专利名称：酪氨酸激酶抑制剂在治疗糖尿病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺(下文称之为“化合物I”)或其药学上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的药物组合物中的用途，涉及化合物I或其药学上可接受的盐在治疗糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病中的用途，涉及治疗患有糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的温血动物的方法，所述温血动物包括哺乳动物，尤其是人，所述方法通过向需要这类治疗的所述动物施用对抗所述疾病有效剂量的化合物I或其药学上可接受的盐来实现。
图1.在bTC-6细胞和离体大鼠胰岛中，细胞因子诱导的NO产生不受10μM化合物I如盐I影响。结果为三次独立观测的平均值±SEM。
图2.化合物I如盐I部分地针对一氧化氮保护人胰岛细胞。结果为来自三个单独供体的平均值±SEM。
图3.用杂乱siRNA或c-Abl-特异性siRNA处理的bTC-6细胞的细胞凋亡速率。细胞因子处理(IL-1β+IFN-γ+TNF-α)始于细胞分析前24小时。细胞凋亡通过流式细胞术进行定量。结果为3-4次观测的平均值±SEM。
背景技术：
一百万以上的美国人患有I型糖尿病，也称之为胰岛素依赖型糖尿病(缩写为IDDM)或幼年型糖尿病。在I型糖尿病中，人的胰腺产生很少或不产生胰岛素-一种维持生命所必需的激素。尽管原因还不完全知晓，但I型糖尿病是多因素的自身免疫性疾病，它是由胰腺中产胰岛素的β细胞的特异性和进行性破坏引起的。它是儿童期花费最高的慢性疾病之一，并且是人们永远无法去除的疾病。虽然胰岛素可使人得以存活，但是它并不能治愈糖尿病，也不能预防其最终的和破坏性的结果肾衰竭、失明、神经损伤、截肢、心脏病发作和中风。为了存活，患有I型糖尿病的人必须每天接受多次胰岛素注射或者通过泵持续地输注胰岛素，并必须每天刺指采血六次或更多次来测量他们的血糖。在努力平衡胰岛素注射与其摄食量的同时，患有I型糖尿病的人还必须一直准备着潜在的血糖过低即低血糖和血糖过高即高血糖反应，这些反应可威胁生命。尽管严格注意保持健康膳食、锻炼方案并总是注射适量的胰岛素，但是许多其它因素能够不利地影响人的血糖控制，这包括应激、激素变化、生长周期、身体活动、药物治疗、疾患/感染和疲劳。即使使用胰岛素，I型糖尿病也通常导致生命质量的急剧下降，并使平均寿命缩短15年。每年大约30,000美国人被诊断为患有I型糖尿病，其中超过13,000人为儿童。也就是每天35名儿童。
II型糖尿病也称为非胰岛素依赖型糖尿病(缩写为NIDDM)或成年型糖尿病，通常与肥胖、胰岛素抗性和胰岛素的相对缺乏有关。尽管这种形式的糖尿病在多数情况下是非胰岛素需求性的，但是它和I型糖尿病之间存在着惊人的相似性。例如，现在人们一致认为在II型糖尿病中也存在着产胰岛素的β细胞的绝对缺乏，这种β-细胞缺乏很可能是由于β-细胞的死亡速率增加造成的。因此，产生针对β-细胞死亡的保护作用的药理学治疗可能可用作I型和II型糖尿病两者的治疗。
发明内容
令人惊讶地，发现c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐例如化合物I或其药学上可接受的盐如盐I特别可用于治疗糖尿病，如I型糖尿病或II型糖尿病。出乎意料地，发现c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐例如化合物I或其药学上可接受的盐如盐I能用于治愈或预防糖尿病，如I型或II型糖尿病。
化合物I为具有下式的4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺 化合物I游离碱、其可接受的盐及其制备在欧洲授权专利0564409中公开。化合物I游离碱相当于其活性部分。
化合物I的单甲磺酸加成盐(下文称之为“盐I”)及其优选的晶形如β晶形在1999年1月28日公开的PCT专利申请WO99/03854中有描述。
本发明涉及c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐作为抗糖尿病如I型或II型糖尿病药的用途。最优选地，本发明涉及化合物I或其药学上可接受的盐如盐I作为抗糖尿病如I型或II型糖尿病药的用途。
本发明所用的c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂选自包括以下化合物的组4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺，其在本文中被称为化合物I，是一种PDGF-受体同种型、Bcr-Abl和c-Kit的抑制剂，其以高效力和口服利用度而著称；双(1H-2-吲哚基)-1-甲酮类，即另一类酪氨酸激酶抑制剂，其已被表征为PDGF-R TK抑制剂，如Mahboobi S等，J.Med.Chem.2002，451002-1018中所述，特此引入作为参考；CAS编号为71897-07-9的PDGF受体激酶阻滞剂AG1295；AG1295/96，如Kovalenko M等，Cancer Res.1994546106-6114和Ludewig D等，Cell Tissue Res.2000，29997-103中所述，特此引入作为参考；CT52923(4-(6，7-二甲氧基-4-喹唑啉基)-N-(3，4-亚甲二氧基苄基)-1-哌嗪硫代甲酰胺)；RP-1776；GFB-111；吡咯并[3，4-c]-β-咔啉-二酮类；SU 102(由SUGEN开发)；CAS编号为146535-11-7的AG1296；由Aventis Pharma开发的RPR101511A；由ZymoGenetics开发的CDP 860和Zvegf3；来自Pfizer的CP 673451和PD 170262；CAS编号为190726-45-5的KI 6783，其是由日本Kirin Brewery开发的一种PDGF-R抑制剂；由日本Kyowa Hakko和美国Millenium Pharmaceuticals开发的KN 1022；由Pfizer开发的AG 13736；由Chiron Corporation开发的CHIR 258；来自Millenium Pharmaceuticals的MLN 518和来自SUGEN-Pfizer的SU 11248，来氟米特；或者它们药学上可接受的盐。
