眼用组合物及其在眼睛疾病治疗中的应用的制作方法

1.本发明涉及眼用组合物及其在眼睛疾病治疗医学领域中的用途。
2.本发明涉及眼用医药产品领域。
3.具体地，本发明涉及一种局部使用的眼用组合物，其包含天然聚合物和至少一种渗透压保护剂。


背景技术：

4.受到眼部感染和各种病因所引发疾病影响的人群日益增加。在这些疾病中，最常见的一种是干眼症，这是一种多因素引发的眼表疾病，其特征是泪膜失去稳态，并伴有眼部症状，其中泪膜不稳定和高渗透压、眼表炎症和病变都是引发疾病的原因。
5.多种风险因素，如遗传因素、年龄、性别、饮食、环境条件、生活方式、工作特点、免疫状态、激素状态和药物，都会导致眼表成分的形态和功能改变(1,2)。
6.因此，在许多临床情况下，从轻度到中度干眼症到角膜擦伤和眼科手术效果，都需要保护眼睛表面。此外，泪膜不稳定通常伴有高渗透压、细胞凋亡、炎症和眼表上皮层改变。
7.在缺水性干眼症的情况下泪液减少，和/或在脂质缺乏或蒸发性干眼症的情况下泪液过度蒸发，会导致泪液高渗，造成表现出干眼症症状和体征的恶性循环。
8.干眼症恶性循环的一个关键组成部分是高渗透压，该术语用于表示泪膜中所含电解质大量增加，因此这是恢复泪膜稳态治疗的一个重要目标。
9.了解泪液不稳定导致的高渗作用可以改善治疗方法和干眼治疗的结果(3,4)。
10.干眼高渗的影响可以通过使用含有渗透压保护作用的相容溶质、有助于保护眼表细胞的人工泪液直接控制。相容溶质对上皮细胞的渗透压保护作用以及因此产生的再生作用与这些渗透压保护物质与细胞保持接触的时间有关(5,6)。
11.保护眼表的理想特性是中等粘度(10-30cps)和低细胞毒性(7)。
12.目前，干眼症通常通过滴眼液(称为人工泪液)控制。这些溶液可以是低渗泪液替代物。但是，人工泪液在眼睛表面的持久性有限，因此对高渗透压只有短暂的影响。
13.近年来，已经开发出各种新型人工泪液，它们含有与充当增粘成分的大分子组合的生理相容溶质。
14.市场上有各种用作泪液替代物的产品，包括通常0.1-0.3％中低浓度的聚合物。这些产品中的大多数产品以透明质酸(ha)或纤维素衍生物为代表。
15.然而，这些现有技术产品的缺点是在眼睛表面上的持久性低或者抗炎和再上皮化活性并非总能满足需要。
16.因此，目前需要具有再上皮化、抗氧化和抗炎活性的眼用制剂，其能够恢复泪膜的生理稳态，确保对眼表的充分保护。
17.因此，本发明的目的之一是提供一种具有再上皮化、泪膜渗透压调节、抗炎和抗氧化组合作用的眼用制剂。
18.另一目的在于提供一种治疗和预防干眼症的眼用组合物，其在眼睛表面上的持久
性增加，物理保护增加。


技术实现要素：

19.本发明源于这一发现：将线性聚合物和支化聚合物与两种选择的渗透压保护剂组合，所得组合物的再上皮化、渗透压保护、抗氧化和抗炎活性增加以及在眼睛表面上的持久性增加。
20.因此，已经鉴定了眼用组合物，并构成本发明的目的，其中两种选择的渗透压保护剂与线性聚合物(例如透明质酸)和支化聚合物(例如黄原胶)组合。
21.在本发明的组合物中，聚合物组分决定对泪膜的增粘、保湿和渗透压调节作用；渗透压保护剂在抗炎和再上皮化过程中与聚合物基质发挥协同作用。
22.根据本发明的第一方面，提供一种眼用组合物，其包括基于透明质酸的线性聚合物、基于黄原胶的支化聚合物及渗透压保护剂，其中所述渗透压保护剂包括甘氨酸和甜菜碱(任选为盐的形式，如盐酸甜菜碱)的组合。
23.有利的是，本文所定义的组合物用于眼科用途。当应用于眼睛表面时，所述组合物可以恢复眼表系统的稳态和完整性，从而改善症状和视觉功能。组合物中各组分的组合决定了对眼睛外部结构的协同再上皮化、抗氧化和保护作用。
