相关。产生了新诊断的多发性骨髓瘤(ndmm)的分子分类，其将ndmm分为12个不同的分子定义的疾病节段(mdms 1-12)。该综合分析确定了分子定义的疾病节段8(mdms8)为临床结果最差的高风险集群。对mdms8的进一步分析显示了几个染色体不稳定(cin)基因的上调。在约10％的ndmm群体中发现了一个特殊的cin基因——nek2的异常表达。较高的nek2表达与较低的无进展生存期和总生存期显著相关(p值分别为1.733e-05
和1.365e-03
)(图14a、图14b)。在基于来那度胺的试验中，对12对样品进行了nek2表达的评估。使用rna seq测量初治和复发样品中nek2的表达，并且发现疾病复发时nek2表达显著增加(fdr《0.0001，图14c)。据先前报道，nek2表达增加与耐药性和复发相关(zhou等人,cancer cell[癌细胞]23(1),p48-62,2013)。为了进一步证实这一点，通过持续的药物暴露产生了mm1s、df15和u266泊马度胺耐药细胞系。等基因药物敏感和耐药细胞系对的rna seq分析显示，与药物敏感细胞系相比，耐药细胞系中nek2的表达显著上调(图14d)。免疫细胞化学结合共聚焦显微镜检查也显示，与亲本细胞系相比，耐药骨髓瘤细胞系中nek2在细胞核中的表达增加(数据未显示)。这些发现表明，nek2表达的增加与预
后不良、获得性耐药和疾病复发相关。
[0443]
为了进一步验证nek2表达升高与生存不良之间的关系，在另外的骨髓瘤数据集中进行了卡普兰迈耶分析：新诊断的mmrf和新诊断的dfci以及复发的难治性mm0010数据集。在新诊断的mmrf和复发的难治性mm0010数据集中，nek2表达升高与不良pfs(图15a和图15e；分别在nd mmrf和mm0010中p值《6.4e-06
和0.0027)和os(图15b和图15f；分别在nd mmrf和mm0010中p值《0.0058和0.00033)显著相关。nek2表达升高也显示dfci数据集的pfs和os不佳，但没有统计学意义(图15c和图15d)。
[0444]
nek2抑制减少mm细胞系中的细胞增殖。为了测试nek在骨髓瘤生物学中的功能作用，在有不可逆抑制剂jh295(henise等人,j med chem.[医药化学杂志]2011,54(12):4133-4146)和可逆抑制剂rac-cct250863(innocenti等人,j med chem.[医药化学杂志]2012,55(7):3228-3241)存在的情况下，分析了nek2化学抑制对mm细胞增殖的影响。观察到nek2抑制对多发性骨髓瘤细胞系(h929、amo1、k12pe和mc-car)有强烈的抗增殖影响。在治疗后第3天，对于h929、amo1、k12pe和mc-car细胞系，jh295的ic
50
浓度分别为0.37μm、0.48μm、4μm和0.56μm。在治疗后第3天，对于h929、amo1和k12pe细胞系，rac-cct 250863的ic
50
浓度分别为8.0μm、7.1μm和8.7μm。
[0445]
nek2抑制剂降低泊马度胺敏感和耐药细胞系的增殖。发现更高的nek2表达与获得性耐药性相关(图14d)。通过用浓度渐增的jh295和rac-cct 250863抑制剂处理三种等基因的泊马度胺敏感和耐药(pr)细胞系(h929、h929-pr、amo1、amo1-pr、k12pe、k12pe-pr)，评估泊马度胺耐药细胞系中nek2抑制的影响。分析jh295和rac-cct250863抑制剂对增殖的影响。两种nek2抑制剂均降低了泊马度胺敏感和耐药细胞系的增殖。对于h929、h929-pr、amo1、amo1-pr、k12pe和k12pe-pr细胞系，jh295的ic
50
浓度分别为0.37μm、0.27μm、0.48μm、0.31μm、4.00μm和10.8μm。对于h929、h929-pr、amo1、amo1-pr、k12pe和k12pe-pr细胞系，rac-cct 250863的ic
50
浓度分别为7.90μm、5.20μm、7.00μm、3.60μm、8.50μm和5.17μm。在泊马度胺耐药细胞系中，jh295比rac-cct 250863更有效，并且jh295更有效地降低h929-pr和amo1-pr细胞系的增殖(与这两种细胞系的亲本对应物相比)。这显示耐药系对nek2抑制的脆弱性更高。与h929和amo1细胞系相比，h929 pr和amo1 pr中nek2抑制剂更低的ic