CT52923已经在以下文献中有描述Matsuno K等，“PDGF受体磷酸化抑制剂-1的合成及构效关系”，第18届药物化学研讨会(18th Symposiumon Medicinal Chemistry)，1998年11月25-27日；京都，日本，日本制药协会，药物化学部，东京，日本摘要2-P-05。
RP-1776是一种环肽，从链霉菌种(Streptomyces sp)KY11784的培养液中分离得到。它例如在Toki S，Agatsuma T等，J.Antibiot.(东京)2001年5月；54(5)405-14中有描述。
GFB-111例如在Blaskovich MA等，Nat.Biotechnol.2000年10月；18(10)1065-70和Delarue F.等，美国癌症研究协会第91届年会(91thAnnual meeting of the American Association for Cancer research)41458，2000中有描述。
吡咯并[3，4-c]-β-咔啉-二酮类例如在Teller S，Eur.J.Med.Chem.2000年4月；35(4)413-27中有描述。
CDP 860是衍生自人抗-血小板源生长因子β受体抗体的PEG化抗体片断。
CP 673451靶向于PDGF受体。
PD 170262或2-[4-(2-二乙氨基乙氧基)苯基氨基]-8-甲基-6-(3-噻吩基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7(8H)-酮是强效酪氨酸激酶抑制剂，对血小板源生长因子酪氨酸激酶具有选择性。一系列2-氨基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶类的合成和酪氨酸激酶抑制活性例如在Klutchko S.等，第213届美国化学协会国家会议(213thAmerican Chemical Society National meeting)摘要MEDI 201(海报)，1997，美国中有描述。
KI 6783或4-(3，4-二甲氧基苯氧基)-6，7-二甲氧基喹啉例如在Kubo K.等，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 72935-2940，1997和YagiM.等，Exp.Cell Research 234285-92，1997中有描述。
抑制PDGFR磷酸化的KN1022或6，7-二甲氧基-4-[4-(4-硝基苯基)氨基羰基哌嗪-1-基]-喹唑啉例如在第217届美国化学协会国家会议摘要MEDI 061第1部分，1999，日本中有描述。
AG 013736或N-甲基-2-[3-[2-(2-吡啶基)乙烯基]-1H-吲唑-6-基磺酰基]-苯甲酰胺例如在Heller等，AG 013736、即VEGF/PDGFR酪氨酸激酶的一种小分子抑制剂的药理学活性，美国癌症研究协会第93届年会，431082，2002，美国中公开。
CHIR 258为口服有效的氨基-苯并咪唑喹啉生长因子激酶抑制剂，其表现出针对受体酪氨酸激酶、例如来自PDGFR家族的受体酪氨酸激酶的抑制活性谱。CHIR 258例如在Steigerwalt R等和Lee SH等，美国癌症研究协会第94届年会，分别在753(加海报)摘要3783和934(加海报)摘要R4702，2003，美国中公开。
SU11248或5-[3-氟-2-氧代-1，2-二氢吲哚-(3Z)-亚基甲基]-2，4-二甲基-1H-吡咯-3-甲酸(2-二乙基氨基乙基)胺为多靶标的激酶抑制剂，对例如PDGFR具有选择性。SU11248例如在Xin L.等，美国癌症研究协会第93届年会，431081(加海报)，2002，美国中公开。
MLN 518为式4-[4-(N-对-异丙氧基苯基氨基甲酰基)-1-哌嗪基]-6-甲氧基-7-(哌啶子基丙基氧)-喹唑啉的喹唑啉哌嗪基衍生物，其在结合试验中抑制例如PDGF R磷酸化，它例如在Stone RM等，Blood 10265-66，2003、Kelly LM等，Cancer Cell 1421-23，2002中有描述。
来氟米特(SU 101)或4-异噁唑甲酰胺，5-甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]为酪氨酸激酶抑制剂。
SU11654抑制c-kit的酪氨酸激酶活性。
由代码、通用名或商标名标识的活性剂的结构可由现行版本的标准汇编“The Merck Index”或由数据库如Patent International(如IMS WorldPublication)获取。特此将其相应内容引入作为参考。