24.根据一些实施例，本发明的组合物可以包括任选的缓冲剂、等渗剂和防腐剂，如下文详细所述。
25.本文所述的眼用组合物具有令人惊讶的在眼表水平上发挥作用的能力，因此允许以高疗效和较宽的安全范围进行靶向局部治疗，以预防或治疗眼部疾病，特别是干眼症。所述组合物可与其他眼用产品组合用于治疗眼部疾病。
附图说明
26.图1a-c示出了在三种不同温度条件下开展的实施例2稳定性研究结果的三个图。图a)示出了组合物ph随时间的变化；图b)示出了组合物渗透压随时间的变化；图c)示出了组合物粘度随时间的变化；
27.图2示出了两种聚合物(透明质酸钠(naha)和黄原胶(xnt)与其组合(制剂)的流变曲线比较图；
28.图3a-c示出了三个条形图，分别示出了在采用500mosm nacl进行高渗应激并采用0.1％甘氨酸(gly)、0.07％脯氨酸(pro)、0.25％甜菜碱(bet)、0.1％gly+0.25％bet混合物和0.1％gly+0.07％pro混合物处理4h的sirc细胞中a)cox2、b)tnfa和c)ilb的基因表达水平；
29.图4示出了一个条形图，说明了0.2％黄原胶(0.2％xnt)、0.2％透明质酸钠(0.2％ha)和0.2％黄原胶+0.2％透明质酸盐混合物(0.2％xnt+0.2％ha)对hce细胞的划痕试验结果；
30.图5示出了一个条形图，说明了0.2％黄原胶(0.2％xnt)、0.2％黄原胶+0.2％透明质酸钠混合物(0.2％xnt+0.2％ha)及其与本发明的渗透压保护剂0.1％甘氨酸和0.25％甜菜碱(xnt+ha+gly+bet)的组合对hce细胞的抗氧化作用；
31.图6的条形图示出了采用0.2％黄原胶(xnt)、0.2％透明质酸钠(ha)和0.2％xnt+
0.2％ha混合物预处理2小时并用il1b诱导18小时后a549细胞中的cox2基因表达水平。
32.图7示意性地说明了黄原胶和透明质酸的聚合物链之间产生的三维网格相互作用。
33.图8示出了经受划痕试验模型的hce细胞的3d多层照片显微复制图，以检测本发明的四组分组合物相对于其单个组分或其两个或三个组分组合的再上皮化活性，如实施例8中所述。
34.图9的条形图示出了葡萄糖氧化酶(gox)诱导氧化应激后乳酸脱氢酶(ldh)实验得到的细胞活力测试结果。这些数据表明了0.1％甘氨酸、0.007％脯氨酸、0.25％甜菜碱这些组分单用与联用例如(gly+bet)和(gly+pro)的抗氧化作用对比。该图中所示的数据也将作为实施例7的前体，与hce细胞上的抗氧化活性关联。
35.图10示出了与实施例2的组合物f1(含4％甘露醇)和本领域已知的组合物e1在60℃下的对比应激测试结果，如实施例10所述。
具体实施方式
36.本文描述了一种组合物，其包含聚合物透明质酸或其药学上可接受的盐和黄原胶与特定渗透压保护剂甘氨酸和甜菜碱组合。本发明的组合物适用于眼科领域，特别是治疗干眼症。
37.具体地，据观察，这两种聚合物组分与所选氨基酸渗透压保护剂甘氨酸和甜菜碱的组合导致眼睛外部结构损伤的再上皮化和愈合速度惊人地增加。具体地，作者观察到在组合物中，甘氨酸(gly)和甜菜碱(bet)这两种组分的组合是如何在眼睛中产生意想不到的渗透压保护作用的。图3突出显示了在根据实施例4的实验性干眼模型中实验发现的这种技术效果。
38.本发明的组合物对眼表具有保湿性和润滑性，并具有再上皮化和抗氧化作用。此外，当滴入眼内时，恢复了泪膜的生理渗透压，特别是对于患有干眼症的受试者中。
39.有利的是，本发明的组合物包含两种生理学上可接受的聚合物：线性聚合物(如任选透明质酸盐)和支化聚合物(如黄原胶)。
40.本发明的目的是如权利要求1所限定的眼用组合物。
