稳定NK细胞与抗体的结合的方法及其应用与流程

稳定nk细胞与抗体的结合的方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及稳定nk细胞与抗体的结合的方法。本发明在使用nk细胞的癌症的免疫疗法、为此的再生医疗等产品的制造等领域中是有用的。


背景技术：

2.抗体药物被设计成通过特异性地结合于在细胞表面表达特定抗原的肿瘤细胞，发挥抗体依赖性细胞毒性(adcc)活性而显示抗肿瘤效果。但是，已知只要表达成为对象的抗原，也会与正常细胞结合，同样地发挥毒性活性(非肿瘤靶向毒性效应)。也就是说，抗体药物本身无法判断细胞是不是肿瘤。而且，该现象如果是在白细胞存在下，即使在补体不存在下也能得到确认，因此示出免疫细胞如果与抗体结合，则通过adcc活性也可以杀伤正常细胞。例如，已知通过施用以b细胞表达的cd20作为靶向的利妥昔单抗(rituxan)，作为副作用，正常b细胞被杀伤。目前为止，尚不知回避该非肿瘤靶向毒性效应的方法，成为了作为最新的免疫细胞治疗的car-t细胞所面临的最大课题之一。经多方面确认，杀伤与抗体结合的正常细胞主要是巨噬细胞系的细胞(非专利文献1)。
3.另一方面，自然杀伤细胞(nk细胞)是作为自然免疫的主要因子发挥作用的细胞毒性淋巴细胞，在肿瘤细胞或病毒感染细胞的排斥中重要。向患者施用在体外扩增并活化的nk细胞的基于nk细胞的癌症免疫疗法作为副作用较少的治疗方法受到关注。本发明人等开发了具有高细胞毒性活性的nk样细胞的新细胞，并且得到了使抗体药物在体外与这样的细胞结合后向患者施用的独特想法(专利文献1)。
4.另一方面，提出了可与nk细胞的表面蛋白结合的多特异性结合蛋白。例如，专利文献2中提出了一种嵌合融合分子，其用于使nk细胞引导至抗原细胞，具有肿瘤抗原结合结构域和免疫细胞结合结构域，抗原结合结构域包含该抗原结合结构域的分离抗体或片段，分离抗体包含免疫球蛋白可变区及恒定区，免疫细胞结合是对nk细胞受体特异性的配体。另外，专利文献3中提出了将nkp46结合免疫球蛋白区和包含该可变区的蛋白质，例如抗体和多特异性蛋白质用于特异性地重定向nk细胞以溶解目标靶细胞的方案。进一步地，在专利文献4中，提出了使nkg2d受体和与cd16结合的多特异性结合蛋白结合于nk细胞而活化nk细胞的方案，多特异性结合蛋白可以包含与人igg1抗体的氨基酸234～332至少90％同一性的氨基酸序列。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特开2018-193303号公报
8.专利文献2：日本特表2009-500346号公报
9.专利文献3：国际公开2017/114694(日本特表2019-503713号公报)
10.专利文献4：日本特表2020-506971号公报
11.非专利文献
12.非专利文献1：uchida j，et al.j exp med.2004，sugata k，et al，sci rep.2016


技术实现要素：

13.发明要解决的课题
14.巨噬细胞系的细胞无法区分肿瘤细胞和正常细胞，而nk细胞可以鉴别肿瘤细胞和正常细胞。因此，如果能够产生nk细胞为抗体药物的adcc活性的唯一效应器的状况，则理论上可以完全消除非肿瘤靶向毒性(on-target off-tumor)效应。
15.为了产生nk细胞为adcc活性的唯一效应器的状况，排除全身巨噬细胞系细胞是不现实的，鉴于此，期望避免通过点滴等全身性地施用抗体药物自身，将抗体药物结合到nk细胞的状态下施用。
16.然而，根据本发明人等的研究，可知即使将目标抗体药物结合到nk细胞，在特定成分的共存或其他抗体竞争的状态下，目标抗体药物也会从nk细胞脱离。因此，需要能够将抗体稳定地固定在nk细胞上的技术。
17.用于解决课题的手段
18.这次，本发明人等制备了由能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i和能够与抗体结合的区域ii、以及连接区域i和区域ii的接头部分组成的融合蛋白，发现通过其能够稳定地维持nk细胞与抗体的结合，从而完成了本发明。
19.本发明提供以下内容。
20.[1]一种稳定nk细胞与抗体的结合的方法，其使用具有以下区域的物质：
[0021]
能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i；及
[0022]
能够与抗体结合的区域ii。
[0023]
[2]根据1所述的方法，其中，nk细胞的表面蛋白为选自由nkp46、nkp30、nkg2d、il-15r、il-2r、kir3ds1、nkg2c、nkp80、nkp65、nkp44、lalra1、lilra2、dnam-1及2b4组成的组中的任一种。