本发明还涉及4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺、双(1H-2-吲哚基)-1-甲酮类、AG1295、CT52923、RP-1776、GFB-111、吡咯并[3，4-c]-β-咔啉-二酮类、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD 170262、KI6783、KN 1022、AG 13736、CHIR 258、MLN 518、SU 11248、来氟米特或其药学上可接受的盐在制备治疗糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的药物中的用途，优选使用化合物I或其药学上可接受的盐。
本发明还涉及c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐在制备治愈糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的药物中的用途，优选地，所述的c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂选自包括以下化合物的组4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺、双(1H-2-吲哚基)-1-甲酮类、AG1295、CT52923、RP-1776、GFB-111、吡咯并[3，4-c]-β-咔啉-二酮类、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD 170262、KI 6783、KN 1022、AG 13736、CHIR 258、MLN 518、SU 11248、来氟米特或它们药学上可接受的盐，优选4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺。
在本说明书中，术语“治疗”既包括防范性或预防性的治疗，又包括治愈性或疾病抑制性的治疗，包括处于糖尿病危险之中的患者以及得病患者的治疗。该术语还包括用于延迟疾病进展的治疗。
申请人用“抑制和/或逆转糖尿病”意指在患者中不再存在糖尿病病情或者所述疾病不如治疗前或无治疗时严重。
本文所用的术语“治愈”意指治疗导致糖尿病或进行中的糖尿病发作减轻。
术语“防范性的”或“预防”意指预防糖尿病的发作或复发。
本文所用的术语“延迟进展”意指与不施用活性化合物时的疾病发展相比，向处于糖尿病前期或早期的患者施用活性化合物防止疾病进一步发展或减慢疾病的发展。
本发明的药物组合物可由本身已知的方式制备，并且是适合于经肠如口服或直肠和经胃肠外施用于包括人在内的温血动物的那些组合物，其包含治疗有效量的至少一种单独的或与一种或多种药学上可接受的载体、尤其是适于经肠或经胃肠外应用的载体组合的药理学活性成分。本发明的剂型优选的施用途径是口服。
因此，本发明还涉及治疗患有糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的温血动物的方法，该方法包括向需要这类治疗的所述动物施用治疗有效量的化合物I或其药学上可接受的盐。
本发明涉及向患有糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病、优选I型糖尿病的人类个体施用化合物I的酸加成盐且优选盐I、即4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺的单甲磺酸盐的方法。
相关领域的技术人员完全能够选择有关试验模型来证实本文所提及的对于糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的有益效果。此化合物的药理学活性可以例如通过下文所述的实施例、通过体外试验和体内试验或者在合适的临床研究中证明。合适的临床研究是例如在患有糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的患者中进行的公开标示、非随机化、剂量递增研究。在这些研究中，例如通过每4周评价疾病而基于用安慰剂实现的对照来确定疗效。
化合物I的有效剂量可根据所采用的具体化合物或药物组合物、施用方式、所治疗的糖尿病类型如I型或II型或其严重程度而变化。给药方案依照多种其它因素进行选择，包括患者的肾功能和肝功能。普通技术的医师、临床医生或兽医能够容易地确定和开具预防、对抗或阻止病情进展所需的有效量的化合物。
根据年龄、个体状况、施用方式和所涉及的临床情况不同，向体重约70kg的温血动物施用化合物I或其药学上可接受的盐的有效剂量，例如相当于100至1000mg、尤其是800mg作为活性部分的游离碱的日剂量。优选地，温血动物为人。对于对日剂量反应不足的患者，可安全地考虑增加剂量，并且只要患者由治疗中受益且不存在限制性的毒性，就可以对患者进行治疗。
本发明还涉及向患有糖尿病如I型糖尿病或II型糖尿病的人类个体施用化合物I或其药学上可接受的盐的方法，该方法包括向人类个体每天一次施用药学有效量的化合物I或其药学上可接受的盐达超过3个月的时间。本发明尤其涉及这样的方法，其中向成年人施用日剂量为400至800mg、优选800mg的化合物I。
本发明还提供了一种药包，其包含c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，如化合物I或其药学上可接受的盐如盐I，以及关于向患有糖尿病如I型糖尿病、II型糖尿病的患者进行施用的印刷说明。
实施例1化合物I如盐I针对β-细胞死亡和糖尿病提供保护吗？在以下的实施例中，β-TC6细胞是指beta-TC6细胞。
