专利名称：治疗癌症的新方法
技术领域：
本申请涉及肿瘤学及化疗领域，尤其为癌症治疗提供了新方法。
背景技术：
肿瘤可以特异性的使非典型、具有潜在免疫反应性的抗原进行表达，这类抗原被总称为肿瘤抗原。大量证据表明，免疫系统未能有效抑制肿瘤进行性生长的原因并非为可识别肿瘤抗原的缺乏。人们对肿瘤免疫抑制反应以及肿瘤免疫逃逸机制的尚未完全了解。近来研究表明，通过降低色氨酸的局部浓度，使细胞毒性T细胞产生耐受性；该细胞可被吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)激活。
IDO属氧化还原酶，可催化色氨酸分解代谢中的限速步骤。其结构与色氨酸双氧酶(TDO)不同，后者在食物色氨酸的肝内分解代谢中起作用。IDO为干扰素-γ(IFN-γ)的靶向基因，可能在免疫调节中发挥作用。(Mellor和Munn(1999)Immunol.Today.20469-473)。IDO活性的增加使得局部细胞环境中色氨酸的水平减少。激活抗原呈递细胞上的IDO(受IFN-γ调控)可阻断T细胞活性；该细胞对色氨酸的减少特别敏感。T细胞在活化前，须经过1～2个分裂周期；当色氨酸被消耗后，T细胞始终处于G1期。上述情形表明，IDO具有抑制辅助T细胞1(TH1)反应的作用；该反应可促进T细胞发育。
IDO在免疫抑制反应中的主要作用可由1-甲基-色氨酸(1MT)的功能得以证实；1MT是一种特异性、具生物活性的IDO抑制剂(Cady和Sono(1991)Arch.Biochem.Biophys.291326-333)，可诱发MHC(主要组织相容复合体)限制性且经T细胞调节的异源小鼠的基因表达。(Mellor等.(2001)Nat.Immunol.264-68；Munn等(1998)Science.2811191-1193)。IDO的上述作用与其在胎盘滋养层细胞中高水平表达相一致。(Sedlmayr等.(2002)Mol.Hum.Reprod.8385-391)。
特别是，已经证实在人类肿瘤和/或癌症患者中IDO活性常增加。(Yasui等.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.美国.836622-6626；Taylor and Feng(1991)FASEB J.52516-22)。IDO具有调节免疫反应的作用；因而推断，癌症患者体内IDO水平上升，可诱发肿瘤免疫抑制反应。(Mellro和Munn(1999)Immunol.Today.20469-473；Munn等.(1999)J.Exp.Med.1891363-1372；Munn等.(1998)Science.2811191-1193)。下列发现可证实上述推断在多种癌症(包括乳腺癌)中，有益的免疫功能丧失；该功能有助于限制恶性肿瘤的发展。例如，在癌症进展过程中，TH1反应(以IFN-γ生成为标志)受到抑制；该反应可诱发细胞毒性T细胞的产生。因而可以假设，若IDO可通过抑制T细胞活性促进癌症发展，则抑制动物体内IDO水平能阻碍肿瘤生长，其机制在于逆转IDO调节性免设抑制反应。但在小鼠模型中，给予IDO抑制1-甲基-色氨酸(1MT)后，只能延缓而非阻止肿瘤生长(Friberg等.(2002)Int.J.Cancer 101151-155；美国专利6,482,416)。
在正常与疾病状态下，细胞信号转导(即一系列从细胞外至细胞内的事件)是细胞功能的一个方面。人们已经识别出多种具有信号转导功能的蛋白质分子，包括受体与非受体酪氨酸激酶、磷酸酶、以及其他具有酶活性或调节功能的分子。通常，这些分子能与其他蛋白质发生特异性结合，形成信号复合体，从而调节细胞增殖。
信号转导的异常可导致恶性肿瘤的形成、生长及进展。因而，信号转导通路抑制剂可用于治疗癌症。过去几年间，已研制出多种信号转导抑制剂(STI)，日前仍需对其抑制肿瘤生长的作用进行观察。
发明概述按照本申请的一个方面，提供了一种治疗需要其的患者中的癌症的方法，该方法通过施用专利有效量的至少一种化合物本发明所述的的具有IDO抑制活性的化合物。该化合物可经药学可接受载体介质给药。
本发明的另一实施方式中，提供一种治疗需要其的患者中的癌症的方法，该方法通过同时或顺序施用治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂和至少一种信号转导抑制剂(STI)。在本发明的特定实施方式中，至少一种STI选自bcr/abl激酶抑制剂、表皮生长因子(EGF)受体抑制剂、her-2/neu受体抑制剂、以及法呢基转移酶抑制剂(FTI)。这些化合物可经药学可接受载体介质给药。
按照本发明的另一实施方式，提供一种治疗需要其患者中的癌症的方法，该方法通过同时或顺序施用治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂与至少一种化疗药物。在本发明的特定实施方式中，至少一种化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫杉醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。这些化合物可经药学可接受载体介质给药。
根据本申请的另一方面，提供一种治疗需要其患者中的癌症的方法，该方法通过同时或顺序施用治疗有效量的至少一种免疫调节剂(除IDO抑制剂外)，和至少一种细胞毒性化疗药物、至少一种STI，或至少一种细胞毒性化疗药物与至少一种STI的联合。在一特定实施方式中，至少一种免疫调节剂选自CD40L、B7、B7RP1、抗CD40、抗CD38、抗ICOS、4-IBB配体、树突状细胞癌疫苗、(白细胞介素2)IL2、IL 12、ELC/CCL19、SLC/CCL21、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)、IL-4、IL-18、肿瘤坏死因子、IL-15、巨噬细胞衍化趋化因子(MDC)、干扰素a/b(IFN a/b)、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)、IL-3，粒细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、IL-13、以及抗IL-10。在另一特定实施方式中，至少一种细胞毒性化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氮甲蝶呤、环磷酸胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。实施本发明这个方面的STI如前所述。
在本发明的另一实施方式中，提供一种在需要其的患者中治疗慢性病毒性传染病的方法，该方法提供同时或顺序施用治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂与至少一种化疗药物。至少一种化疗药物可以选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酸胺、CPT-11、5-氟尿密啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。泰素和顺铂由Hanna制药有限公司(德国威明顿市)提供。
在本发明的一个特定实施方式中，被治疗的慢性病毒性感染选自乙性肝炎病毒(HCV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、柯萨奇病毒、以及人体免疫缺陷病毒(HIV)。在一特定实施方式中，所述的化合物可以经药学可接受载体介质给药。
附图简述
图1A与1B显示了对IDO抑制剂进行酶分析的结果。在人类IDO研究中，当A)1MT与B)MTH-色氨酸水平升高时，对酶动力学数据进行总体非线性回归分析。采用Prism4软件包(GraphPad)进行数据的绘图和分析。1MT的最适Ki值为34.6μM，而MTH-色氨酸的最适Ki值为11.4μM。
图2显示细胞水平IDO抑制剂的分析结果。在1MT抑制IDO、1MT抑制TDO、以及MTH-Trp抑制IDO试验中，运用2log量扩增研究。采用Prism4软件包(GraphPad)进行数据的绘图和分析。通过非线性回归分析得到Hillslope和EC50的数值。