[0024]
[3]根据1或2所述的方法，其中，区域i和区域ii的至少一者为单链fv片段(scfv)。
[0025]
[4]根据1～3中任一项所述的方法，其中，抗体为用于处理癌症或传染病的抗体药物。
[0026]
[5]一种nk细胞群体的制备方法，其包括以下工序：
[0027]
(1)准备nk细胞群体、抗体、及具有能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i和能够与抗体结合的区域ii的物质；
[0028]
(2)在蛋白质存在下，向nk细胞群体中加入抗体，得到与抗体结合的nk细胞群体；此时，nk细胞与物质的区域i结合，并且抗体与物质的区域ii结合，物质稳定nk细胞与抗体的结合。
[0029]
[6]根据5所述的制备方法，其中，抗体为用于处理癌症或传染病的抗体药物。
[0030]
[7]一种药物组合物，其包含与抗体药物结合的nk细胞群体，通过具有以下区域的物质，抗体药物与nk细胞的结合稳定：
[0031]
能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i；及
[0032]
能够与抗体结合的区域ii。
[0033]
发明效果
[0034]
根据本发明，由于抗体药物专门利用于nk细胞，因此可以期待抑制由巨噬细胞系免疫细胞引起的杀伤与抗体药物结合的正常细胞这样的副作用。
[0035]
现有的提高抗体的结合活性的方法，是利用抗体的fc区域的糖链结构的改变(低岩藻糖抗体)或氨基酸序列的改变等，但本发明是通过与这些完全不同的方法来使抗体稳定结合在nk细胞上的。根据本发明将抗体锚定到nk细胞上时，作为锚定的nk细胞的表面蛋白，可以选择具有对nk细胞的活化和生存优选的信号的分子。
[0036]
附图简单说明
[0037]
[图1]联合使用抗体药物时nk细胞对allo-wbc的杀伤。
[0038]
[图2]在培养基中nk细胞对抗体药物的保留。
[0039]
[图3]培养基添加物对nk细胞与抗体药物的结合的影响。
[0040]
[图4]血液成分对nk细胞与抗体药物的结合的影响。
[0041]
[图5]竞争igg对nk细胞与抗体药物的结合的影响。
[0042]
[图6]实施例中使用的序列。小写字母部分为nkp46 sfv，框内部分为蛋白质g(protein g)，下划线部分为接头。在碱基序列中，位置(1)..(57)为30k信号肽编码区(signal peptide-coding region)，(58)..(222)和(298)..(432)为蛋白质g编码区(protein g-coding region)，(433)..(477)为(g4s)3接头编码区(linker-coding region)，(478)..(1212)为scfv(nkp46)编码区，(1213)..(1233)为tev蛋白酶编码区(protease-coding region)，(1234)..(1251)和(1276)..(1293)为his标签编码区(tag-coding region)，(1252)..(1275)为strep标签编码区(strep tag ii-coding region)。
[0043]
[图7]利用原型物质的抗体药物的锚定。(1)：高活性nk细胞+pbs，(2)：向高活性nk细胞中加入原型物质350μg/ml，在室温下反应1小时后，加入赫赛汀(herceptin)1μg/ml，在室温下反应1小时，(3)：向赫赛汀1μg/ml中加入原型物质350μg/ml，在室温下反应1小时后，加入高活性nk细胞，在室温下反应1小时。
[0044]
[图8]通过锚定稳定细胞与抗体的结合。在原型物质的存在或不存在下，将高活性nk细胞同样地悬浊在包含各种抗体药物的pbs中，之后用pbs清洗1次，进行抗体染色、测定，分析各抗体药物有无结合。可知无论使用何种抗体药物，通过利用原型物质的锚定，细胞与抗体的结合都稳定。
[0045]
发明的具体实施方式
[0046]
本发明涉及使用具有以下区域的物质的、稳定nk细胞与抗体的结合的方法。
[0047]
能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i；及
[0048]
能够与抗体结合的区域ii。
[0049]
[区域i、区域ii]
[0050]
(能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i)
[0051]
作为与本发明的物质的区域i结合的nk细胞的表面蛋白，只要不阻碍抗体与nk细胞上的cd16(fcγriii)的结合，就可以选择在nk细胞表面的各种蛋白质分子。作为这样的蛋白质的例子，可举出nkp46、nkp30、nkg2d、il-15r、il-2r、kir3ds1、nkg2c、nkp80、nkp65、nkp44、lalra1、lilra2、dnam-1及2b4。