41.所述组合物的其他实施方式在所附从属权利要求2-9中限定。
42.优选地，本发明的组合物不含硼酸和/或硼酸钠水合物，也称为硼砂。这些组分中的一种或两种组分的存在通常不能适用于本文所述的眼科用途，因为其在眼科用途的耐受性较差。
43.组合物
44.该组合物的聚合物组分是透明质酸，这是一种含有通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接的d-葡萄糖醛酸(glcua)和n-乙酰基-d-葡萄糖胺(glcnac)交替单元的糖胺聚糖。
45.透明质酸具有生物相容性，因为它天然存在于各种人体组织中，如脐带、玻璃体和软结缔组织的细胞外基质中。透明质酸的物理化学特性部分取决于其分子量以及与眼睛表面上大多数细胞中存在的cd44受体的相互作用。它的一个主要特点是吸湿能力，这使它可以保持高达其重量1000倍含量的水。它还具有粘弹流变特性，使它能够通过减少眨眼和眼球运动时的摩擦来提供缓解。
46.透明质酸可以是本身的形式或盐的形式，例如透明质酸钠。
47.根据一些实施例，所述组合物含有0.01至5重量/体积％、0.05至0.5重量/体积％、0.1至0.3重量/体积％(g/100ml)的透明质酸或其生理上可接受的盐。
48.该组合物的另一种聚合物组分是黄原胶，这是一种阴离子支化多糖，由天然需氧发酵产生，通常由玉米淀粉与细菌，如野油菜黄单胞菌产生。
49.例如，合适的黄原胶的平均分子量介于3至7.5mda。
50.通常，它是基于由摩尔比为2:2:1的d-葡萄糖、d-甘露糖和d-葡萄糖醛酸表示的重复单元及由o-乙酰基和丙酮酸残基表示的可变组分的支化多糖。
51.它是一种高度亲水的粘性聚合物，能够以可逆的方式结合大量的水。它能够通过形成非共价键粘附到角膜上皮的粘蛋白层。它具有润滑性和抗氧化性，并作为再上皮化剂支架。它的假塑性(非牛顿行为)有助于维持较高的初始粘度，并在眼睑运动期间逐渐降低粘度，从而最大限度地降低眼睑和眼表之间的摩擦，提高患者的舒适度。
52.根据一些实施例，透明质酸是线性聚合物，并且有利地可以具有介于0.2mda至2.5mda，优选0.5至2.0mda的平均分子量。
53.透明质酸的分子量以平均分子量(mw)(da)表示。例如，透明质酸和本说明书中可能提到的聚合物的平均分子量可以采用本领域的标准方法测定，例如通过ueno et al.,1988,chem pharm bull.36,4971-4975；wyatt 1993,anal chim acta 272:1-40；watt technologies 1999"light scattering university dawn course manual and“dawn eos manual"wyatt technology corp.santa barbara ca(usa)中所述的那些方法测定。
54.根据一些实施例，透明质酸是其碱金属或碱土金属盐的形式，两者都是药学上可接受的，例如透明质酸钠、钾、镁或钙等。
55.根据一些实施例，所述组合物含有介于0.01至5重量/体积％、0.05至0.5重量/体积％、0.1至0.3重量/体积％(g/100ml)的黄原胶或其衍生物。
56.已经观察到，线性聚合物透明质酸和支化聚合物黄原胶之间的组合产生了化学-物理相互作用，即形成了表明两种聚合物之间物理互连的特殊缠结。这种相互作用在生产过程中的灭菌阶段为透明质酸提供了物理保护。
57.如图7所示，三维网格的形成也为该制剂提供了特定性质，例如：眼再上皮化过程中的支架作用；与两种聚合物的物理相互作用相关的两种聚合物流变行为的协同作用；因脂质自身在其上可重组的基质的存在导致泪膜脂质层的眼部分布得到改善。