50
值说明，在耐药细胞系中对nek2抑制剂的敏感性增加，这说明耐药细胞系对nek2表达的依赖性增加。
[0446]
nek2敲低降低药物敏感和耐药mm细胞系的细胞增殖。为了研究nek2敲低对mm细胞增殖的影响，通过两到三周时间内的嘌呤霉素选择建立了四环素诱导的nek2 shrna细胞系。在多西环素诱导后，在df15和df15-pr背景的三个nek2 shrna细胞系中观察到nek2的明显敲低，导致df15和df15-pr细胞系的细胞增殖均明显降低(数据未显示)。在amo1和amo1-pr背景下也创建了nek2 shrna细胞系，并且在这两个细胞系中诱导后观察到nek2蛋白的稳健下调(数据未显示)。在amo1和amo1-pr细胞系中，nek2敲低均导致增殖降低(数据未显示)。这些结果表明，nek2敲低导致药物敏感以及耐药细胞系的增殖减少。
[0447]
nek2抑制表现出与抗增殖化合物的强烈协同作用。使用jh295和rac-cct 250863抑制剂与化合物5和化合物6进行了组合实验。五种浓度(0.016、0.08、0.4、2和10μm)的jh295和rac-cct 250863与浓度渐增的化合物5和化合物6组合，并且在amo1和amo1-pr细胞系中研究了组合活性。在这两个细胞系中，jh295和rac-cct 250863与化合物5和化合物6的
组合引起增殖的浓度依赖性降低(图16a、16c、16e、16g、16i、16k、16m和16o)。使用calcusyn方法分析了这些组合数据集的协同作用，并且发现nek2抑制剂(jh295和rac-cct250863)与化合物5和化合物6之间有很强的协同作用(图16b、16d、16f、16h、16j、16l、16n和16p)。进一步显示，nek2抑制剂和化合物5和化合物6的组合对耐药细胞系更有效。与amo1系相比，在amo-pr细胞系中发现了几个更强协同浓度的nek2i+化合物5和化合物6的组合。用mms.1、k12pe和k12pe-pr细胞系重复类似的实验，并且在mms.1、k12pe和k12pe-pr细胞系中观察到化合物5和化合物6与nek2抑制剂之间的强烈协同作用(数据未显示)。
[0448]
为了进一步确认协同作用，将shrna敲低与化合物5或化合物6治疗组合。诱导amo1细胞系中对照和nek2 shrna的表达，然后将细胞暴露在浓度渐增的化合物5和化合物6中。结果通过增殖测定进行测量。nek2敲低的细胞对化合物5和化合物6治疗显示出更大的脆弱性。与对照shrna细胞系相比，nek2敲低的组合使化合物5的活性增加了5倍(对照细胞中化合物5的ic
50
＝0.1053μm相对于nek2敲低的细胞中化合物5的ic
50
＝0.01870μm)，化合物6的活性增加了10倍(对照细胞中化合物6的ic
50
＝0.02965μm相对于nek2敲低的细胞中化合物6的ic
50
＝0.002892μm)。
[0449]
为了进一步证实nek2敲低与化合物5和化合物6组合的协同影响，将nek2敲低细胞与媒介物、化合物5和化合物6一起孵育，并通过膜联蛋白v染色测量细胞凋亡的诱导。当nek2敲低与化合物5或化合物6组合时，观察到凋亡细胞的大幅度增加(图17)。定量结果显示，与dmso对照相比，nek2 shrna敲低与化合物5或化合物6组合使凋亡细胞的百分比增加了2-3倍。
[0450]
nek2下调对化合物5和化合物6诱导的底物降解的影响。用泊马度胺、化合物5和化合物6以及不同浓度的nek2抑制剂jh295的组合处理t细胞，并通过免疫印迹分析底物蛋白表达(ikaros(ikzf1)、aiolos(ikzf3)和zfp91)。与dmso对照相比，单药剂nek2抑制剂jh295对底物降解没有影响。同样，泊马度胺、化合物5和化合物6与jh295的组合对底物降解没有显示任何明显的影响。还研究了nek2敲低对泊马度胺介导的底物降解的影响。将对照和nek2 shrna细胞与不同浓度的泊马度胺进行孵育。泊马度胺治疗使ikaros(ikzf1)、aiolos(ikzf3)和zfp91以浓度依赖性方式在对照shrna系中降解。在nek2敲低细胞系中维持了类似的底物降解模式。这些实验证明，nek2敲低不影响化合物5、化合物6和泊马度胺的底物降解动力学。
[0451]