图3是犬尿氨酸代谢途径的示意图。IDO为一种存在于肝外的、可诱导IFN-γ的氧化还原酶。N-甲酰基犬尿氨酸为IDO反应产物，可被迅速水解成犬尿氨酸。由于组织中进一步代谢犬尿氨酸的酶缺乏或无活性，故犬尿氨酸分布于组织与血液的之间。虽然它是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成途径的中间产物，犬尿氨酸的主要清除方式为在肝脏和/或肾脏转化成黄尿酸后经尿液排出。(Takikawa等(1986)J.Biol.Chem..2613648-3653；Thomas和Stocker(1999)Redox.Report4199-220)。
图4A-D显示，对小鼠血清进行高效液相色谱分析所得的色谱图。在4℃下对收集的血液样本进行隔夜培养并去除血凝块制备得到血清。采用TCA沉降分离蛋白质。将试验样本置于浸泡在平衡缓冲液的250mm×4.5mm Luna 5μC18柱内进行溶解，该平衡缓冲液含20％MeOH、5％氰化甲烷、10mM KPO4(pH5.3)和0.15mM EDTA。从处理如下的雄性FVB系小鼠制备血清样本A)未处理的(将血清与30μM的下列每一种对照化合物混合色氨酸、犬尿氨酸和1MT)；B)未处理的(可测得55μM的血清色氨酸)；C)LPS刺激24小时(可测得5.6μM的犬尿氨酸)；D)皮下植入1MT丸3天(可测得104μM的1MT)。在6.66和14.5分钟时对输出敏感度进行调整，以得到最佳化预期峰高值。Ky＝犬尿氨酸，W＝色氨酸，1MT＝1-甲基-色氨酸。
图5是表示拟处理(未处理的)或用1MT、L-744，832(FTI)、1MT加L-744，832、或1MT加或未加某些化疗药物处理的MMTVneu小鼠中肿瘤体积发生变化的示图。每一数据点对应一个试验小鼠，条状图表示数据点(列于图下方)的均值。
图6显示，对多种IDO抑制剂候选物进行体外生化分析后的筛选结果。所得数据与犬尿氨酸在无IDO抑制剂时条件下的含量相关。
图7A与7B显示，对多种IDO抑制剂候选物进行细胞水平分析后的筛选结果。图7A中的数据与犬尿氨酸在无IDO抑制剂时条件下的含量相关。图7B显示与荧光度有关的数据，该荧光度标志着犬尿氨酸的生成(即IDO活性)。利用空表达载体(载体)或含有含IDO cDNA的表达载体进行细胞转染。
图8表示对多种IDO抑制剂候选物进行细胞水平分析筛选后得到的有关吲哚胺的硫代乙内酰脲衍生物的资料。利用空表达载体(载体)或含IDO或TDO的表达载体进行细胞转染。作为对比，在加入1MT下利用IDO表达载体进行细胞转染后进行分析。
图9表示对在250μM的浓度下某些IDO抑制剂、其结构及其抑制IDO及TDO活性的能力进行细胞水平分析的图表。
图10显示提供示图，证实某些IDO抑制剂对癌转移性乳腺(显示于上部)癌或前列腺(显示于下部)癌细胞的毒性。细胞未经处理(Untx)或采用100μM的抑制剂进行处理。
图11显示拟处理的(未处理)或用1MT、紫杉醇(泰素)、1MT加紫杉醇(泰素)、顺铂、或1MT加顺铂处理的MMTVneu小鼠的肿瘤体积总变化。每一数据点对应一个试验小鼠，条状图表示数据点(列于图下方)的均值。
发明详述在本发明的一个实施方式中，提供一组新的IDO抑制剂。另外本发明涉及含有所述IDO抑制剂的药物组合物和其抑制肿瘤生长的方法。
在本发明的另一实施方式中，提供一种联合治疗方案，其中包括施用IDO抑制剂和化疗药物，从而达到有效抑制肿瘤生长的目的。
在本发明的另一实施方式中，提供一种联合治疗方案，其中包括施用IDO抑制剂和信号转导抑制剂(STI)，从而可有效抑制肿瘤生长。
本发明的另一实施方式中，提供一种联合治疗方案，其中包括施用免疫调节剂和化疗药物，由此有效抑制肿瘤生长的方法。
依照本发明的另一实施方式，提供一种用于治疗慢性病毒感染的联合治疗方案，其中包括施用IDO抑制剂和化疗药物。
I.定义术语“IDO抑制剂”是指一类能抑制吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)的活性从而逆转IDO介导的免疫抑制作用的药物。IDO抑制剂可表现为竞争性、非竞争性、或不可逆性。“竞争性IDO抑制剂”是为在催化位点可逆性抑制IDO酶活性的化合物(例如，非限定性的，1-甲基-色氨酸)；“非竞争性IDO抑制剂”可在非催化位点可逆性抑制IDO酶活性(例如，非限定性，norharman)；和“不可逆性IDO抑制剂”是可与酶形成共价键从而不可逆的破坏IDO酶活性的化合物，(例如，非限定性，环丙基/吖啶基色氨酸衍生物)。
本发明的IDO抑制剂包括，但不限于i)以往被鉴定为具有IDO抑制活性的化合物，例如1MT(Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸(Sigma-Aldrich)、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸(Sigma-Aldrich)、6-硝基-L-色氨酸(Sigma-Aldrich)、吲哚3-甲醇(LKT实验室；明尼苏达州圣保罗市)、3，3′-二吲跺甲烷(DIM；LKT实验室)、没食子酸表没食子儿茶酚酯(LKT实验室)、5-溴-4-氯-吲哚酚1，3-双乙酸酯(Sigma-Aldrich)、9-乙烯基咔唑(Sigma-Aldrich)、阿西美辛(Sigma-Aldrich)、5-溴-DL-色氨酸(Sigma-Aldrich)、5-溴吲哚双乙酸酯(Sigma-Aldrich)、brassilexin(Sigma-Aldrich)、3-氨基-2-萘甲酸(Sigma-Aldrich)、β-咔啉(Sigma-Aldrich)、3-丁基-β-咔啉(Peterson，A.C.等.(1993)Med.Chem.3473-482)、6-氟-3-甲酰-β-咔啉(Sigma-Aldrich)、6-异硫氰酸-3-甲酯基(carbomethyoxy)-β-咔啉(Sigma-Aldrich)、3-丙氧基-β-咔啉(Sigma-Aldrich)、3-羧基-β-咔啉(Sigma-Aldrich)、3-丙氧甲酰基(carbopropoxy)-β-咔啉(Sigma-Aldrich)以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉(Sigma-Aldrich)；ii)已发现具有IDO抑制活性的适合于本发明的化合物，但其抗肿瘤作用尚未确定，包括，但不限于苯基-TH-DL-trp(3-(N-苯基-硫代乙内酰脲)-吲哚)(Sigma-Aldrich)、丙烯基-TH-DL-trp(3-(N-烯丙基-硫代乙内酰脲)-吲哚)(Asinex；俄罗斯莫斯科)、以及甲基-TH-DL-trp(3-(N-甲基-硫代乙内酰脲)-吲哚)(Sigma-Aldrich)；iii)已发现具有IDO抑制活性且适用于本发明的化合物，而且已被用作抗肿瘤剂，包括单不限于brassinin(LKT实验室)、5-甲基-brassinin(Mehta等(1994)Anticancer.141209-1213)、3，3′-二吲哚甲烷(DIM；LKT实验室)、以及吲哚-3-甲醇(13C；LKT实验室)。
“信号转导抑制剂”是在癌细胞的正常功能中选择性阻断信号通路的关键步骤，从而诱发细胞凋亡的药物。
本发明的信号转导抑制剂(STI)包括但不限于(i)bcr/abl激酶抑制剂，如STI 571(格列卫，Gleevec)及其衍生物；(ii)表皮生长因子(EGF)受体抑制剂，如激酶抑制剂(lressa，SSI-774)以及抗体(ImcloneC225[Goldstein等.(1995)，Clin Cancer Res.11311-1318]，和AbgenixABX-EGF)；(iii)her-2/neu受体抑制剂如赫赛汀TM(曲妥珠单抗)、以及法呢基转移酶抑制剂(FTI)如L-744，832(Kohl等.(1995)，Nat Med.1(8)792-797)；(iv)Akt族激酶或Akt通路的抑制剂，如雷怕霉素(参见Sekulic等.(2000)Cancer Res.603504-3513)；(v)细胞周期激酶抑制剂，如由flavopiridol和UCN-01(参见Sausville(2003)Curr.Med.Chem.抗癌药物347-56)；(vi)磷脂酰肌醇肌酶抑制剂，如LY294002(参见Vlahos等.(1994)J.Biol.Chem.2695241-5248)。