58.此外，根据本发明的一个方面，所述组合物可以在所述三维网格的网状中包含或结合药理学活性成分，并在滴注或局部施用后将其传递到眼睛表面。
59.根据该方面，该组合物是药理学活性成分的载体，如下文所述。
60.本发明的组合物包括渗透压保护剂，通常是通过抵消高渗应激的损害而起作用的天然有机分子、相容溶质或有机渗透剂。眼表细胞能够吸收这些相容溶质，从而有助于恢复细胞体积、稳定蛋白质功能和恢复细胞过程的功能。
61.有利的是，组合物的渗透压保护剂组合将泪液渗透压调节到生理值内。这种作用在存在(例如，由于泪液中电解质浓度增加而导致的)泪液高渗的眼睛疾病中特别有用。
62.在一些实施例中，该组合物包含属于以下类别之一的一种或多种渗透压保护剂：氨基酸，优选甜菜碱、牛磺酸、甘氨酸、脯氨酸、l-肉碱；多元醇，例如甘油、赤藓醇、木糖醇、
单肌醇；糖类，例如海藻糖。
63.优选地，该组合物包含渗透压保护剂甘氨酸和甜菜碱。
64.甘氨酸属于蛋白质必需氨基酸类别，能够在上皮重塑和胶原生物合成过程中提供基本作用。
65.术语甜菜碱是指具有带正电荷阳离子官能团的中性化合物，例如季铵nh4+，其中一个或多个氢原子可以是一般官能团，或磷阳离子pr1r2r3r4+，其中r1、r2、r3和r4是氢原子或仍然是一般官能团，其不直接与氢结合，而是与带负电荷的官能团结合，例如不在阳离子位点附近的羧酸盐阴离子、氯化物、氢氧化物或酒石酸盐。
66.优选甜菜碱是n,n,n-三甲基甘氨酸或甘氨酸甜菜碱。
67.根据一些实施例，该组合物还包括至少一种等渗剂。术语等渗剂是指调节眼用液体张力的化合物或物质。
68.实例包括碱金属盐，例如氯化钠、氯化钾或甘露醇、甘油、丙二醇、葡萄糖、乙二醇。等渗剂的用量可根据具体作用而变化。根据一些实施例，渗透剂将组合物的渗透压保持在≤250mosmol/kg。
69.具有这种低张力的眼用组合物在统计学上改善了干眼症患者的症状和眼表状况。
70.该组合物可进一步包括缓冲剂或缓冲系统，即任何适合于维持所需ph范围的弱共轭酸碱对。合适的缓冲剂包括但不限于乙酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂，或它们的组合，例如柠檬酸盐/磷酸盐，或氨丁三醇、组氨酸或精氨酸缓冲剂。
71.例如，本发明的组合物可包含含磷酸氢钠(尤其是一水合物)、磷酸二钠(尤其是十二水合物)的缓冲剂或缓冲系统。
72.另一种合适的缓冲剂包括柠檬酸钠。
73.可以根据需要使用酸或碱来调节这些制剂的ph值，所用缓冲剂的用量可以变化。
74.根据本发明的一个优选实施例，缓冲剂是氨丁三醇，制剂的ph值在4.0至9.0的范围内，优选6.6至7.8，特别是6.8至7.6。
75.所述缓冲剂的浓度可以在10至50mm的范围内，并且其缓冲溶液的ph可以通过添加氢氧化钠或其他碱增加，或者通过添加盐酸或其他酸降低。
76.在一些实施例中，本发明的组合物不含防腐剂。
77.根据一些实施例，该组合物包含至少一种选自氯化镁、氯化钙及它们的混合物的等渗剂。在一些实施例中，等渗剂包括氯化镁和氯化钙。优选地，氯化镁是六水合氯化镁，氯化钙是二水合物。
78.根据一些实施例，本发明的组合物包含另一种基于甘油的等渗剂。
79.通过添加本文所述的缓冲剂和等渗剂，优选地将本发明组合物的ph值调节到4.0至9.0范围内，优选6.8至7.6。
80.有利的是，本发明的组合物是无菌的，优选低渗的眼用组合物。
81.优选地，该组合物相对于泪液是低渗的，渗透压在200至270mosm/kg范围内。
82.优选地，本发明的组合物为液体形式，例如水溶液，或半液体形式，例如凝胶。有利的是，该组合物是滴到眼睛内的滴眼液或施用到眼睛上的眼用凝胶。