nek2敲低和组合优先杀死细胞周期中g1/s期的细胞。分析了nek2敲低的细胞周期效应。nek2活性在细胞周期的g2/m期优先需要(fry等人,j cell sci.[细胞科学杂志]2012,125(pt 19):4423-4433)，其中它通过hec1磷酸化参与中心体分离(hayward等人,cancer lett[癌症通讯]237:155-166,2006.；o'regan等人,cell div.[细胞分裂]2007,2:25)和动粒微管附着(randywei、bryan ngo、guikai wu和wen hwa lee:phosphorylation of the ndc80 complex protein,hec1,by nek2 kinase modulates chromosome alignment and signaling of the spindle assembly checkpoint.[nek2激酶对ndc80复合蛋白hec1的磷酸化调节染色体排列和纺锤体组装检查点的信号传导](2011)molecular biology of the cell[细胞分子生物学]22:19,3584-3594)。使用pi染色分析对照和nek2shrna细胞的细胞周期谱。同时，通过相同样品的膜联蛋白v染色测量凋亡细胞的百分比。观察到在药物敏感和耐药的细胞系中，nek2 shrna诱导后凋亡细胞增加。没有观察到对
细胞周期谱的影响(数据未显示)。nek2敲低细胞在细胞周期中循环，没有任何细胞在细胞周期的g2/m期积累。然后用mitocheck(https://www.mitocheck.org/)的数据探索nek2对有丝分裂的影响。比较hela细胞中plk1和nek2敲低实验的数据，显示plk1敲低给予强烈的前中期停滞，而细胞在长时间的有丝分裂停滞后发生细胞凋亡，并且100％的细胞遵循类似的有丝分裂停滞和细胞凋亡的过程(数据未显示)。nek2敲低细胞在细胞周期中保持循环，并间歇性地发生细胞凋亡，这一点从几个细胞周期后突然诱导的细胞核碎裂中可以看出。在nek2敲低细胞中观察到三种不同的表型：表型1：产生非整倍体细胞。表型2：在正常的细胞周期后，两个子细胞在随后的细胞周期中发生细胞凋亡。表型3：在正常的细胞周期后，只有一个子细胞在随后的细胞周期中发生细胞凋亡。
[0452]
泊马度胺治疗与nek2抑制的组合增加细胞凋亡。进行双参数膜联蛋白v和碘化丙啶(pi)测定以分析同一样品中的细胞周期和细胞凋亡，并量化在细胞周期的每个阶段经历细胞凋亡的细胞的比例(rieger等人,j vis exp.[视频实验期刊]2011,(50):2597；l
é
once等人,mol pharmacol.[分子药理学]2001,60(6):1383-1391)。用泊马度胺处理对照shrna和nek2 shrna细胞系，并在两个细胞周期的持续时间内跟踪细胞周期和细胞凋亡。在72小时，相对于nek2 shrna细胞系有21.1％的凋亡细胞而言，对照shrna系约有5.04％的细胞凋亡。这显示与对照系相比，nek2 shrna细胞系中泊马度胺更强的细胞凋亡诱导。相同样品的细胞周期和细胞凋亡分析显示，大多数凋亡细胞来自细胞周期的g1-s期。在96小时，对照shrna系中约9.5％的细胞和nek2 shrna细胞系中24.7％的细胞凋亡，并且大多数凋亡细胞又是来自细胞周期的g1-s期。这一分析显示，抗增殖化合物如泊马度胺主要作用于细胞周期的g1/s期，而nek2抑制作用于细胞周期的g2/m期。这两种药剂的组合导致每个周期中20％-25％的细胞出现细胞凋亡，其中大多数凋亡细胞来自细胞周期的g1/s期。综上所述，结果显示经nek2抑制剂处理和敲低的细胞不发生有丝分裂停滞，但它们随着时间的推移发生有丝分裂缺陷积累，并且最后因泊马度胺处理而从细胞周期的g1/s期发生细胞凋亡。
[0453]
实例4
[0454]
本实例的方法和实验资料(例如，增殖测定、免疫印迹和流式测定增殖、信号传导和细胞凋亡的变化)与实例1中描述的其他靶点的那些类似。
[0455]
曲美替尼响应与mm细胞系中的p-erk-1/2水平相关，与ras/raf突变状态无关。为了分析p-erk-1/2表达与曲美替尼活性之间的关系，在几个p-erk-1/2高表达(u266、h929、amo1、mc-car、karpas-620、kmm-1、kms-20、molp8)和p-erk-1/2低表达(k12pe、ejm、lp1、df15、df15pr、rpmi-8226)的mm细胞系中进行增殖测定。这些结果在下表中示出。与p-erk-1/2低表达的细胞系相比，p-erk-1/2高表达的细胞系对曲美替尼明显更敏感。