胰岛素依赖型(I型)糖尿病(IDDM)是多因素的自身免疫性疾病，它是由产胰岛素的β细胞的特异性和进行性破坏引起的。认为β-细胞的功能障碍和损伤是因为其与胰岛浸润细胞(巨噬细胞、CD4+或CD8+(NK)T-细胞)的直接接触和/或暴露于这些细胞所产生的细胞毒性介质，如促炎细胞因子(IL-1、TNF-α、IFN-γ)、自由基、Fas配体、TRAIL和穿孔素。针对β-细胞的自身免疫性可由环境因素如β-细胞毒素、营养成分、应激、代谢超负荷、病毒等引发。在I型糖尿病中，可能β-细胞通过将外部死亡信号转化为内部细胞凋亡事件而主动地参与其自身的破坏作用。促炎细胞因子、特别是IL-1和IFN-γ的组合诱导β-细胞的细胞凋亡和坏死。因此，可以想像这些细胞因子不仅调节胰岛浸润免疫细胞的活性，而且在I型糖尿病的致病机理中对β-细胞施加直接的有害作用。似乎用IL-1刺激β-细胞引起多个信号传导事件，包括蛋白激酶(PKC、p38、JNK、ERK、MSK1)、脂肪酶(PLC、PLD、鞘磷脂酶)、环加氧酶和转录因子(NF-κB、ATF-2、c-jun、Elk-1、CREB、cEBP-β、IRF-1、STAT-1)的活化。这些事件之后是诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和应激相关的蛋白如hsp70、血红素加氧酶、Mn-SOD、ICE等的诱导。不幸的是，尚不清楚基因表达中的哪些改变对于I型糖尿病中β-细胞的死亡而言是必需的。细胞凋亡主要是响应紫外光或DNA修复抑制而在β-细胞系中发生。这之前发生p53肿瘤抑制蛋白诱导、反应性氧元素的产生、PARP抑制、S-和G2-细胞周期阻抑以及线粒体膜电位下降。细胞因子主要促进坏死，仅在较小程度上促进细胞凋亡，其活化实质上与DNA修复抑制或紫外光相同的信号传导步骤。根据这些体外实验，显然β-细胞死亡方式可随死亡信号的不同而变化，而且类似的信号传导路径可被用以实现不同形式的β-细胞死亡。
C-Abl是广泛表达的蛋白酪氨酸激酶，其具有大约145kDa的分子量。在生理条件下，已经证明c-Abl参与调节细胞骨架功能如迁移和细胞结构以及细胞周期进程。然而，当细胞暴露于不同形式的应激时，c-Abl变得高度活化，这导致细胞周期阻抑和细胞凋亡。
综上所述，非β-细胞的广泛研究已经证明c-Abl在对不同类型应激的响应中促进细胞凋亡。c-Abl在产胰岛素细胞中的推断作用尚未阐明。因此，尚不清楚该蛋白是否在β-细胞死亡以及细胞凋亡和坏死之间的选择中发挥作用。
对于I型糖尿病的意义。尽管I型糖尿病的致病机理似乎非常复杂，但有可能导致β-细胞死亡的胞内路径在某一特定点上汇合。假想地，这能够为我们提供仅采用一种途径来阻断多个死亡信号、由此实现β-细胞存活的可能性。
酪氨酸激酶c-Abl可能是β-细胞死亡的一种重要介导物。C-Abl在bTC-6细胞和离体大鼠胰岛中有表达，并且无论是使用药理学活性剂化合物I还是通过用RNAi技术敲除C-Abl表达所实现的C-Abl活性抑制均产生针对促炎细胞因子或一氧化氮供体所诱导的β-细胞死亡的保护作用。C-Abl并非通过促进一氧化氮产生发挥作用，因为抑制C-Abl不会抵制细胞因子所诱导的一氧化氮产生。
基于这些数据，c-Abl作为应激和外部死亡信号的感受器发挥作用，并且c-Abl的活化可导致JNK和p38MAP激酶磷酸化和活化、NF-κB和PI3K失活、线粒体释放促凋亡因子并最终导致β-细胞死亡。化合物I能够阻断不同的死亡信号，由此实现β-细胞的存活和针对糖尿病的保护作用。
结果为了确定化合物I如盐I是否干预或者c-Abl是否参与导致β-细胞死亡的信号传导级联，使离体大鼠胰岛暴露于缓慢释放的一氧化氮供体DETA/NO(0.5mM)或暴露于IL-1β(25U/ml)+IFN-γ(1000U/ml)+TNF-α(1000U/ml)的组合达24小时。在两种情况下，在整个孵育期间，均在有或无10μM化合物I如盐I的条件下培养胰岛。在孵育期之后，将胰岛用碘化丙锭(propidium iodide)+双苯酰亚胺(bisbenzimide)活染并在荧光显微镜下拍照。将凋亡的(白色皱缩或破碎的核)和坏死的(红色或粉红色未破碎的核)细胞进行计数并表达为总细胞数的百分比。盐I如化合物I其本身不影响胰岛细胞的存活力。DETA/NO诱导10％的胰岛细胞坏死，而细胞因子组合诱导大约40％的坏死。值得关注的是，NO供体所诱导的细胞死亡明显地被化合物I如盐I抵制(表1)。同样，细胞因子诱导的胰岛细胞坏死部分地被c-Abl抑制剂减少。在所有组中，凋亡细胞的频率低于10％(结果未显示)。
表1.化合物I如盐I针对NO-和细胞因子所诱导的胰岛细胞死亡的保护作用。结果为三次独立观测的平均值±SEM。
测定了来自在有或无1或10μM化合物I如盐I的条件下用以上所给出的细胞因子组合孵育24小时的细胞的亚硝酸盐水平。化合物I如盐I不抑制细胞因子诱导的一氧化氮产生(图1)。相反，盐I存在下的一氧化氮产量更高，可能是由于接触了盐I的细胞存活力更高，与单独的细胞因子相比，接触了细胞因子+化合物I的细胞释放出多35％的亚硝酸盐。
测试了化合物I在体外是否针对致糖尿病药链脲霉素提供保护。在0.4mM链脲霉素下，所述保护作用非常显著，而在0.75mM链脲霉素下，化合物I仅提供弱保护作用(表2)。在0.6mM链脲霉素下，化合物I的保护效果中等。
表2.化合物I如盐I针对链脲霉素所诱导的胰岛细胞死亡的保护作用
在链脲霉素之前24小时添加化合物I(10μM)。收集胰岛并在添加链脲霉素后6小时拍照。将坏死的(红色或粉红色未破碎的核)细胞进行计数并表达为总细胞数的百分比。结果为坏死细胞百分比，表达为三次独立观测的平均值±SEM。***、**和*表示p＜0.001、0.01和0.05，使用学生成对t-检验。
为了研究化合物I如盐I是否也在人胰岛细胞中调控细胞死亡，在有或无化合物I如盐I(10μM)、DETA/NO(2mM)和布雷菲德菌素A(10μM)的条件下孵育人胰岛。如用大鼠胰岛所观察到的那样，其同样部分地针对NO的毒性水平为人胰岛提供保护(图2)。因此，盐I部分地抵制布雷菲德菌素B所诱导的胰岛细胞死亡(ER应激)。