83.优选地，本发明的组合物不含防腐剂和/或抗微生物剂，或者在任何情况下，它们的含量是低于0.001％(w/v)的微量含量。
84.以多剂量配制的本发明组合物还可包含抗微生物防腐剂，例如，对羟基苯甲酸酯、季铵盐、聚六亚甲基双胍(phmb)和其他可能包括在眼用组合物中的防腐剂。
85.在液体形式的组合物中使用的溶剂优选是水或者一种或多种局部眼用相容组分的水溶液。
86.通常，该组合物可进一步包含天然和合成来源的乳化剂、稳定剂、增溶剂、抗氧化剂及其混合物。
87.医学用途
88.根据另一方面，提供如权利要求1或任何从属权利要求中所限定的组合物用作药物的用途。
89.该组合物的医学用途可用于预防和/或治疗眼部疾病。
90.因此，本发明的另一个目的是本文所述眼用组合物用于治疗炎性眼病、眼表损伤或擦伤、泪膜高渗性的用途。在一个方面，本文所述的眼用组合物用于治疗眼表疾病或炎症状态。
91.根据一个方面，提供本文所述的眼用组合物治疗干眼症的用途。
92.有利的是，本发明的组合物可以在眼睛中递送药理学活性成分，以预防和/或治疗眼部疾病。
93.根据一些实施例，该组合物因此含有药理学活性成分，优选选自抗组胺药、抗生素、抗青光眼药物，例如β受体阻滞剂、前列腺素抑制剂、碳酸酐酶抑制剂、α肾上腺素激动剂、甾体和非甾体抗炎药、抗过敏药、抗病毒药物、防腐剂、麻醉剂、散瞳剂、具有抗炎和/或抗氧化活性的脂质分子、细菌发酵产物(例如生物前、生物后产物)、免疫调节剂、激素、维生素、动物分泌蛋白如乳铁蛋白、初乳及它们的混合物。
94.根据另一方面，提供如上所述的组合物，其包含药理学活性成分，选自抗组胺药、抗生素、抗青光眼药物、甾体和非甾体抗炎药、抗过敏药、抗病毒药物、防腐剂、麻醉剂、散瞳剂、具有抗炎和/或抗氧化活性的脂质分子、细菌发酵产物(例如生物前、生物后产物)、免疫调节剂、激素、维生素、动物分泌蛋白如乳铁蛋白、初乳及它们的混合物，在治疗眼睛感染或疾病中的用途。根据后一方面，本发明的组合物可用于局部治疗过敏综合征、细菌或病毒来源的感染性和炎性角膜结膜疾病，如结膜炎、眼睑炎和角膜炎、青光眼、具有轻度中度至重度症状的干眼症，以及眼科手术中的预防。
95.根据一些实施例，本文所述的眼用组合物含有溴芬酸作为活性成分。根据该实施例，该眼用组合物用于治疗眼表(特别是外部解剖结构，例如结膜和角膜)以及眼睛后部的炎性疾病。
96.本文所述的组合物可以是单剂量或多剂量药物的形式。
97.为了进行给药，上述组合物可制成滴眼液或液体或凝胶形式。
98.以下实施例进一步说明本发明而不构成对本发明的限制。
99.实施例1
100.眼部施用或滴注组合物，具有以下配方：
101.[0102][0103]
实施例2
[0104]
眼部施用或滴注组合物，具有以下配方：
[0105][0106]
实施例3
[0107]
根据ich q1a(r2)稳定性测试指南：新药物质与产品的稳定性测试中所报告的条件，对实施例1的组合物开展稳定性研究，以评估化学物理和微生物特性。
[0108]
图1示出了长期储存条件(25℃
±
2℃，60％rh
±
5％)、中期储存条件(30℃
±
2℃，65％rh
±
5％)和加速储存条件(40℃
±
2℃，75％rh
±
％)下所开展研究的相关数据。
[0109]
实验数据表明，在所有研究条件(包括加速储存条件)下，所测试制剂的化学物理性质都具有很高的稳定性，可预测在加速储存条件下具有24个月长期的稳定性。
[0110]
实施例4
[0111]
开展测试以评估实施例1组合物中所含的两种聚合物，即透明质酸和黄原胶的流变行为。
[0112]
在低剪切应力值下(模拟实施例1组合物在眼睛中的滴注时间)和在高剪切应力下(模拟眼睑眨眼现象)评估流变特性。
[0113]