[0052]
不阻碍抗体与nk细胞上的cd16(fcγriii)的结合是指例如当物质与该细胞表面蛋白和抗体结合时，物质的立体结构(例如高度)适当。
[0053]
在上述的nk细胞表面蛋白中，作为与本发明的物质的区域i结合的nk细胞的表面蛋白，优选为能够期待通过结合而具有对nk细胞的活化或生存优选的信号的蛋白质。作为
该例子，可举出nkp30、nkp46、nkg2d、il-15r。一个特别优选的例子为nkp46。nkp46在nk细胞所具有的活化型受体中也具有很多itam(免疫受体酪氨酸活化基序，immunoreceptor tyrosine-based activation motif)，被认为是极其重要的分子。另外，抗nkp46抗体作为发挥nk细胞活化作用的抗体而被市售。
[0054]
关于上述的nk细胞表面蛋白，已知分别结合的分子。
[0055]
nk细胞表面蛋白：结合分子(抗x抗体除外)
[0056]
nkp46：细胞表面波形蛋白(cell surface vimentin(csv))
[0057]
nkp30：b7-h6
[0058]
nkg2d：mica，micb，ulbp1～6
[0059]
il-15r：il-15，il-2
[0060]
il-2r：il-15，il-2
[0061]
kir3ds1：hla-f，hla-b
[0062]
nkg2c：hla-e
[0063]
nkp80：aicl
[0064]
nkp65：kacl
[0065]
nkp44：mll5，pcna
[0066]
lalra1：hla-b27二聚体(dimer)
[0067]
lilra2：可溶性(soluble)hla
[0068]
dnam-1：cd112，cd155
[0069]
因此，能够将本发明的物质的区域i设为选自由csv、b7-h6、mica、micb、ulbp1～6、il-15、il-2、il-15、il-2、hla-f、hla-b、hla-e、aicl、kacl、mll5、pcna、hla-b27二聚体、可溶性hla、cd112、cd155和cd48组成的组中的任一种。
[0070]
区域i还可以是能够与上述的nk细胞表面蛋白结合的抗体或抗体的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段包含单链fv片段(scfv)、二聚体scfv(di-scfv)、双体(diabody)、三体(triabody)、四体(tetrabody)、fab、f(ab’)2、fv。
[0071]
在一个特别优选的实施方式中，区域i是结合在nkp46的抗体的抗原结合域，是上述专利文献3中所记载的区域，更特定地，是该文献的序列表的序列号：119、120、121或122所示的序列，区域i优选是具有序列号：121所记载的氨基酸序列的多肽(在本说明书的序列表的序列号：2的氨基酸序列中，具有第141位以后的氨基酸序列)。
[0072]
区域i还可以是包含对于上述的nk细胞表面蛋白的结合分子，即csv、b7-h6、mica、micb、ulbp1～6、il-15、il-2、hla-f、hla-b、hla-e、aicl、kacl、mll5、pcna、hla-b27二聚体、可溶性hla、cd112、cd155和cd48中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域的肽。在本说明书的序列表中，将b7-h6中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：3，将mica中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：4，将micb中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：5，将il-15中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：6，将il-2中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：7，将hla-f中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：8，将hla-b中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：9，将hla-e中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：10，将cd112中的能够与nk细胞表面蛋白结合的区域记载为序列号：11，将cd155中的能够与nk细