为了研究在体内c-Abl是否调控链脲霉素所诱导的糖尿病和/或化合物I如盐I是否也针对链脲霉素所诱导的糖尿病提供保护作用，使用如下操作从Taconic M & B，Sollentuna，瑞典购买重约25g的雄性NMRI小鼠。在整个研究中，动物能够自由摄取自来水和粒状食物。每周更换垫料。在实验前用Pen传感器(MediSense，Waltham，MA，美国)测定体重和血糖。连续三天(第-1、0、1天)以200mg/kg体重向动物管饲200微升溶于0,9％NaCl的化合物I如盐I。在第0天，将小鼠尾静脉注射120或160mg/kg体重的链脲霉素(Sigma-Aldrich Co，St.Louis，MO，美国)。注射前将链脲霉素溶于0,9％ NaCl中。在第0、1、2、3、5、7、9天测体重并对从尾部收集的血样测血糖。在第9天通过断颈处死动物。所有的动物实验均得到了当地动物伦理学委员会(Tierp，瑞典)的批准。
化合物I治疗完全地针对120mg/kg的链脲霉素注射提供保护(表4)。另外，化合物I如盐I部分地针对更高的链脲霉素剂量(160mg/kg)提供保护(表3)。
表3.化合物I如盐I对160mg/kg链脲霉素所诱导的小鼠糖尿病的作用
在第-1、0和1天将NMRI小鼠每天一次通过管饲法填喂200mg/kg化合物I。在第0天，将小鼠静脉内注射160mg/kg链脲霉素，并在图中所给出的各天检测血糖。*、**和***表示相对于STZ p＜0.05、0.01和0.001，使用学生t-检验。观测次数为5(盐水和化合物I)和10(STZ和STZ+化合物I)。
表4.化合物I对120mg/kg链脲霉素所诱导的小鼠糖尿病的作用
在第-1、0和1天将NMRI小鼠每天一次通过管饲法填喂200mg/kg化合物I。在第0天，将小鼠静脉内注射120mg/kg链脲霉素，并在图中所给出的各天检测血糖。*和***分别表示当与相应的STZ组比较时(学生t-检验)，p＜0.05和0.001。观测次数为10。
研究设计和方法1.鉴定通过化合物I抑制的路径促进人β-细胞死亡的另外的死亡信号和应激因素。用10uM盐I如化合物I处理人胰岛细胞，并测定响应以下细胞毒性物质的胰岛细胞死亡过氧化氢(150μM；氧化应激)、星孢素(200nM，PKC-抑制)、FCCP(5μM；解偶联和线粒体膜渗透性转变)、布雷菲德菌素A(10μM，ER应激)、毒胡萝卜内酯(thapsigargin)(200nM，ER应激和增加的Ca2+)和阿霉素(2μM，DNA损伤)。通过碘化丙锭和双苯酰亚胺活染继之以荧光显微镜检来观察细胞死亡。使用双组10个胰岛。该操作使得可对完整胰岛的细胞凋亡和坏死两者进行定量。所述活染技术与XTT检测法(简化形式的MTT检测法)组合，这为我们提供了简单而快速的胰岛存活力的筛选测定法。
2.研究化合物I是否影响I型糖尿病动物模型中糖尿病的发展。如上所述，化合物I如盐I针对单剂量链脲霉素注射提供保护。为了延伸这种观测结果，评价了c-Abl在多剂量链脲霉素处理的c57KSJ/黑色小鼠模型的糖尿病发展中的作用。每天的化合物I治疗(在200μl 0.9％NaCl中的200mg/kg化合物I)始于首次链脲霉素处理(每天低剂量40mg/kg注射5天)前1天，并持续10天或两周，此时出现明显糖尿病。通过每天测量血糖值评价所述治疗。在10天或两周后，处死小鼠，取出胰腺并固定以进行免疫组织化学和形态测量学分析。对胰岛炎症和β-细胞量计分。
研究了c-Abl在非肥胖糖尿病小鼠(缩写为NOD小鼠)的疾病复发中的重要性。使用上文所给出的相似方案。但是，在这种情况下，对糖尿病雌性NOD小鼠给予化合物I治疗。在通过管饲法首次施用化合物I后1天，将从幼NOD小鼠中分离的300个胰岛移植到肾囊下。7天后测量血糖值并处死小鼠。在此时间点，多数移植的β-细胞已经被活化的免疫细胞破坏，化合物I对β-细胞存活的任何推断效果均是可检测的。回收移植物并固定以进行分析。
第三，研究了化合物I对NOD小鼠中天生糖尿病病程的作用。使4-5周龄(此时没有或有极小的胰岛炎)的雌性NOD小鼠皮下接受Alzet微型渗透泵，该渗透泵每小时释放0.25μl浓化合物I或单独的赋形剂达4周。4周后处死小鼠，取出胰腺并固定以进行免疫组织化学和形态测量学分析。对胰岛炎的程度和β-细胞量计分。
考虑到c-Abl的药理学抑制可能有问题的可能性，尝试了基因途径。为此目的，从c57/KSJ黑色和NOD小鼠中分离胰岛，通过胰蛋白酶处理分散胰岛细胞。用5MOI指导c-Abl特异性siRNA分子转录的重组腺病毒载体转导胰岛细胞。作为对照，使用编码杂乱siRNA序列的腺病毒载体。然后使细胞在体外重新聚集5天，之后移植到同系小鼠的肾囊下。对小鼠进行治疗并如上文所给出的那样进行分析。
考虑到腺病毒载体固有的毒性和免疫原性，其可能不适合用于体内目的。构建了表达同样的抗c-Abl siRNA构建体的AAV载体。当在体外分散时，大约30％的胰岛β-细胞被AAV转导(结果未显示)。这大大低于用腺病毒载体所获得的转导效率，但是已足够高使得可评价体内β-细胞破坏中的c-Abl。
方法和设备人胰岛。人胰岛在标准培养条件(5.6mM的在RPMI1640中的葡萄糖+10％FCS)下自由漂浮培养。
流式细胞术和细胞分选。使用具有细胞分选能力和使用去稳定形式的绿色荧光蛋白作为报告子的流式细胞仪(FACSCalibur，Becton-Dickinson)可以容易地评估效率，并且同时分选转染细胞用于进一步的实验或移植。因此，不再必须依赖于所选的稳定表达转基因的胰岛瘤细胞克隆的产生(克隆变异的问题)。可使用从未转染细胞中分离的瞬时转染细胞。另外，流式细胞仪也可评估细胞存活力(碘化丙锭染色)和细胞凋亡(抗-活化caspase-3抗体)。另外，流式细胞仪也用于啮齿动物β-细胞分选、细胞周期分析、线粒体膜电位、氧自由基产生和免疫荧光研究(胰岛素、胰高血糖素、Bcl-2)。