化合物或药物组合物的“有效治疗量”是指在动物，尤其人类中足以调节肿瘤的生长或转移的量，包括但不限于减小肿瘤生长速度或体积、或防止无肿瘤形成的动物在给药之前肿瘤形成，即预防性给药。
“药学可接受”是指经联邦政府或州政府的有关管理机构的批准、或经美国药典或其他适用于动物，尤其是人类的通用药典中所列有关管理机构的批准。
“载体”是指稀释剂、佐剂、赋形剂、辅助剂、或帮助本发明的活性剂给药的媒介。这类药用载体可以是灭菌液体，例如水和油类，包括石油，动物、植物类或合成油，如花生油、豆油、矿物油、芝麻油等。水或盐水溶液和右旋糖和甘油的水溶液优选用作载体，特别是作为注射用溶液。有关药用载体的描述，可参见E.W.Martin所著“Remington’s Pharmaceutical Sciences”。
“同时”表示(1)时间上同步，或(2)同一治疗期间的不同时段。
“顺序”表示所述方法中使用的一种活性剂的给药是在另一活性剂的给药之后进行。当给予某种活性剂之后，下一种活性剂可以基本上在第一种活性剂给药之后立刻给药；或下一活性剂可以在第一活性剂之后的有效时段中给药；有效时段是指从给予第一种药剂至其产生最大效用的时间。
II.癌症治疗的疗法本发明还提供含有至少一种IDO抑制剂的药物组合物，其中至少一种IDO抑制剂含有至少一种按照本发明发现的具有具有IDO抑制活性、但其抗肿瘤作用此前未被证实的化合物，该IDO抑制剂选自但不限于苯基-TH-DL-色氨酸(3-(N-苯基-硫代乙内酰脲)-吲哚)、丙烯基-TH-DL-色氨酸(3-(N-烯-丙基-硫代乙内酰脲)-吲哚)以及甲基-TH-DL-色氨酸(3-(N-甲基-硫代乙内酰脲)-吲哚)，这些抑制剂可经药学可接受载体介质给药。所述药物组合物可以以治疗有效量对需要其的患者给药。
此外，本发明提供一种癌症治疗的方法，该方法通过给予需要其的患者治疗有效量的至少一种上述IDO抑制剂。
本发明可以治疗的癌症包括，但不限于前列腺、结直肠、胰腺、子宫颈、胃、子宫内膜、脑、肝脏、膀脱、卵巢、睾丸、头部、颈部、皮肤(包括黑素瘤和基底细胞癌)、间皮层、白细胞(包括淋巴瘤和白血病)、食道、乳腺、肌肉、结缔组织、肺(包括小细胞肺癌和非小细胞癌)、肾上腺、甲状腺、肾脏、或骨；亦包括如下肿瘤成神经胶质细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、肉瘤、绒毛膜癌、皮下基底细胞癌、以及睾丸精原细胞瘤。
III.癌症治疗的联合疗法本发明提供治疗抑制的其他方法。按照本发明已经发现，IDO抑制剂和STI的组合对于抑制肿瘤生长具有协同作用。因而，本发明提供一种在患者中治疗癌症的药物组合物，该组合物在药学可接受载体中含有至少一种IDO抑制剂与至少一种STI。还提供一种在患者中治疗癌症的方法，该方法通过施用有效量的至少一种IDO抑制剂和至少一种STI。适合的IDO抑制剂包括任何任何具有IDO抑制活性的化合物。如上所述，适合的STIs包括，但不限于(i)bcr/abl激酶抑制剂，如STI 571(格列卫，Gleevec)及其衍生物；(ii)表皮生长因子(EGF)受体抑制，如激酶抑制剂(lressa，SSI-774)以及抗体(ImcloneC225[Goldstein等.(1995)，Clin Cancer Res..11311-1318]，和AbgenixABX-EGF)；(iii)her-2/neu受体抑制剂如赫赛汀TM(曲妥珠单抗)、以及法呢基转移酶抑制剂(FTI)如L-744,832(Kohl等(1995)，Nat Med.1(8)792-797)；(iv)Akt激酶抑制剂或Akt通路阻滞剂，如雷怕霉素(参见Sekulic等(2000)CancerRes.603504-3513)；(v)细胞周期激酶抑制剂，如flavpiridol和UCN-01(参见Sausville(2003)Curr.Med.Chem.抗癌药物347-56)；(vi)磷脂酰肌醇肌酶抑制剂，如LY294002(参见Vlahos等.(1994)J.Biol.Chem.2695241-5248)。
至少一种IDO抑制剂可选自下列的化合物i)以往证实具有IDO抑制活性的化合物，包括，但不限于1-甲基-色氨酸(1MT)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、吲哚3-甲醇、3，3′-二吲哚甲烷(DIM)、表没食子儿茶酚没食子酸(LKT实验室)、5-溴-4-氯-吲哚酚1，3-双乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-DL-色氨酸、5-溴吲哚双乙酸酯、brassilexin、3-氨基-2-萘甲酸、β-咔啉、3-丁基-β-咔啉、6-氟-3-甲酯基-β-咔啉、6-异硫氰酸-3-甲酯基-β-咔啉、3-丙氧基-β-咔啉、3-羧基-β-咔啉、3-丙氧甲酰-β-咔啉、以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉；ii)已发现具有IDO抑制活性且适用于本申请的化合物，但其抗肿瘤作用尚未确定，如苯基-TH-DL-trp(3-(N-苯基-硫代乙内酰脲)-吲哚)、丙烯基-TH-DL-trp(3-(N-烯丙基-硫代乙内酰脲)-吲哚)以及甲基-TH-DL-trp(3-(N-甲基-硫代乙内酰脲)-吲哚)。在某些实施方式中，一组IDO抑制剂可以另外包括那些已发现具有IDO抑制活性、适用于本申请且已被用作抗肿瘤剂的化合物，其包括，但不限于brassinin、5-甲基-brassinin、3，3′-二吲哚甲烷(DIM)以及吲哚-3-甲醇(I3C)。
依照本发明的一个具体实施方式
，可同时或顺序给予患者IDO抑制剂和至少一种STI。换言之，首先施用至少一种IDO抑制剂，或者至少一种IDO抑制剂和至少一种STI可以同时给药。此外，当施用不止一种的IDO抑制剂和/或STI时，则化合物可以以任何顺序给药。
适合本发明联合方案治疗的癌症包括，但不限于上文所述肿瘤类型。
除IDO之外，已知其他分子物质亦参与免疫调节机制。这些其他分子也可能成为抑制癌症患者中肿瘤生长的靶分子。据此，本发明提供了癌症治疗的联合方法，该方法通过施用至少一种除IDO抑制剂之外的免疫调节剂，并联用至少一种化疗药物。本发明中可以采用的免疫调节剂包括，但不限于共刺激分子，如CD40L、B7以及B7RP1；与共刺激受体结合的活性单克隆抗体(mAbs)，如抗-CD40、抗-CD38、抗-ICOS以及4-IBB配体；树突状细胞抗原载荷(体外或体内)树突细胞癌疫苗；细胞因子/化学因子，如IL1、IL2、IL12、IL18、ELC/CCL19、SLC/CCL21、MCP-1、IL-4、IL-18、TNF、IL-15、MDC、IFNa/b、M-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-13、以及抗IL-10；细菌脂多糖(LPS)；免疫刺激性寡核苷酸，如多聚CpG DNA(参见Verthelyi和Zeuner(2003)Tr.Immunol.24519-522)。适宜的化疗药物包括但不限于下述化疗药物，而信号转导抑制剂(STI)则如上所述。
在本发明中，也已发现IDO抑制剂和化疗药物的联合可协同抑制肿瘤生长。因而，本发明提供一种在需要其的患者中治疗癌症的药物组合物，其中在药学可接受载体中包含至少一种IDO抑制剂与至少一种化疗药物。本发明还提供一种在患者中治疗癌症的方法，该方法通过施用有效量的至少一种IDO抑制剂和至少一种化疗药物。适合的IDO抑制剂包括任何具IDO抑制活性的任何化合物。适当的化疗药物包括，但不限于紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酸胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。