methods，2002，vol.271，pp.77-88)、img4k6r肽(国际公开2013/027796、j biol chem，2009，vol.284，pp.9986-9993)、iga结合肽(国际公开2011/148952、j biol chem，2012，vol.287，pp.43126-43136)。关于igg的fc结合性配体，本领域技术人员可以参考materials 2016，9，994；doi：10.3390/ma9120994。
[0076]
区域ii还可以是抗体或抗体的抗原结合片段。抗体的抗原结合片段包含单链fv片段(scfv)、二聚体scfv(di-scfv)、双体(diabody)、三体(triabody)、四体(tetrabody)、fab、f(ab’)2、fv。
[0077]
区域ii可以是使用交联剂特异性地结合在igg的fc位点的区域。交联剂是用于通过共价键连接igg结合肽与igg fc的化学物质。本发明的交联剂如果是本领域技术人员则可以适当选择，可以设为至少具有2个能够与所需氨基酸(例如，赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸或二氨基丙酸和精氨酸等)结合的位点的化合物。作为其例子，没有限定，可举出dsg(disuccinimidyl glutarate)、dss(disuccinimidyl suberate)等优选包含2个以上琥珀酰亚胺基的交联剂、dma(dimethyl adipimidate dihydrochloride)、dmp(dimethyl pimelimidate dihydrochloride)及dms(dimethyl suberimidate dihydrochloride)等优选包含2个以上酰亚胺酸部分的交联剂、以及dtbp(dimethyl 3，3
′‑
dithiobispropionimidate dihydrochloride)和dsp(dithiobis(succinimidyl propionate))等具有ss键的交联剂。通过交联剂修饰的igg结合肽可以在短时间内并且几乎无副反应地添加到igg中。
[0078]
在此情况下，区域ii在其序列中具有能够与交联剂反应的氨基酸残基。这样的氨基酸残基的例子是赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基和谷氨酸残基等蛋白质构成氨基酸、以及二氨基丙酸和2-氨基辛二酸等非蛋白质构成氨基酸，优选是赖氨酸残基。区域ii优选在其序列中完全不具有或几乎不具有(例如，仅具有1个或2个)其他与能够与交联剂反应的氨基酸残基相同的残基。例如，能够与交联剂反应的氨基酸残基为赖氨酸残基时，本发明的肽优选在其序列中的并不是与交联剂反应的氨基酸残基的位置完全不具有或几乎不具有赖氨酸残基。
[0079]
这样的具有能够与交联剂反应的氨基酸残基的区域ii的肽的特别优选的例子，是具有在wo2016/186206的序列表中记载为序列号：1～17、36和37的序列的肽。分别作为序列号：13～29、30和31记载于本说明书的序列表中。同样地，也可以使用如下多肽，该多肽由与这些氨基酸序列中的任一种序列同一性高的序列、或者在这些氨基酸序列中一个或多个氨基酸发生取代、缺失、插入和/或添加的氨基酸序列组成，并且能够与nk细胞表面蛋白结合。
[0080]
这样的肽与igg的fc结构域结合。另外，与igg fc的特定区域，即人igg fc中的根据eu编号的lys248残基(相当于人iggch2的第18个残基)或lys246残基(相当于人iggch2的第16个残基)接近，优选与lys248接近。
[0081]
使用这样的交联剂的反应可以参照上述wo2016/186206。另外，这个实验方案的例子如下所示。
[0082]
[化学式1]
[0083][0084]
区域ii还可以是识别fc区域的适配体和低分子化合物。在能够识别fc区域的范围，适配体也可以是突变体。作为识别fc区域的适配体，可举出人igg适配体(国际公开第2007/004748、rna，2008，vol.14，pp.1154-1163)等。作为识别fc区域的低分子化合物，可举出甘露糖赤藓糖醇脂(j biomedical materials res.a，2003，vol.65，pp.379-385)、过渡金属离子(j appl polym sci，89，1567-1572，j chromatography b，2003，vol.795，pp.93-103)、芳香族胺(j chromatography b，2000，vol.740，pp.1-15)、磺胺甲嘧啶(j chromatography b，2003，vol.792，pp.177-185)等。