[0456][0457][0458]
曲美替尼与免疫调节化合物、化合物5和化合物6在泊马度胺敏感和耐药细胞中显示出协同作用。还进行了增殖测定，分析曲美替尼与免疫调节化合物(len和pom)或化合物5或化合物6在泊马度胺敏感和泊马度胺耐药的amo1和amo1-pr细胞系中的组合活性。结果显示在图18a至图18h中。这些增殖测定证明了曲美替尼与免疫调节化合物、化合物5和化合物6的强烈协同作用。
[0459]
曲美替尼和化合物6的组合在amo1-pr细胞系中协同降低erk、etv4和myc信号传导。为了建立曲美替尼与化合物6之间协同作用的机制基础，进行了免疫印迹检测p-erk、etv4、aiolos、ikaros、irf4、irf5、irf7和myc信号传导的变化。结果如图19所示。与单一疗法相比，曲美替尼和化合物6的组合证实p-erk、etv4、myc和irf4水平的降低幅度更大，并且干扰素基因irf5和irf7的水平增加。
[0460]
曲美替尼与化合物6的组合增加amo1和amo1-pr细胞系的细胞凋亡。在第3天和第5天，进一步分析了曲美替尼与化合物6的组合对amo1和amo1-pr细胞系中的细胞凋亡的影响。在这两个细胞系中，与单一疗法相比，曲美替尼与化合物6的组合在第3天(图20a)和第5天(图20b)显示出更高的细胞凋亡。
[0461]
曲美替尼与化合物6的组合减少amo1和amo1-pr细胞系的g2-m和s期细胞。为了分析曲美替尼与化合物6之间的协同作用的细胞周期相关机制，对响应于组合疗法和单一疗法的细胞周期进行了研究。细胞周期结果证实，在第3天(图21a)和第5天(图21b)，与单一疗
法相比，响应于组合治疗，细胞周期的g2-m和s期降低幅度更大。
[0462]
实例5
[0463]
本实例的方法和实验资料(例如，增殖测定、免疫印迹和流式测定增殖、信号传导和细胞凋亡的变化)与实例1中描述的其他靶点的那些类似。
[0464]
birc5抑制剂ym155降低pom敏感和耐药细胞系的增殖。骨髓瘤基因组项目中的birc5高表达的mm患者(数据来自骨髓瘤xi试验、dana-faber癌症研究所(dana-faber cancer institute)/法语国家骨髓瘤研究组织(intergroupe francophone du myelome)和多发性骨髓瘤研究基金会commpass研究，这些都有报道)表现出更差的pfs(图22a)和os(图22b)。用birc5抑制剂ym155处理amo1、amo1-pr、k12pe、k12pe-pr细胞系证明了与亲本细胞系amo1(ec
50
＝1.09nm)和k12pe(ec
50
＝1.47nm)相比，amo1-pr(ec
50
＝0.12nm)和k12pe-pr(ec
50
＝1.07nm)对birc5抑制剂的敏感性更高。
[0465]
birc5(存活蛋白)响应于化合物5而下调，导致晚期细胞凋亡。在mm等基因泊马度胺敏感和耐药细胞系中研究了birc5表达，并且几个泊马度胺耐药细胞系表现出birc5的表达增加(图23a)。在48和72小时，响应于化合物5治疗，birc5水平降低，随后mm1.s细胞系开始细胞凋亡(图23b)。
[0466]
ym155与化合物5或化合物6协同降低泊马度胺敏感和耐药细胞系的增殖。用剂量渐增的ym155与化合物5或化合物6处理amo1和amo1-pr细胞系，并进行增殖测定。结果显示在图24a至图24h中。使用calcusyn进行的组合分析显示，ym155与化合物5或化合物6在amo1和amo1-pr细胞系中都具有协同活性。
[0467]
birc5的敲低降低了mm细胞系的增殖。开发了多西环素诱导的birc5敲低细胞系。birc5敲低降低了amo1-pr细胞的增殖(图25a)。birc5敲低也下调了高风险相关基因foxm1的表达(图25b)。
[0468]
ym155对birc5的抑制也下调了foxm1和促生存信号传导。高风险相关基因birc5和foxm1在骨髓瘤基因组项目中表现出显著的共表达，表明它们的共调节(图26a)。ym155对birc5的抑制以剂量依赖性方式下调了amo1-pr和k12pe-pr细胞系中foxm1的表达(图26b)。
[0469]
上述实施例旨在仅是示例性的，并且本领域技术人员将认识到或将仅使用常规实验就能够确定特定化合物、材料和程序的许多等效方案。所有这类等效方案均被认为在本发明的范围内并且由所附权利要求书涵盖。
[0470]
已经引用了许多参考文献，其披露内容通过引用以其整体并入本文。