至少一种IDO抑制剂可选自i)前述的已知IDO抑制剂；ii)前述的已发现具IDO抑制活性并适用于本申请的化合物。在某些实施方式中，一组IDO抑制剂可以另外包括发现具IDO抑制活性、适用于本申请且其已被用作抗肿瘤剂的化合物，包括，但不限于brassinin、5-甲基-brassinin、3，3′-二吲哚甲烷(DIM)以及吲哚-3-甲醇(I3C)。
在本发明的一个具体实施方式
中，可同时或顺序将至少一种IDO抑制剂与至少一种STI施用给患者。换言之，首先施用至少一种IDO抑制剂，或者至少一种IDO抑制剂和至少一种STI可以同时给药。此外，当不止一种的IDO抑制剂和/或STI给药时，则化合物可以以任何顺序给药。
适合本发明联合方案治疗的癌症包括，但不限于上文所述肿瘤类型。
IV.慢性病毒性感染治疗的联合疗法本发明还提供一种治疗慢性病毒性感染的方法，该方法通过施用IDO抑制剂与化疗药物。另外，该方法还包括联合施用抗病毒剂(即用于治疗病毒性传染病的药物)和IDO抑制剂和化疗药物。
因而，本发明提供治疗患者中的慢性病毒感染的药物组合物，其中在药学可接受载体中包括至少一种IDO抑制剂、至少一种癌症治疗药物，并且选择性地含有至少一种抗病毒剂。还提供一种治疗慢性病毒性感染的方法，该方法通过施用有效量的至少一种IDO抑制剂，并联用至少一种化疗药物，同时选择性地施用至少一种抗病毒剂。
至少一种IDO抑制剂可以选自i)前述的已知I DO抑制剂；ii)前述的已发现具IDO抑制活性并适用于本申请的化合物。在某些实施方式中，一组IDO抑制剂可以另外包括已发现具IDO抑制活性、适用于本申请且其已被用作抗肿瘤剂的化合物，包括，但不限于brassinin、5-甲基-brassinin、3，3′-二吲哚甲烷(DIM)及吲哚-3-甲醇(I3C)。
适宜的化疗药物为所有具有抗癌活性的化合物，包括但不限于烷化剂(氮芥类，如苯丁酸氮芥、环磷酰胺、isofamide、二氯甲基二乙胺、左旋苯丙氨酸氮芥、以及尿嘧啶氮芥；氮丙啶类，如三胺硫磷；甲磺酸酯类，如白消安；亚硝基尿素类，如卡氮芥、环己亚硝脲、以及链脲霉素；铂复合剂，如顺铂和卡铂；生物还原性烷化剂，如丝裂霉素、甲苄肼、甲氮咪胺、以及六甲基密胺)；DNA解链剂(如博来霉素)；II型拓扑异构酶抑制剂(如安吖啶、更盛霉素、红比霉素、伊达比星、二羟基蒽酮、阿霉素、足叶乙甙、以及替尼泊甙)；DNA小沟结合剂(如普卡霉素)；抗代谢物(叶酸拮抗剂，如氨甲蝶呤和三甲曲沙；嘧啶拮抗剂，如氟尿嘧啶、氟脱氧尿嘧啶核苷、CB3717、阿扎胞苷、阿糖胞苷、以及氟尿苷；嘌呤拮抗剂，如巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、氟达拉滨、喷司他丁；天门冬酰胺酶；核苷酸还原酶抑制剂，如羟基脲)；微管蛋白反应剂(如长春新碱、长春碱、以及紫杉醇(泰素))；激素类(如雌激素；妊马雌酮；动情素；己烯雌酚；chlortrianisen；idenestrol；孕酮类，如羟孕酮己酸酯、安宫黄体酮、以及甲地孕酮；男性激素类，如辜丸素、丙酸辜丸素、氟甲辜酮、以及甲基辜丸素)；肾上腺皮质激素(如强的松、地塞米松、甲基强的松龙、以及氢化泼尼松)；黄体化激素释放剂、或促性腺激素释放因子拮抗剂(如亮丙瑞林醋酸盐和戈舍瑞林醋酸盐)；抗激素抗原(三苯氧胺、抗雄激素药如氟他胺；抗肾上腺素药，如米托坦和氨鲁米特)。优选地，该化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。
适宜的抗病毒剂包括，但不限于阿昔洛韦；gangcyclovir；膦甲酸；病毒唑；抗逆转录病毒药，如核苷类似物逆转录酶抑制剂(如叠氮胸腺嘧啶(AZT)、地丹诺辛、扎西他宾、拉米夫定、司他呋啶)、非核苷逆转录酶抑制剂(如希宁、奈韦拉平)、核苷类似物逆转录酶抑制剂、以及蛋白酶抑制剂。
在本发明的一个具体实施方式
中，可同时或顺序给患者施用至少一种IDO抑制剂和至少一种化疗药物。换言之，可以首先施用至少一种IDO抑制剂，或首先施用至少一种化疗药物，或者同时施用至少一种IDO抑制剂和至少一种STI。此外，若施用一种以上的IDO抑制剂和/或化疗药物时，化合物可以以任意雌性给药。同样地，可随时加用抗病毒剂。
这种联合治疗中的化合物还可以用于局部感染。特别是，至少一种IDO抑制剂、至少一种化疗药物、并可选用至少一种抗病毒剂，可以施用来治疗皮肤感染，如带状疱疹和疣。这类化合物可通过药学可接受的局部载体给药，包括但不限于凝胶、乳剂、洗剂、油膏、粉剂、气溶剂、以及其他辅助皮肤给药的常规剂型。
本发明的联合疗法可以治疗的慢性病毒性感染包括，但不限于因下列因素而导致的疾病乙性肝炎病毒(HCV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、柯萨奇病毒、以及人体免疫缺陷病毒(HIV)。
值得注意的是，上述方法亦适用于治疗寄生虫感染(如疟疾)，其中已知用于治疗寄生虫病的化合物以任选地替代抗病毒剂。
V.药物组合物和化合物的给药本发明的药物组合物可以通过任何适合的途径给药，例如通过注射、口服、经肺、鼻给药或其他给药方式。通常，本发明的药物组合物含有药学可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体介质。所述的组合物包括不同缓冲物(如三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCL)、醋酸盐、磷酸盐)、Ph及离子浓度的稀释剂；添加剂，如洗涤剂和增溶剂(如Tween 80、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠)、防腐剂(如汞、苯甲醇)以及膨胀剂(如乳糖、甘露醇)。该药物组合物可掺杂到多聚化合物如聚乳酸、聚羟基乙酸等的微粒制剂或脂质体中。此类组合物药物组合物可以影响本发明药物组合物的成分的物理状态、稳定性、体内释放率以及体内清除率。可参见，Remington’s Pharmaceutical Sciences第18版(1990，Mack出版公司，Easton，PA 18042)第1435～1712页部分。本发明的药物组合物可制备成液体或干粉剂型(如冻干粉)。药物组合物给药的具体途径如上所述。
在另一实施方式中，本发明的药物组合物可以通过控释系统给药，例如采用静脉内灌输、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质体，或其他给药方式。在一个具体实施方式
中，可以采用泵式给药方式(参见Langer，如上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.(1987)14201；Buchwald等，Surgery(1980)88507；Saudek等，N.Engl.J.Med.(1989)321574)。在另一实施方式中，可使用多聚材料给药(参见Medical Applications of Controlled Releas，Langer和Wise(eds.)，CRC出版社Boca Raton，佛罗里达(1974)；控释药物的生物利用度，药品的发明与效用，Smolen和Ball(eds.)，Wiley纽约(1984)；Ranger和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.，(1983)2361；亦可参见Levy等，Sciencs(1985)228190；During等，Ann.Neurol.(1989)25351；Howard等，J.Neurosurg.(1989)71105)。在另一具体实施方式
中，可将药物控释系统置于动物的靶组织近端；这样使给药剂量仅是系统给药的一部分(参见Goodson，受控释放技术的医学应用，如上，(1984)vol.2，pp.115-138)。特别是，可以将控释装置引入到动物体内的适当激活或肿瘤的近端处。有关其他控释系统的论述参见Langer的综述(Scienc(1990)2491527-1533)。
提供下列实施例来说明本发明的多种实施方式。这些实施例不以任何方式限定本发明。