实施例2含有β晶形的4-[(4-甲基-1-哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-[[4-(3-吡啶基)-2-嘧啶基]氨基]苯基]-苯甲酰胺甲磺酸盐的胶囊剂用以下组合物制备含有相当于作为活性部分的100mg化合物I(游离碱)的119.5mg盐I的胶囊剂组合物
通过混合各组分并将混合物填充到1号硬明胶胶囊中制备该胶囊剂。
实施例3对体内化合物I诱导的针对β-细胞死亡和糖尿病的保护作用机制的研究背景已知化合物I抑制c-Abl-一种广泛表达的分子量约为145kDa的蛋白酪氨酸激酶。在生理条件下，已经证明c-Abl参与调节细胞骨架功能如迁移和细胞结构以及细胞周期进程。然而，当细胞暴露于不同形式的应激时，c-Abl变得高度活化，这导致细胞周期阻抑和细胞凋亡。
最近获得的结果C-Abl在bTC-6细胞和离体大鼠胰岛中有表达，使用药理学活性剂化合物I抑制c-Abl活性产生针对由链脲霉素、促炎细胞因子或由一氧化氮供体所诱导的β-细胞死亡的保护作用。化合物I如盐I是临床上用于治疗CML的选择性抑制剂。除了c-Abl外，已知化合物I抑制ABL致癌基因、c-KIT、PDGFβ受体和c-Abl同系物ARG。从而有必要证明盐I的效应是经由c-Abl的抑制特异性介导的。因此用杂乱siRNA或对c-Abl具有特异性的siRNA处理bTC-6细胞。利用Lipofectamine试剂将siRNA引入细胞。然后追踪细胞1或3天，之后分离总RNA。由RNA合成cDNA并利用对c-Abl(35个循环)和b-肌动蛋白即β-肌动蛋白(20个循环)具有特异性的引物将其进行PCR扩增。在琼脂糖凝胶上分离PCR产物并通过溴化乙锭染色观察。在siRNA处理后24小时的细胞中未能观察到c-Abl带(未显示)。然而，在72小时，c-Abl带出现。这些结果提示针对c-Abl的siRNA经由RNAi机制介导敲除信使，并且该效应在迅速增殖的bTC-6细胞中仅仅是瞬时的(数据未显示)。确定c-Abl mRNA水平可被RNAi技术降低后，我们接下来研究了缺失c-Abl mRNA的bTC-6细胞是否以细胞死亡增加响应IL-1β、IFN-γ和TFN-α的组合。与在原代胰岛细胞中所观察到的情形相反，bTC-6细胞优先通过细胞凋亡响应细胞因子而死亡。而且，细胞因子诱导的bTC-6细胞死亡在处理后两三天被c-Abl特异性的siRNA强有力地抵制(图3)。这表明c-Abl蛋白的可能缓慢的周转导致siRNA处理的效应延迟。但是更为重要的是，数据提示SALT I所诱导的针对NO供体及细胞因子组合的保护作用是通过c-Abl抑制介导的。
c-Abl和不同MAP激酶之间的关系研究了c-Abl与可能作为c-Abl下游效应物起作用的不同MAP激酶p38、JNK和ERK之间的关系。为此目的，将大鼠胰岛用10μM化合物I预孵育24小时，然后暴露于DETA/NO(2mM)以及IL-1β、IFN-γ和TNF-α的组合20分钟。然后用磷酸特异性抗体和免疫印迹对胰岛进行p38、JNK2和ERK1/2磷酸化分析。化合物I如盐I治疗部分地(25-45％)抵制DETA/NO诱导的p38、JNK和ERK活化，并增强细胞因子诱导的MAPK活化(表5和6)。
表5.化合物I如盐I对DETA/NO-和细胞因子-诱导的p38、JNK和ERK活化的作用
将离体大鼠胰岛用10μM化合物I预孵育24小时，然后暴露于DETA/NO或者细胞因子IL-1β(50U/ml)和IFN-γ(1000U/ml)20分钟。通过免疫印迹测定ERK、JNK和p38的磷酸化并表达为“/ERK、JNK和p38的总量”。结果用对照的百分比表达，是4次独立观测的平均值。**和*分别表示当与化合物I的相应组比较时p＜0.01和p＜0.05，使用2-元ANOVA和学生t-检验。
表6.重新计算来自表5的结果以便将化合物I的作用表达为无任何化合物I添加的相应组的百分比
这些结果支持细胞因子诱导的一氧化氮产生至少部分地经由c-Abl路径活化JNK和p38，并且这导致β-细胞死亡。另一方面，在对细胞因子的响应中出现的p38和JNK活性早期升高似乎被c-Abl抑制。然而，在这种情形下，有可能细胞因子所诱导的p38和JNK活性的该第一个峰值代表导致基因表达改变和增殖增加的生理学响应，而并非细胞凋亡本身。例如，已经表明p38和JNK的细胞因子活化参与iNOS基因的后续表达。在此背景下，目前所观察到的c-Abl介导的p38和JNK抑制很好地解释了用细胞因子和化合物I处理的胰岛中所观察到的一氧化氮产生增加。
由于这些数据，c-Abl发挥应激和外部死亡信号的感受器作用，c-Abl活化可导致JNK和p38MAP激酶的磷酸化和活化并最终导致β-细胞死亡。
附加实验1.研究c-Abl在β-细胞中的表达。c-Abl mRNA的表达可通过实时PCR评估。将胰岛的c-Abl mRNA水平与其它组织的c-Abl mRNA水平进行比较。对c-Abl具有特异性的荧光探针购自TIB MOLBIOLSyntheselabor(柏林，德国)，用Lightcycler仪器参照c-Abl cDNA标准曲线对荧光信号进行定量。将c-Abl mRNA分子数标准化为b-肌动蛋白mRNA分子。将人胰岛的c-Abl mRNA含量与肝、肌肉、肾、脾、脑和肺的c-Abl mRNA含量进行比较。平行地，对可以以与c-Abl类似的方式发挥作用的c-Abl类似性酪氨酸激酶ARG的表达进行定量。在此背景下，确定了c-Abl mRNA水平是否被细胞因子、氧化应激和ER应激影响。将人胰岛暴露于IL-1β(25U/ml)+IFN-γ(1000U/ml)+TNF-α(1000U/ml)、100mM过氧化氢或布雷菲德菌素A(10μM)3小时，然后通过实时PCR分析c-Abl mRNA的表达。