这些数据表明，与透明质酸和黄原胶聚合物单独使用相比，两种聚合物联用具有更高的粘度值。这种行为在附图2所示的图中突出显示。
[0114]
低剪切速率下的高粘度值表明在眼表的停留时间更长，而高剪切速率下粘度更低表明患者的依从性更好。
[0115]
在剪切应力值γ＝150秒-1
时，单独的透明质酸钠(ha)和黄原胶(xnt)溶液的粘度分别为3.4和12mpas。含有两种聚合物组合的溶液的粘度是20mpas，比简单组合的预期粘度高77％。这些数据突出并支持两种聚合物组合的协同效应。
[0116]
实施例5
[0117]
体外干眼模型的渗透压保护作用
[0118]
开展测试以评估渗透压保护剂甘氨酸、脯氨酸和甜菜碱单独使用或其中两种的混合物(甘氨酸+甜菜碱；甘氨酸+脯氨酸)的潜在保护作用。
[0119]
在体外干眼模型中，采用nacl(500mosm)诱导兔角膜上皮细胞(sirc)高渗应激。通过分析促炎基因(例如环氧化酶2(cox2)、肿瘤坏死因子a(tnfa)和白细胞介素1b(ilb)的表达对保护作用进行评估。
[0120]
如附图3b所示，虽然脯氨酸对tnfa没有达到统计学意义，但实时rt-pcr数据表明，相对于ctrl+(nacl 500mosm)，采用0.1％甘氨酸(gly)和0.07％脯氨酸(pro)处理减少了tnfa信使(图3b)和il1b(图3c)的表达。
[0121]
相对于ctrl+，0.1％gly+0.07％pro的混合物能够使这两种促炎基因(tnfa，
##
p≤0.001％；il1b，
####
p≤0.0001％)减少，即使该效应似乎归因于甘氨酸的单独作用，而不是两种氨基酸的协同作用(图3b和3c)。
[0122]
相对于ctrl+，采用0.25％甜菜碱(bet)处理显示，分析的所有三种促炎基因的表达均有效降低了约70％(图3a-c)。
[0123]
与0.1％gly+0.07％pro的混合物不同，观察采用0.1％gly+0.25％bet的组合(本发明组合物中包含的聚合物组合)处理sirc如何显著降低cox2、tnfa和il1b相对于ctrl+的表达水平，与使用单一渗透压保护剂的处理相比，具有更高的疗效，因此表明了甘氨酸和甜菜碱组合的协同作用(图3a-c)。
[0124]
这些结果表明，包含在本发明组合物中的渗透压保护剂甘氨酸和甜菜碱的组合具有高渗保护作用，在降低参与高渗应激条件下引发的炎症过程的基因表达方面显示出协同作用。
[0125]
这些数据总结在图3中，图中示出了在采用500mosm nacl进行高渗应激并采用0.1％gly、0.07％pro、0.25％bet、0.1％gly+0.25％bet或0.1％gly+0.07％pro处理4h后sirc细胞中a)cox2、b)tnfa和c)ilb的基因表达水平。这些数据表明了每个条件下n＝3次重复的相对于校准品(ctrl-，300mosm)的差异倍数的平均值
±
sem。
[0126]
#
p≤0.05；
##
p≤0.01；
###
p≤0.001；
####
p≤0.0001vs.ctrl+(500mosm)；
***
p≤0.001；
****
p≤0.0001vs.ctrl-。单因素方差分析之后进行sidak事后检验。
[0127]
实施例6
[0128]
单层人角膜上皮(hce)细胞的再上皮化活性
[0129]
开展了一项试验，通过划痕试验评估0.2％黄原胶(0.2％xnt)和0.2％透明质酸(0.2％ha)聚合物单独和组合(0.2％xnt+0.2％ha)使用对人角膜上皮(hce)细胞的再上皮化活性。
[0130]
划痕面积的分析表明，在t24h，单独使用0.2％的xnt和0.2％的ha时，相对于基础