实施例1新型IDO抑制剂的评价1.新型IDO抑制剂生化特性的评价概述IDO的生物化学目前已清楚，此酶类已于1963年被首次分离。(Higuchi，K.等(1963)Federation proc.22243(摘要)；Shimizu，T.等.(1978)J.Biol.Chem.2534700-6)。IDO为一种单体型、含血红素的氧化还原酶，其分子量约为41kDa。为保持体外催化过程中的活性亚铁形式，需要使用亚甲蓝与过氧化物或还原剂(如抗坏血酸)。在体内，建议黄素或四氢生物蝶呤可替代亚甲蓝进行染色，并且可能存在非竞争性IDO抑制剂的特异性位点。哺乳动物基因经克隆化及组氨酸标记可在细菌内表达，可产生活性酶类(Littlejohn，T.K.等(2000)Prot.Exp.Purif.1922-29)。这为酶的生物化学分析提供了方便的来源。在采用光度法的常规IDO活性生化分析中对由色氨酸转化生成的犬尿氨酸(N-甲酸基-犬尿氨酸的水解产物)进行测定，该生化分析可在酶水平及细胞水平进行。该酶水平分析为鉴定具有IDO抑制活性的化合物提供了灵活、高通量的方法。该分析方法亦可用于测定特殊化合物的Ki值，其对于不同化合物系列的SAR的开发具有重要意义。细胞水平分析可用于测定已知化合物的IDO抑制活性，并且达到对生物利用度-即化合物对细胞内IDO的抑制能力的初始遴选。在细胞水平分析中，可通过色氨酸双氧酶(TDO，亦有文献称TDO2)与其他已知色氨酸异化酶的对比，进行IDO抑制作用的测定。
方法目前已分离出人类及小鼠IDO的cDNA克隆物并通过测序检验。为了制备生物化学研究中的酶，使用IPTG诱导pET5a载体系统在大肠杆菌内合成C末端His-标记的IDO蛋白质，并通过镍柱进行分离。采用凝胶电泳法对部分纯化蛋白的产物进行测定，而且可通过蛋白标准品对比测算出其浓度。为检测IDO的酶活性，按照已公开的检测方法(Littlejohn，T.K.等(2000)Prot.Exp.Purif.1922-29；Takikawa，O.等.(1988)J.Biol.Chem.2632041-8)，采用96孔板光度法测定生成的犬尿氨酸，从而可检测IDO酶活性。为筛选IDO抑制活性的证据，可将单一浓度如200μM的化合物与50ng的IDO酶混合达到100μl反应体积，并且加入浓度递增(0、2、20和200Mm)的色氨酸。1小时后可以对生成的犬尿氨酸进行检测。可收集更多酶动力学数据，以便选取感兴趣的化合物。有关1MT的最适Ki值(34.6μM)及MTH-色氨酸的最适Ki值(11.4μM)的测定，如图1A与1B所示。这些数据表明，硫代乙内酰脲可直接抑制DOI酶活性，与1MT相比，该抑制作用强3倍左右。
下列方法是细胞水平分析的实例。采用厂商推荐的Lipofectamine 2000(lnvitrogen)用表达IDO cDNA的CMV启动子诱导质粒使COS-1细胞发生暂时性转染。用TDO表达质粒暂时性转染伴随(campanion)系列的细胞。转染48小时后将该细胞分配至96孔板格，每孔含6×104个细胞。次日，冲洗孔板并加入含20μg/ml色氨酸的新培养基(无酚红)和抑制剂。5小时后中止该反应，弃去上清液，采用与酶检测相同的光度法检测犬尿氨酸水。(Littejohn，T.K.等.(2000)Prot.Exp.Purif.1922-29；Takikawa，O.等.(1988)生物化学杂志.2632041-8)。为获得对IDO活性的初始证实，可对单一浓度例如100Mm的化合物进行评估。收集所选化合物的更多剂量增高的性能。有关1MT的EC50值(EC50＝267μM)及MTH-色氨酸的EC50值(EC50＝12.9μM)的测定如图2所示。这些数据表明，与1MT相比，MTH-色氨酸对细胞内IDO的抑制作用更强，约为前者20倍。
2.本申请中发现具有IDO抑制活性的化合物的药效学/药动学的评价概况细菌脂多糖(LPS)的腹膜内给药诱发多种组织中的IDO活化，从而生成犬尿氨酸并释放入血液中(图3)。给予LPS1天后犬尿氨酸水平可达峰值(Takikawa，O.等.(1986)H.Biol.Chemm.2613648-53；Yoshida，H等(1998)Cell 94739-750)。基于检测犬尿氨酸和色氨酸的血清水平，进行药效学分析。计算犬尿氨酸/色氨酸的比值以评价IDO活性，该活性与基线色氨酸水平无关(Fuchs.D.等(1991)Immunol.Lett.28207-11；Gasse，T等(1994)Eur.J.Clin.Chem.Clin Biochem.32685-9)，并且这种IDO活性的检测方法常用于人体。与组织中IDO酶活性的直接检测相比，这种方法的主要优点在于它是非侵入过程，能够从同一动物采集多个样本。通过这种方法可确保在多时间点对单个小鼠进行IDO活性检测。采用HPLC分析法可以检测色氨酸和犬尿氨酸的血清水平。化合物的血清浓度也可以在采用相同HPLC方法测定，由此在单次试验中同步采集药动学数据。
方法由于其遗传背景与在乳腺肿瘤模型中用于评价化合物效价的MMTV-neu雌性小鼠相同，FVB MMTV-neu雄性小鼠(8～10周龄)可被利用进行药效学分析。对来自不同菌株的LPS制剂进行比较分析时发现，沙门氏菌属明尼苏达突变株R-595(S.mimesotaR)诱发的LPS可导致高度持续水平的犬尿氨酸诱导作用(Yoshida，R.等.(1981)Arch.Biochem.Biophys.212629-37)。由于它为评估IDO抑制剂的效果提供了最宽的视窗，因此该LPS制剂可用于药效学分析。有报道，诱发最大IDO活性的S.minnesota R LPS的最小静脉内注射剂量为～1mg/kg，并且在采用LPS治疗～24小时后，IDO活性可达到最大(Yoshida，R.等.(1981)Arch.Biochem.Biophys..212629-37)。
通过HPLC分析法可对犬尿氨酸和色氨酸的血清水平进行定量检测(Hwu.P.等(2000)J Immunol 1643596-9；Widner，B等(1997)Clin.Chem.432424-6；图4A-4D)。通过这种方法，测得犬尿氨酸的血清浓度至少为1.25μM，色氨酸至少为3μM。对于未受刺激的FVB雄性小鼠，其体内犬尿氨酸血清水平处于或低于检测限，而色氨酸的水平很容易测出，为50μM(图4B)。LPS刺激后24小时，诱使血清犬尿氨酸水平达到～6μM(图4C)。1MT在血清中的浓度至少为5μM时也可有效检测出。当所使用1MT的生物有效剂量达2×140mg 1MT药丸时其血清水平远远低于～100μM(图4D)。
对化合物进行评估首先需施加LPS刺激，随后当犬尿氨酸血清水平处于平台期时给予快速浓注剂量的化合物。由于犬尿氨酸在血清中的半衰期少于10分钟，故其水平会迅速下降(Bender和McCreanor(1982)Biochim.Biophys.Acta.71756-60；Takikawa，O.等(1986)J.Biol.Chem.2613648-53)，因此预存在的犬尿氨酸不被认为会过度掩盖抑制IDO对犬尿氨酸生成的影响效果。对给药载体的选择主要取决于化合物的物理特性。优选的载体为等渗盐水，但要求化合物可溶于水溶液。若预知某些化合物无法充分溶解，在这种情况下可使用Methocel或Tween的悬浮液(0.5％甲基纤维素或1％Tween80)。
各试验中可以选用非LPS暴露的小鼠进行试验(以测定犬尿氨酸的基线水平，从而与其他小鼠相对比)和仅给予载体的LPS暴露的小鼠(为IDO活性提供阳性对照)。给予小鼠LPS后对其进行监测，若出现明显的内毒素血症的迹象(如毛皮皱褶、呆滞)应立即对其施行安乐死。各化合物可以首先在小鼠中以至少100mg/kg的单次i.p.高给药剂量进行评估。在规定时间间隔(例如，施用化合物后5、15、30分钟、1、2、4、6、8、24小时)内采集血样(每份50μl)，通过HPLC检测犬尿氨酸和色氨酸水平(药效学分析)，并且检测化合物的水平(药动学分析)。根据药动学资料，可测定化合物的峰血清浓度，并可计算清除率。通过比较不同时间点的化合物血清水平与犬尿氨酸/色氨酸的比值，可粗算出IDO体内抑制时的有效IC50值。
基于单剂量研究的结果，可以对各有效化合物进行第二次的剂量增加研究。例如，该研究的目标可以是，在一组小鼠试验中给药浓度达峰值(若可能)并产生100％IDO抑制，从而达到最大给药剂量，在另一组试验中，给药浓度以3倍量减小，从而覆盖了最大剂量与最小剂量之间的2log10范围。通过上述数据可精确测定IC50。该方法同样可以用来测试生物活性化合物的口服生物利用度，首先测试各化合物p.o.给药剂量的单次最大浓度，然后进一步评估化合物在剂量增加研究中表现的显著口服功效。为确保药物体内反应性与两性性别无关，可对雌性小鼠进行单剂量i.p.给药试验，各活性化合物的给药剂量为IC50。