2.研究在对β-细胞应激的响应中c-Abl是否被磷酸化。通过用pCDNA3/c-Abl质粒(获自Ludwig Institute，乌普萨拉大学)脂转染细胞、然后进行遗传霉素(geneticin)抗性选择产生过表达野生型c-Abl的稳定的bTC-6细胞系。然后将过表达c-Abl的bTC-6细胞暴露于IL-1、布雷菲德菌素A和DETA/NO 20、60、360分钟，以确定在对细胞因子、ER应激和一氧化氮的响应中c-Abl是否被磷酸化。然后在磷酸酶抑制剂的存在下将细胞匀浆，并利用K-12抗-c-Abl抗体(Santa Cruz)免疫沉淀c-Abl。在PAGE和转移到尼龙滤膜之后，用可由Cell Signaling Technology获得的两个磷酸特异性c-Abl抗体(Tyr245和Thr735)和磷酸酪氨酸抗体4G10对c-Abl带进行氨基酸245处的酪氨酸磷酸化以及总酪氨酸磷酸化分析。当氨基酸残基Tyr245和Thr735被过度磷酸化时c-Abl活性增加。
3.研究c-Abl的亚细胞定位是否受β-细胞应激影响。在盖片上培养过表达c-Abl的bTC-6细胞，然后将其暴露于细胞因子、布雷菲德菌素A和一氧化氮供体6小时。在固定、封闭和透化后，用Mitotracker绿(MolecularProbes)(其将线粒体染成绿色)和K-12c-Abl抗体(Santa Cruz)(其与轭合罗丹明的二抗将c-Abl染成红色)通过共焦显微镜检分析细胞。如果c-Abl由ER重新定位至线粒体，则染色模式由分散的红色和绿色变成唯一的黄色。
4.鉴定c-Abl的下游靶标。为此目的，产生了瞬时过表达野生型或组成型活性形式的c-Abl的CbTC-6细胞。用pcDNA3/c-Abl-载体和GFP-表达载体脂转染(Lipofectamine+Lipofectamine plus)bTC-6细胞。这产生20％GFP-阳性细胞，其有待于通过FACS富集到75％以上。将分选的细胞涂板并培养24小时，然后进行候选靶标ERK、JNK、p38、IκB、p53和AKT(PI3K的下游效应物)的磷酸化分析。分析前20和120分钟，在有或无盐I如化合物I的条件下，用阿霉素(c-Abl的核活化)或DETA/NO(c-Abl的胞浆活化)刺激细胞。利用可商购获得的磷酸特异性抗体(CellSignal Technology)通过免疫印迹分析推断的靶蛋白的磷酸化(ser/thr)。这可揭示在对c-Abl活化的响应中候选效应物是否被磷酸化和活化。利用传统的Western印迹技术分析Bcl-2、Bcl-XL和Aph2水平。在一些情况下，候选蛋白的免疫沉淀有时是必要的，以提高免疫印迹分析的灵敏度。对于酪氨酸特异性的磷酸化，将候选效应物免疫沉淀并利用PY20抗磷酸酪氨酸抗体通过免疫印迹进行分析。
5.研究c-Abl和Shb之间的相互作用进行该实验旨在理解c-Abl和衔接蛋白Shb之间的推断的相互作用。Shb是含有SH2结构域的蛋白，其在N-末端具有富含脯氨酸的基序，具有中央PTB(磷酸酪氨酸结合)-结构域、数个潜在的酪氨酸磷酸化位点和C-末端SH2结构域，已知其在响应酪氨酸激酶活化产生信号传导复合物中发挥作用。值得关注的是，过表达Shb的β-细胞的细胞凋亡倾向增大。的确，当在不存在血清或存在细胞毒性细胞因子的条件下培养胰岛时，表达处于大鼠胰岛素启动子控制下的SHB的转基因小鼠表现出升高的细胞凋亡速率。由于最近的报道证明Shb家族成员Shd结合c-Abl并与之相互作用，有可能在β-细胞中c-Abl经由与Shb的相互作用而发挥作用。为了研究这一点，将被瞬时转染以过表达c-Abl，Shb或Shb突变体的细胞用过钒酸盐处理，然后用抗-Shb-抗体免疫沉淀。然后对免疫沉淀物进行免疫印迹以分析c-Abl和Shb水平以及c-Abl共沉淀的Shb的酪氨酸磷酸化。初步的发现表明c-Abl与Shb共沉淀，且反之亦然，并且c-Abl过表达导致Shb-磷酸化增加(数据未显示)。这些发现支持Shb为c-Abl激酶底物的观点。
为了进一步理解c-Abl和Shb之间的相互作用，进行了融合蛋白pull-down实验。使GST、GST-ShbSH2和GST-ShbPTB/富含脯氨酸结构域融合蛋白与含有高水平c-Abl的COS细胞匀浆相互作用。所述反应是在有或无过钒酸盐刺激的条件下进行的，即为了了解c-Abl酪氨酸磷酸化和磷酸酪氨酸添加的重要性，即为了了解SH2-结构域与磷酸酪氨酸残基相互作用的重要性。通过免疫印迹对pull-down产物进行c-Abl和磷酸-c-Abl分析。这些实验表明Shb的哪些结构域对与非磷酸化或磷酸化c-Abl结合而言是必不可少的。使用c-Abl融合蛋白(c-Abl-SH2和c-Abl-SH3)进行相应的实验以评价哪些结构域对与Shb结合而言是至关重要的。
为了确定Shb-c-Abl相互作用是否在对不同毒性刺激的响应中介导过表达Shb的胰岛细胞发生细胞凋亡的增强倾向，从Shb转基因小鼠中分离胰岛，并将其暴露于细胞因子、DETA/NO和链脲霉素，用或不用化合物I进行预处理。对细胞凋亡和坏死进行定量并将由转基因小鼠获得的数据与平行获得的对照小鼠的数据进行比较。如果Shb胰岛增强的细胞凋亡和坏死水平被化合物I如盐I正常化，则有可能Shb-c-Abl相互作用可能是必要的细胞凋亡调控路径。
设备RNAi.进行该研究旨在利用RNAi技术关闭β-细胞中的基因表达。小干扰RNA(siRNA)以每对RNA寡核苷酸300-600美元的价格购自Dharmacon Research。利用FITC标记的siRNA观察到用Lipofectamine或Lipofectamine 2000有效地将siRNA引入到了产胰岛素的细胞中(结果未显示)。不幸的是，脂质体递送的siRNA的效果只是瞬时的。为了产生重组腺-相关的(AAV)载体，使用了AAV Helper-Free系统(Stratagene)。该试剂盒包括用于产生初步转染效率研究所用的表达β-gal的AAV-载体的质粒。用病毒载体进行的工作得到了瑞典政府机构Arbetarskyddstyrelsen的批准。