条件(基础)而言，不能以统计学上显著的方式减少划痕面积。
[0131]
相反，与基础相比，0.2％xnt+0.2％ha的组合t24h时显著减少了划痕面积，表明具有协同效应(**p≤0.01vs.基础，图4)。此外，统计分析表明，0.2％xnt和0.2％ha单用与0.2％xnt+0.2％ha联用存在统计学差异(
#
p≤0.01vs.0.2％xnt+0.2％ha，图4)，进一步支持了这两种聚合物的协同效应。
[0132]
试验数据总结在图4中，表明了在0.2％xnt、0.2％ha和0.2％xnt+0.2％ha联用的情况下，hce细胞上从t0到t24h的划痕面积闭合趋势。**p≤0.01vs.基础。
#
p≤0.05vs.0.2％xnt+0.2％ha。使用单因素anova检验和sidak事后检验进行统计分析。
[0133]
实施例7
[0134]
hce细胞的抗氧化活性
[0135]
开展测试以验证0.2％黄原胶(xnt 0.2％)、0.2％黄原胶+0.2％透明质酸(0.2％xnt+0.2％ha)及其与渗透压保护剂0.1％甘氨酸和0.25％甜菜碱(xnt+ha+gly+bet)联用对hce细胞的抗氧化作用。
[0136]
采用葡萄糖氧化酶(gox)诱导氧化应激，采用乳酸脱氢酶(ldh)实验测定以细胞活力而言的抗氧化作用。
[0137]
从细胞活力百分数降低的分析中，可以观察到，0.2％xnt单独使用导致细胞活力增加，然而，相对于ctrl-，并没有达到统计学意义(74％活力，图5)。相反，相对于ctrl-，0.2％xnt+0.2％ha联用以统计学上显著的方式增加了细胞的活力(88％活力，*p≤0.05，图5)。此外，值得注意的是，在xnt+ha+gly+bet混合物中两种聚合物与渗透压保护剂组合时，这种效果变得更加明显。
[0138]
事实上，xnt+ha+gly+bet联用相对于ctrl-(
**
p≤0.01)和0.2％xnt(
#
≤0.05，图5)，以统计学上显著的方式增加了细胞活力(123％活力)。
[0139]
所获得的结果突出了两种聚合物(0.2％黄原胶和0.2％ha)联用时的抗氧化效果。此外，值得注意的是，当这两种聚合物与渗透压保护剂0.1％甘氨酸和0.25％甜菜碱联用时，这种效应甚至更明显，显示出这些组分的惊人且有利的协同效应。在葡萄糖氧化酶(gox)诱导氧化应激后，使用乳酸脱氢酶(ldh)实验，对渗透压保护剂单用和这些渗透压保护剂联用的进行了细胞活力测试，如图9所示。
[0140]
渗透压保护剂0.25％甜菜碱和0.1％甘氨酸本身单用显示出显著的抗氧化作用(图9)：ldh测定突出显示了这种作用，其中用gox处理后测得的细胞活力，甘氨酸为65％，甜菜碱为98％。与各组分单用及(gly+pro)联用相比，这两种渗透压保护剂(gly+bet)联用显示出更高的抗氧化作用(108％，
***
p≤0.001vs基础，图9)。这些数据证实了它们联用的协同作用，这为与所述配方内的聚合物联用提供了不可忽略的同时有利的贡献(见图5)。
[0141]
实施例8
[0142]
对人肺腺癌细胞(a549)的抗炎活性
[0143]
为了评估0.2％xnt和0.2％ha聚合物作为单一活性成分和作为混合物的潜在抗炎作用，使用体外试验系统“il-1β诱导的cox-2表达/活性”在a549细胞上开展试验。
[0144]
在测试的两种聚合物中，相对于ctrl+il1b，只有采用0.2％xnt处理时能够显著降低cox2的表达(##p≤0.01％)(图6)。
[0145]
此外，据观察，相对于ctrl+il1b，采用0.2％xnt+0.2％ha组合处理a549能够显著
降低(
##
p≤0.01％)所分析的促炎基因的表达。