实施例2IDO抑制剂与信号转导抑制剂的联合应用治疗肿瘤使用乳腺癌的MMTVneu转基因“乳癌小鼠(oncomouse)”模型来检测IDO抑制剂与STI对肿瘤病理生理的影响。使MMTVneu转基因小鼠发展为侵袭性乳腺肿瘤，它与分化不良的人导管癌相类似。在该MMTVneu小鼠模型中，通过HER-2/Neu基因突变体的组织特异性表达来诱发乳腺癌，患侵袭性人乳腺导管癌时该基因常处于激活状态。HER-2属于细胞表面生长因子受体EGF-R家族的一员。Myc为HER-2Neu的下游效应物，可诱发癌症。使雌性MMTVneu“乳癌小鼠”交配两次，以诱发小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子的表达；该启动子可诱发乳腺组织中Neu/HER2致癌基因的转录。在该模型系统中5月龄的小鼠乳腺肿瘤的出现率超过90％。将带有～150mm3瘤大小的MMTVneu“乳癌小鼠”随机分组为对照组和试验处理组。为对照组小鼠植入安慰剂型定时释放药丸(Innovative Research，Inc.，Sarasota，FL)。试验组的小鼠是(1)植入含1MT的定时释放药丸，(2)用L-744，832处理，或(3)植入含1MT定时释放的药丸，并用L-744，832处理。L-744，832为一种强效、选择性法呢基转移酶(FTI)抑制剂，其模拟增加了法呢基的CaaX基序(Kohl等，(1995)Nat Med.1(8)747-748)。
该定时释放药丸含一种可逐渐溶解、分解成无毒物质的惰性共聚物，该无毒物质在试验过程中主要呈局部分布。该含有1MT的缓释药丸释放剂量为10mg/天(据药品销售方称)，可持续释放14天(Innovative Research，Inc.，Sarasota，FL)。给每只小鼠植入2粒药丸，从而释放20mg/天的总剂量。因而，对于一只25g小鼠来说总剂量为800mg/kg/天或280mg持续14天。依照厂商的说明书，在12～24小时内达到达到稳态水平，并维持于整个试验期间。该给药剂量有效诱导同种异体孕体排斥(A.Muller，J.B.DuHadaway.G.C.Prendergast，试验结果未发表)，亦如Munn等所述(Science2811199-1193，1998)。
将小鼠肌肉注射氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉后在其背部皮下植入该定时释放药丸。使用止血钳进行钝性解剖，将皮肤与下层肌肉分离，形成皮下袋状间隙。将1或2个可生物降解的定时释放药丸植入该间隙内，而非直接置于切口下方，以防止产生机械压力以及伤口裂开。用缝合夹将切口封闭。基于载有安慰剂型定时释放药片的雌性小鼠仍具有怀孕能力，因而试验干预所产生的不利影响可忽略不计。
有关信号转导抑制剂，如FTI L-744，832的制备及给药方式，如Kohl等所述(Nature Med.(1995)1792-797)。
图5表示测试1MT与FTI L-744，832的协同作用的试验中的发现，这在MMTVneu“乳癌小鼠”模型中导致已确立肿瘤的退化。在2周的试验期间发现，模拟处理的对照组小鼠的肿瘤体积增大200％。通过皮下定时释放药丸释放的20mg/天1MT处理小鼠，可减缓但无法阻止肿瘤生长。同样地，用FTI L-744，832处理荷瘤小鼠也减缓但无法阻止肿瘤生长。相反，1MT与L-744，832的联合可使模型中的肿瘤退化。
实施例3新型IDO抑制剂按照作为IDO抑制剂的功效筛选多种化合物。采用下面的生物化学分析法对某些化合物进行筛选。IDO cDNAs可在细菌内表达，合成组氨酸标记蛋白并且经纯化处理，方法同前(Littlejohn等.(2000)Prot.Exp.Purif.1922-29)。简言之，经纯化IDO与底物以及不同量的IDO抑制剂候选物一起培养。由于反应产物犬尿氨酸具有荧光性，故可通过测定反应混合物的荧光度，确定后续抑制剂的功效。有关采用体外生化法进行筛选的结果，如图6所示。
亦可通过细胞水平分析对候选化合物进行筛选(有关类似分析法可参见Munn等.(1999)J.Exp.Med..1891363-1372)。简言之，用人IDO或TDO Cdna表达载体暂时转染人293/Phoenix细胞。将不同浓度的候选化合物加入到该转染的细胞。使用荧光法对组织培养基中的犬尿氨酸进行定量测定。这些试验的结果参见图7～9。
如图所示，经确认的最有效抑制剂为吲哚胺的硫代乙内酰脲衍生物。图8显示采用这类特定抑制剂的试验结果。其中这些抑制剂中效力最强的为甲基-TH-DL-色氨酸，其IDO活性的抑制作用为1MT(浓度为250Mm)的2.7倍(图9)。
除吲哚胺的硫代乙内酰脲衍生物之外，亦可对天然物质进行筛选。有趣的是，其中筛选出的有效抑制剂使来自具有抗癌特性食物(如十字花科蔬菜)的化合物。Brassinin是一种发现于大白菜的化合物，在测定IDO抑制剂的天然产物中，其效力最强(图7A)。
另外应对某些经筛选的化合物进行毒性检测。如图10所示，大多数IDO抑制性化合物本身对于经致癌转化的乳腺癌或前列腺癌细胞并无生长抑制或毒性作用(图10)。
实施例4IDO抑制剂与细胞毒化疗药物联合应用治疗肿瘤采用MMTVneu转基因“乳癌小鼠”模型来检测IDO抑制剂与细胞毒化疗药物在肿瘤病理生理的影响。
将带有150mm3大小的肿瘤的MMTVnet“乳癌小鼠”随机分组为对照组和试验治疗组。对照小鼠植入安慰剂型定时释放药丸(InnovativeResearch，Inc.，Sarasota，FL)。试验组的小鼠为(1)植入含1MT的定时释放药丸，如实施例2所述，(2)用紫杉醇(泰素)或其他细胞毒药物处理，或(3)植入含1MT的定时释放药丸，并给予紫杉醇或其他细胞毒药物。
给小鼠背部皮下植入定时释放药丸，方法如实施例2所述。
细胞毒化疗药物的制备及给药过程，如下所述。将紫杉醇溶解于同体积的无水乙醇和临床用作增溶剂的CremophorEL。该溶液经超声处理30分钟，然后将此20mg/ml贮存液在4℃下放置1周。使用之前，用无菌生理盐水将溶液稀释成1∶5。给小鼠静脉内(经尾静脉)单剂量注射如上方式配制的紫杉醇。可预先对小鼠尾部进行温热处理有助于辨识静脉并进行静脉内注射。在2周试验中，紫杉醇最大耐受剂量(MTD)为13.3mg/kg，可分5次给药，每周给药3次(即周五植入药丸；周一/周三/周五，周一/周三注射紫杉醇；周五处死动物，进行肿瘤分析)。顺铂的MTD(1mg/kg)是在临床中经盐水制备获得，并且其静脉内注射给药方式相同。对照处理的小鼠仅接受不含紫杉醇的CremophorEL载体制剂。
在图11与表1中对1MT试验的发现进行了概括，该试验对1MT与两种细胞毒药物在MMTVneu“乳癌小鼠”模型中协同作用导致已有肿瘤的退化(有关其他化疗药物可参见图5)。在2周的试验中发现，模拟处理的对照小鼠的肿瘤体积增加200％。通过皮下定时释放药丸给予的20mg/天1MT处理小鼠，可减缓但无法阻止肿瘤生长。同样地，给带有肿瘤的小鼠静脉内注射紫杉醇或顺铂处理达最大耐受剂量也可减缓但无法阻止肿瘤生长。相反，1MT与紫杉醇或顺铂的组合使模型中的肿瘤退化。当紫杉醇减少至MTD的～25％时亦可获得类似结果(未显示相关资料)。研究中所用的细胞毒药物对T细胞具有毒性作用，而IDO抑制剂可使T细胞恢复和活化，这些结果在现有技术中是无法预料的
表1对小鼠进行处理后对MMTVneu小鼠的肿瘤进行统计学分析。比较治疗后与治疗前的肿瘤体积得出百分比值。低于95％CL和高于95％CL代表小于和大于95％可信区间。
对取自对照组和试验组小鼠的肿瘤切片进行组织学和免疫组织化学分析，结果显示仅在给予联合治疗的小鼠试验组肿瘤组织出现明显变化。最引入瞩目的是，明显出血、细胞调亡、以及CD3阳性T细胞的浸润的证据可在接受联合方案的小鼠中发现(资料未显示)。总之，MMTVneu“乳癌小鼠”模型系统中1MT与细胞毒药物的联合应用可有效诱导已有乳腺肿瘤的退化。