[0085]
本发明的物质可以具有连接区域i与区域ii的接头部。接头部只要满足以下则可以采用各种结构，即，区域i能够与nk细胞的表面蛋白结合，并且区域ii能够与抗体结合，并且不阻碍抗体与nk细胞上的cd16(fcγriii)的结合。
[0086]
接头例如是可动性接头，是2～31个氨基酸长度的肽接头。例如，接头序列为约16个氨基酸长度。作为优选的接头的例子，可举出序列(g4s)
×
3、或由sggggsggggsggggs(gs16)、sg(gs2)、sggggs(gs6)、sggggsggggsggggsggggsggggsggggs(gs31)中的任一种组成的肽。
[0087]
在一个优选的实施方式中，接头是刚性接头。例如，刚性接头包含序列(eaaak)n，其中n为1～3。在一个例子中，刚性接头包含(eaaak)n，其中n为1～10或约1～100。例如，n为至少1、或至少2、或至少3、或至少4、或至少5、或至少6、或至少7、或至少8、或至少9、或至少10。在一个例子中，n小于100。例如，n小于90、或小于约80、或小于约60、或小于约50、或小于约40、或小于约30、或小于约20、或小于约10。
[0088]
在一个优选的实施方式中，接头是可切割接头。例如，接头可以被蛋白酶或肽酶切割。
[0089]
(优选的方式)
[0090]
将本发明的物质为融合蛋白时的一个特别优选实施方式的氨基酸序列和编码其的多核苷酸序列示于图6和序列表中。
[0091]
(nk细胞)
[0092]
一般而言，nk细胞是不表达t细胞受体(tcr)、t细胞普遍标记物cd3和作为膜免疫球蛋白的b细胞受体的大型颗粒性淋巴细胞，通常在人中为cd16阳性且cd56阳性。对于是不
是nk细胞，如果是本领域技术人员则可以基于细胞表面标记物的表达模式等容易进行判断。nk细胞具有细胞毒性活性，该细胞毒性活性的有无或程度可以用已知的各种方法进行测定。
[0093]
关于本发明，nk细胞除了特别记载的情况以外，包括上述一般的nk细胞，nk细胞还包括外周血nk细胞、脐带血nk细胞、初代nk细胞、培养nk细胞、高活性nk细胞及以下的[1]、[2]、[3]和[4]的nk细胞或nk样细胞。
[0094]
[1]具有下述(1)和(2)特征的nk细胞：
[0095]
(1)为cd16阳性，cd56高表达性，且cd57阴性。
[0096]
(2)为nkg2c阳性，nkg2a阴性～低表达性，及cd94阳性。
[0097]
[1]的高活性nk细胞可以是cd16高表达性。另外，[1]的高活性nk细胞无论是不是cd16高表达性，都可以进一步具有下述特征。
[0098]
(3)将该nk细胞作为效应细胞(e)，将k562细胞作为靶细胞(t)，以混合比(e：t)1：1共培养时的细胞毒性活性为50％以上。
[0099]
[1]的高活性nk细胞也可以如下表示：
[0100]
以如下方式得到的、具有下述(1)和(3)特征的nk细胞：
[0101]
使用cd3珠(例如clinimacscd3，miltenyi biotec公司，目录号130-017-601)、ld柱(例如miltenyi biotec，目录号130-042-901)和分离缓冲液(例如，包含0.5％人ab型血清(经过了非激活处理)、2mmedta的pbs)，从来自健康人的外周血单核细胞除去cd3阳性细胞，将所得到的细胞群体在适当的培养基(例如，添加了5％人ab型血清(经过了非激活处理)的cos-008)中培养14天，从而得到nk细胞。
[0102]
(1)为cd16阳性，cd56高表达性，且cd57阴性。
[0103]
(3)将该nk细胞作为效应细胞(e)，将k562细胞作为靶细胞(t)，以混合比(e：t)1：1共培养时的细胞毒性活性为50％以上。
[0104]
[1]的高活性nk细胞的特征的详细、更具体的制备方法可以参照日本特开2018-193303。
[0105]
[2]下述的细胞：
[0106]
为ccr5阳性、ccr6阳性、cxcr3阳性且cd3阴性的细胞。
[0107]
[2]的细胞还可以是cd11c高表达性。
[0108]
[2]的细胞也可以如下表示：
[0109]
为ccr5阳性、ccr6阳性、cxcr3阳性、整合素(integrin)α1阳性、整合素α3阳性、整合素β3阴性且cd3阴性的细胞。或者，为ccr5阳性、ccr6阳性、cxcr3阳性、cd11a高表达性、cd11c高表达性且cd3阴性的细胞。其中，高表达性是通过与从外周血得到的、未进行实质培养的nk细胞群体的表达进行比较来判断的。
[0110]