[0146]
数据总结在图6中，图中表明了采用0.2％xnt、0.2％ha或0.2％xnt+0.2％ha预处理2小时，并用il1b诱导18小时后a549细胞中的cox2基因表达水平。这些数据表明了每个条件下n＝3次重复的相对于校准品(ctrl-)的差异倍数的平均值
±
sem。
[0147]
##p≤0.01vs.ctrl+il1b；****p≤0.0001vs.ctrl-。单因素方差分析之后是sidak事后检验。
[0148]
实施例9
[0149]
多层hce细胞再上皮化活性的比较试验。
[0150]
在三维多层hce细胞上进行体外上皮化比较研究，对所述三维多层hce细胞使用划痕试验模型，以发现从组合物各组分组合中获得的活性类型：透明质酸(特别是钠盐)、黄原胶、甘氨酸和甜菜碱，特别是盐酸甜菜碱。
[0151]
比较了以下组分/成分的活性：
[0152]-透明质酸(ha)和海藻糖混合物
[0153]-透明质酸(ha)
[0154]-黄原胶
[0155]-透明质酸和黄原胶(xnt)
[0156]-甘氨酸和甜菜碱
[0157]-透明质酸钠盐、黄原胶、甘氨酸和盐酸甜菜碱。
[0158]
为了监测伤口诱导24和48小时后角膜再上皮化过程的不同阶段(迁移和重塑阶段)，开展了以下研究：
[0159]-苏木精/伊红(h&e)组织学分析；
[0160]-整合素β1(itgβ1)的免疫组化分析；
[0161]-金属蛋白酶9(mmp9)。
[0162]
这些是在再上皮化过程中参与迁移阶段调节和细胞外基质(ecm)重塑的元素和过程。
[0163]
分别在24小时和48小时的比较试验结果总结在以下比较表中：
[0164][0165]
从上述结果可以看出，根据本发明含有透明质酸钠盐、黄原胶、甘氨酸和盐酸甜菜碱的制剂表现出最佳结果，促进了从迁移阶段开始的再上皮化过程，并允许早在24小时时伤口闭合和ecm有效重塑。已经观察到，本发明组合物的再上皮化效果令人惊讶地比其他测试组分的效果快很多。
[0166]
从附图8所示的照片复制图中可以立即看出很明显的结果。
[0167]
比较试验得出以下结论：
[0168]-0.2％黄原胶：在48小时，有利于迁移阶段的有效调节，
[0169]-0.2％透明质酸：在48小时，促进了组织重塑，
[0170]-0.2％透明质酸+0.2％黄原胶：在24小时，协同效应有利于早期细胞增殖，
[0171]-0.1％甘氨酸+0.25％甜菜碱：在24小时，双组分混合物在促进迁移阶段和预测组织重塑方面显示出早期效果，
[0172]-本发明的4组分组合物：通过促进从迁移阶段开始的再上皮化过程，有利于伤口闭合和细胞外基质(ecm)的有效重塑，表现出最佳结果。
[0173]
实施例10
[0174]
60℃下4周的应激试验稳定性研究。
[0175]
在60℃的温度条件下对实施例2的组合物开展应激测试研究，以评估制剂的性能和化学物理特性。实验数据表明了所测试制剂的化学物理性质的高稳定性。
[0176]
特别是，测试了具有实施例2配方和4％甘露醇的组合物f1。
[0177]
对本发明的该组合物在60℃的温度条件下开展了对比应激试验研究，并与目前市场上具有不同组合物的制剂进行了比较，如下表1所示(图10-e1)。
[0178]
表1.组合物配方e1
[0179][0180]
特别是，在60℃下4周时，这两种制剂在整个研究期间均显示出恒定的ph值趋势，但稳定性研究期间所测试的制剂中溴芬酸含量的测定百分数(测定％)突显了，制剂f1的稳定性与制剂e1相比更高，分别为92％和87％。
[0181]
本技术制剂的组合物出乎意外地导致了所考虑的化学物理参数更好的稳定性结果，特别是活性溴芬酸测定的回收率，如附图10所示。