虽然上文已述本申请的某些优选实施方式和具体实例，但其本申请不局限在这些实施方式。亦允许在本申请范围内对有关内容进行改进，详情参见如下权利要求书。
本申请书中引用若干出版物及专利文献，旨在全面说明本申请所属的现有技术的状况。这些引用文献各自的内容在此引入作为参考。
权利要求
1.一种在需要其的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给该患者同时或顺序施用治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂和至少一种信号转导抑制剂(STI)。
2.权利要求1的方法，其中至少一种STI选自bcr/abl激酶抑制剂、表皮生长因子(EGF)受体抑制剂、her-2/neu受体抑制剂、法呢基转移酶抑制剂(FTI)、AKt家族激酶抑制剂或Akt通路阻滞剂以及细胞周期激酶抑制剂。
3.权利要求2的方法，其中至少一种STI亦可选自STI 571、SSI-774、C225、ABX-EGF、曲妥珠单抗、L-744，832、雷怕霉素、LY294002、flavopiridal、以及UNC-01。
4.权利要求3的方法，其中至少一种STI是L-744，832。
5.权利要求1的方法，其中至少一种IDO抑制剂选自1-甲基-DL-色氨酸(1MT)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、吲哚3-甲醇、3，3′-二吲哚甲烷、brassinin、5-甲基-brassinin、没食子酸表没食子儿茶酚酯、5-溴-4-氯-吲哚酚1，3-双乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-DL-色氨酸、5-溴吲哚双乙酸酯、苯基-TH-DL-trp、丙烯基-TH-DL-trp、甲基-TH-DL-trp、brassilexin、3-氨基-2-萘甲酸、β-咔啉、3-丁基-β-咔啉、6-氟-3-甲酯基-β-咔啉、6-异硫氰酸-3-甲酯基-β-咔啉、3-丙氧基-β-咔啉、3-羧基-β-咔啉、3-丙酯基-β-咔啉，以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉。
6.权利要求5的方法，其中至少一种I DO抑制剂是1-甲基-色氨酸(1MT)。
7.权利要求1的方法，其中同时施用至少一种IDO抑制剂和至少一种STI。
8.权利要求1的方法，其中顺序施用至少一种IDO抑制剂和至少一种STI。
9.权利要求8的方法，其中至少一种IDO抑制剂是在至少一种STI之前施用。
10.权利要求8的方法，其中至少一种STI是在至少一种IDO抑制剂之前施用。
11.权利要求1的方法，其中所述的癌症选自下列的癌症前列腺、结直肠、胰腺、子宫颈、胃、子宫内膜、脑、肝脏、膀脱、卵巢、睾丸、头部、颈部、皮肤(包括黑素瘤和基底细胞癌)、间皮层、白细胞(包括淋巴瘤和白血病)、食道、乳腺、肌肉、结缔组织、肺(包括小细胞肺癌和非小细胞癌)、肾上腺、甲状腺、肾脏、或骨；亦包括成神经胶质细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、肉瘤、绒毛膜癌、皮下基底细胞癌、以及睾丸精原细胞瘤。
12.一种治疗癌症的药物组合物，其中在药学可接受载体介质中含有治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂和至少一种信号转导抑制剂(STI)。
13.权利要求12的药物组合物，其中至少一种STI选自bcr/abl激酶抑制剂、表皮生长因子(EGF)受体抑制剂、hef-2/neu受体抑制剂、法呢基转移酶抑制剂(FTI)、Akt家族激酶抑制剂或Akt通路阻滞剂、以及细胞周期激酶抑制剂。
14.权利要求13的药物组合物，其中至少一种STI选自STI 571、SSI-774、C225、ABX-EGF、曲妥珠单抗、L-744，832、雷怕霉素、LY294002、flavopiridal、以及UNC-01。
15.权利要求13的药物组合物，其中至少一种STI是L-744，832。
16.权利要求12的药物组合物，其中至少一种IDO抑制剂选自1-甲基-DL-色氨酸(1MT)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、吲哚3-甲醇、3，3′-二吲哚甲烷、brassinin、5-甲基-brassinin、没食子酸表没食子儿茶酚酯、5-溴-4-氯-吲哚酚1，3-双乙酸酶、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-DL-色氨酸、5-溴吲哚双乙酸酯、苯基-TH-DL-色氨酸、丙烯基-TH-DL-色氨酸、甲基-TH-DL-色氨酸、brassilexin、3-氨基-2-萘甲酸、β-咔啉、3-丁基-β-咔啉、6-氟-3-甲酯基-β咔啉、6-异硫氨酸-3-甲酯基-β-咔琳、3-丙氧基-β-咔啉、3-羧基-β-咔啉、3-丙氧甲酰基-β-咔啉、以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉。
17.权利要求12的药物组合物，其中至少一种I DO抑制剂为1-甲基-DL-色氨酸(1MT)。
18.一种在需要其的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给该患者同时或顺序施用治疗有效量的除IDO抑制剂之外的免疫调节剂，和治疗有效量的至少一种细胞毒药物或至少一种STI。
19.权利要求18的方法，其中至少一种免疫调节剂选自CD40L，B7，B7RP1，抗CD40、抗CD38、抗ICOS、4-IBB配体、树突状细胞癌疫苗、IL2、IL12、ELC/CCL19、SLC/CCL21、MCP-1)、IL-4、IL-18、TNF、IL-15、MDC、IFN a/b、M-CSF、IL-3、GM-CSF、IL-13、抗IL-10、LPS、以及多聚CpG DNA。
20.权利要求18的方法，其中至少一种细胞毒化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。
21.权利要求18的方法，其中至少一种STI选自STI 571、SSI-774、C225、ABX-EGF、曲妥珠单抗、L-744，832、雷怕霉素、LY294002、flavpiridal、以及UNC-01。
22.一种在需要其的患者中肿瘤慢性病毒感染的方法，该方法包括给该患者同时或顺序施用治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂和至少一种化疗药物。
23.权利要求22的方法，其中该至少一种IDO抑制剂选自1-甲基-DL-色氨酸(1MT)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、吲哚3-甲醇、3，3′-二吲哚甲烷(DIM)、brassinin、5-甲基-brassinin、没食子酸表没食子儿茶酚酯、5-溴-4-氯吲哚酚1，3-双乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-DL-色氨酸、5-溴吲哚双乙酸酯、苯基-TH-DL-色-氨酸、丙烯基-TH-DL-色氨酸、甲基-TH-DL-色氨酸、brassilexin、3-氨基-2-萘甲酸、β-咔啉、3-丁基-β-咔啉、6-氟-3-甲酯基-β-咔啉、6-异硫氰酸-3-甲酯基-β-咔啉、3-丙氧基-β-咔啉、3-羧基-β-咔啉、3-丙氧甲酰基-β-咔啉、以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉。
24.权利要求22的方法，其中至少一种IDO抑制剂为1-甲基-DL-色氨酸(1MT)。
25.权利要求22的方法，其中至少一种化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。
26.权利要求22的方法，其中同时施用至少一种IDO抑制剂和至少一种化疗药物。
27.权利要求22的方法，其中顺序施用至少一种IDO抑制剂和至少一种化疗药物。