实时PCR.Lightcycler仪器(Roche)为实时PCR循环仪。该仪器可快速且准确地定量mRNA分子，因此适合用于基因表达的研究。
提供了共焦显微镜检和电子显微镜检技术。
权利要求
1.c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的盐在制备治疗糖尿病的药物中的用途。
2.c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的盐在制备治愈糖尿病的药物中的用途。
3.c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐或其药学上可接受的盐在制备预防糖尿病的药物中的用途。
4.根据权利要求1至3中任一项的用途，其中c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐选自包括以下化合物的组4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺、双(1H-2-吲哚基)-1-甲酮类、AG1295、CT52923、RP-1776、GFB-111、吡咯并[3，4-c]-β-咔啉-二酮类、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD 170262、KI 6783、KN 1022、AG 13736、CHIR 258、MLN 518、SU 11248、来氟米特或它们药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中糖尿病为I型糖尿病。
6.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中糖尿病为II型糖尿病。
7.根据权利要求4至6中任一项的用途，其中4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺为单甲磺酸盐的形式。
8.治疗患有糖尿病的哺乳动物的方法，该方法包括向需要这类治疗的所述的人施用对抗所述疾病有效剂量的c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂或其药学上可接受的盐，所述酪氨酸激酶抑制剂选自包括以下化合物的组4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺、双(1H-2-吲哚基)-1-甲酮类、AG1295、CT52923、RP-1776、GFB-111、吡咯并[3，4-c]-β-咔啉-二酮类、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD170262、KI6783、KN 1022、AG 13736、CHIR 258、MLN 518、SU 11248、来氟米特或它们药学上可接受的盐。
9.一种药包，其包含c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂以及关于向患有糖尿病如I型糖尿病、II型糖尿病的患者进行施用的印刷说明，所述酪氨酸激酶抑制剂选自包括以下化合物的组4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺、双(1H-2-吲哚基)-1-甲酮类、AG1295、CT52923、RP-1776、GFB-111、吡咯并[3，4-c]-β-咔啉-二酮类、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD 170262、KI 6783、KN 1022、AG 13736、CHIR258、MLN 518、SU 11248、来氟米特或它们药学上可接受的盐。
10.根据权利要求9的药包，其中c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-或ARG-酪氨酸激酶抑制剂为4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)-N-[4-甲基-3-((4-吡啶-3-基)嘧啶-2-基氨基)苯基]-苯甲酰胺或其药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明涉及c－Abl－、PDGF－R－或c－kit－酪氨酸激酶抑制剂如4－(4－甲基哌嗪－1－基甲基)－N－[4－甲基－3－((4－吡啶－3－基)嘧啶－2－基氨基)苯基]－苯甲酰胺、双(1H－2－吲哚基)－1－甲酮类、AG1295、CT52923、RP－1776、GFB－111、吡咯并[3，4－c]－β－咔啉－二酮类、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD 170262、KI 6783、KN 1022、AG 13736、CHIR 258、MLN 518、SU 11248、来氟米特或它们药学上可接受的盐在制备治疗糖尿病如Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病的药物中的用途。
文档编号A61K31/519GK1794995SQ200480014278
公开日2006年6月28日 申请日期2004年5月26日 优先权日2003年5月27日
发明者罗伯特·佩尔·黑格奎斯特, 尼尔斯·里查德·韦尔什 申请人:罗伯特·佩尔·黑格奎斯特, 尼尔斯·里查德·韦尔什