28.权利要求27的方法，其中至少一种IDO抑制剂是在至少一种化疗药物之前施用。
29.权利要求27的方法，其中至少一种化疗药物是在至少一种IDO抑制剂之前施用。
30.权利要求22的方法，其中所述的慢性病毒性感染选自乙性肝炎病毒(HCV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、巨细胞病毒(CMV)、非洲淋巴细胞瘤病毒(EBV)、水痘-带状疱疹病毒、柯萨奇病毒、以及人体免疫缺陷病毒(HIV)。
31.一种治疗慢性病毒性感染的药物组合物，该组合物在药学可接受载体介质中含有治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂和至少一种化疗药物。
32.权利要求31的药物组合物，其中至少一种IDO的抑制剂选自1-甲基-DL-色氨酸(1MT)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、吲哚3-甲醇、3，3′-二吲哚甲烷(DIM)、brassinin、5-甲基-brassinin、没食子酸表没食子儿茶酚酯、5-溴-4-氯-吲哚酚1，3-双乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-DL-色氨酸、5-溴吲哚双乙酸酯、苯基-TH-DL-色氨酸、丙烯基-TH-DL-色氨酸、甲基-TH-DL-色氨酸、brassilexin、3-氨基-2-萘甲酸、β-咔啉、3-丁基-β-咔啉、6-氟-3-甲酯基-β-咔啉、6-异硫氰酸-3-甲酯基-β-咔啉、3-丙氧基-β-咔啉、3-羧基-β-咔啉、3-丙氧甲酰基-β-咔啉、以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉。
33.权利要求32的药物组合物，其中至少一种IDO抑制剂为1-甲基-DL-色氨酸(1MT)。
34.权利要求31的药物组合物，其中至少一种化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。
35.一种在需要其的患者中治疗癌症的方法，该方法包括给该患者施用治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂抑制剂，其中该IDO抑制剂选自苯基-TH-DL-Trp(3-(N-苯基-硫代乙内酰脲)-吲哚)、丙烯基-TH-DL-trp(3-(N-烯丙基-硫代乙内酰脲)-吲哚)、以及甲基-TH-DL-trp(3-(N-甲基-硫代乙内酰脲)-吲哚)。
36.权利要求35的方法，其中所述癌症选自下列的癌症前列腺、结直肠、胰腺、子宫颈、胃、子宫内膜、脑、肝脏、膀脱、卵巢、睾丸、头部、颈部、皮肤(包括黑素瘤和基底细胞癌)、间皮层、白细胞(包括淋巴瘤和白血病)、食道、乳腺、肌肉、结缔组织、肺(包括小细胞肺癌和非小细胞癌)、肾上腺、甲状腺、肾脏、或骨；亦包括成神经胶质细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、肉瘤、绒毛膜癌、皮下基底细胞癌、以及睾丸精原细胞瘤。
37.一种治疗癌症的药物组合物，该组合物在药学可接受载体介质中含有至少一种治疗有效量的吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂，其中该IDO抑制剂选自苯基-TH-DL-Trp(3-(N-苯基-硫代乙内酰脲)-吲哚)、丙烯基-TH-DL-trp(3-(N-烯丙基-硫代乙内酰脲)-吲哚)、以及甲基-TH-DL-trp(3-(N-甲基-硫代乙内酰脲)-吲哚)。
38.一种在需要其的患者中治疗癌症的方法，该方法包括同时或顺序施用治疗有效量的至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂和至少一种化疗药物。
39.权利要求38的方法，其中至少一种化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。
40.权利要求39的方法，其中至少一种化疗药物为紫杉醇。
41.权利要求38的方法，其中至少一种IDO抑制剂选自1-甲基-DL-色氨酸(1MT)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、吲哚3-甲醇、3，3′-二吲哚甲烷(DIM)、brassinin、5-甲基-brassinin、表没食子儿茶酚没食子酸、5-溴-4-氯-吲哚酚1，3-双乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-DL-色氨酸、5-溴吲哚双乙酸酯、苯基-TH-DL-色氨酸、丙烯基-TH-DL-色氨酸、甲基-TH-DL-色氨酸、brassilexin、3-氨基-2-萘甲酸、β-咔啉、3-丁基-β-咔啉、6-氟-3-甲酯基-β-咔啉、6-异硫氰酸-3-甲酯基-β-咔啉、3-丙氧基-β-咔啉、3羧基-β-咔啉、3-丙氧甲酰-β-咔啉、以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉。
42.权利要求41的方法，其中至少一种IDO抑制剂为1-甲基-DL-色氨酸(1MT)。
43.权利要求38的方法，其中同时施用至少一种IDO抑制剂和至少一种化疗药物。
44.权利要求38的方法，其中顺序施用至少一种IDO抑制剂和至少一种化疗药物。
45.权利要求44的方法，其中至少一种IDO抑制剂是在至少一种化疗药物之前施用。
46.权利要求44的方法，其中至少一种化疗药物是在至少一种IDO抑制剂之前施用。
47.权利要求38的方法，其中所述的癌症选自下列的癌症前列腺、结直肠、胰腺、子宫颈、胃、子宫内膜、脑、肝脏、膀脱、卵巢、睾丸、头部、颈部、皮肤(包括黑素瘤和基底细胞癌)、间皮层、白细胞(包括淋巴瘤和白血病)、食道、乳腺、肌肉、结缔组织、肺(包括小细胞肺癌和非小细胞癌)、肾上腺、甲状腺、肾脏、或骨；亦包括成神经胶质细胞瘤、间皮瘤、肾细胞癌、胃癌、肉瘤、绒毛膜癌、皮下基底细胞癌、以及睾丸精原细胞瘤。
48.一种治疗癌症的药物组合物，该组合物在药学可接受载体介质中含有至少一种吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)抑制剂和至少一种化疗药物。
49.权利要求48的药物组合物，其中至少一种化疗药物选自紫杉醇(泰素)、顺铂、西多紫衫醇、卡铂、长春新碱、长春碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺、CPT-11、5-氟尿嘧啶(5-FU)、吉西他滨、雌莫司汀、卡氮芥、阿霉素、足叶乙甙、三氧化二砷、伊立替康、以及埃博霉素的衍生物。
50.权利要求49的药物组合物，其中至少一种STI为紫杉醇。
51.权利要求48的药物组合物，其中至少一种IDO的抑制剂选自1-甲基-DL-色氨酸(1MT)、β-(3-苯并呋喃基)-DL-丙氨酸、β-(3-苯并(b)噻吩基)-DL-丙氨酸、6-硝基-L-色氨酸、吲哚3-甲醇、3，2′-二吲哚甲烷(DIM)、brassinin、5-甲基-brassinin、表没食子儿茶酚没食子酸、5-溴-4-氯-吲哚酚1，3-双乙酸酯、9-乙烯基咔唑、阿西美辛、5-溴-DL-色氨酸、5-溴吲哚双乙酸酯、苯基-TH-DL-色氨酸、丙烯基-TH-DL-色氨酸、甲基-TH-DL-色氨酸、brassilexin、3-氨基-2-萘甲酸、β-咔啉、3-丁基-β-咔啉、6-氟-3-甲酯基-β-咔啉、6-异硫氰酸-3-甲酯基-β-咔啉、3-丙氧基-β-咔啉、3-羧基-β-咔啉、3-丙氧甲酰-β-咔啉、以及3-碳-叔-丁氧基-β-咔啉。
52.权利要求48的药物组合物，其中至少一种IDO抑制剂为1-甲基-DL-色氨酸(1MT)。
全文摘要
本申请公开了治疗恶性肿瘤和慢性病毒性感染的组合物和方法。
文档编号A61K31/405GK1794986SQ200480014321
公开日2006年6月28日 申请日期2004年2月20日 优先权日2003年3月27日
发明者G·C·普瑞德尔盖斯特, A·J·马勒, J·B·杜哈戴卫, W·迈拉仇斯基 申请人:兰肯瑙医学研究所