根据本发明人等的研究，[2]的细胞对形成肿瘤块的固体癌显示出极高的细胞毒性活性。[2]的细胞的特征的详细、更具体的制备方法可以参照日本特开2019-170176。
[0111]
[3]可通过下述方法得到的高活性nk细胞：
[0112]
向从新鲜外周血或冷冻单采(apheresis)血液得到的单核细胞中，添加cd3珠(例如clinimacscd3、miltenyi biotec、130-017-601(每1x107细胞5μl)，在使用冷冻分离血液时，进一步添加cd34珠(例如clinimacscd34、miltenyi biotec、130-017-501(每1x107细胞
2.5μl))，使其悬浊后，在4℃下孵育15分钟后，加入分离缓冲液(例如，包含0.5％人ab型血清(在56℃下经过了30分钟的非激活处理)、2mmedta的pbs)，充分悬浊后，进行离心。除去上清液，以每1个ld柱(例如，miltenyi biotec，130-042-901)的细胞数最大为1x108细胞的方式，悬浊在0.5ml的分离缓冲液中。预先添加分离缓冲液2ml后，向ld柱中添加细胞悬浊液，回收来自ld柱的洗脱液。进一步向ld柱中添加分离缓冲液1ml，回收洗脱液。对回收的液体进行离心分离，除去上清液后，使用外周血时以5x105细胞/ml的方式，使用冷冻分离血液时以5x106细胞/ml的方式，将细胞悬浊在适当的培养基(例如，包含5％人ab型血清(在56℃下经过了30分钟的非激活处理)或向5％ultragro(aventacell，hpcplcrl10)中添加2u/ml肝素钠而成的物质中的任一者的kbm501培养基)中，适当更换培养基并培养至第14天。
[0113]
[3]的高活性nk细胞的具体的制备方法可以参考专利申请2020-35297的说明书。
[0114]
[4]以如下方式得到的细胞。得到[1]～[3]的细胞时，将选自由il-12、il-15及il-18组成的组中的任一种以能够达到本发明目的的浓度与il-2同时添加或者代替il-2，进行培养而得到。这样的细胞的具体的制备方法可以参考leong jw et al.biol blood marrow transplant 20(2014)463-473。
[0115]
此外，在本说明书中，以使用高活性nk细胞的情况为例对本发明进行说明，但如果是本领域技术人员则对于其他使用通过在体外使用任一细胞因子而经过活化操作的细胞的情况，也可以基于其说明，理解本发明。
[0116]
(细胞毒性活性)
[0117]
关于本发明中的高活性nk细胞等，活性或细胞毒性活性除了特别记载的情况以外，是指对象细胞(效应细胞，e)对靶细胞(t)的溶解能力。细胞毒性活性可以用被效应细胞致死的靶细胞的百分比(％)表示，通过下式求出。
[0118]
(与效应细胞共培养时的细胞死亡-自然细胞死亡(阴性对照)/(最大细胞死亡(阳性对照)-自然细胞死亡(阴性对照)
×
100
[0119]
在测定细胞毒性活性时，一般根据效应细胞的细胞毒性活性的程度等，效应细胞与靶细胞的混合比(e：t)、效应细胞与靶细胞共培养的时间可以根据所使用的细胞的种类或活性的强度而适当设定。将nk细胞作为效应细胞时，存在靶细胞为k562细胞、急性骨髓性白血病细胞、慢性骨髓性白血病细胞的情况，但并不限于此。效应细胞和靶细胞、活细胞和死细胞可以通过用放射性物质、荧光色素等标记的抗体等试剂来区分和定量。将nk细胞作为效应细胞时的细胞毒性活性可以在如下条件下测定，即，将k562细胞设为靶细胞，将e：t设为1：0.05～10，优选设为1：0.1～5，更优选设为1∶1，将孵育时间设为0.5～18小时，优选设为1～12小时。
[0120]
关于本发明，nk细胞等的活性高，除了特别记载的情况以外，是指将靶细胞设为k562细胞，以e∶t＝1∶1混合，孵育0.5～3小时，更特定为2小时情况下的细胞毒性活性为50％以上。活性优选为60％以上，更优选为70％以上。
[0121]
关于本发明，某细胞(例如除抗原肿瘤细胞以外的细胞、正常细胞)未被nk细胞等杀伤，除了特别记载的情况以外，是指将目标细胞设为t，以e∶t＝1∶1混合，孵育0.5～3小时，更特定为2小时情况下的细胞毒性活性小于5％。对目标细胞的活性优选小于3％，更优选小于1％或检测不到。
[0122]
[nk细胞群体的制备方法]
[0123]
本发明还提供包括以下工序的nk细胞群体的制备方法。
[0124]
(1)准备nk细胞群体、抗体、及具有能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i和能够与抗体结合的区域ii的物质；
[0125]
(2)在蛋白质存在下，向nk细胞群体中加入抗体，得到与抗体结合的nk细胞群体；
[0126]
此时，nk细胞与物质的区域i结合，并且抗体与物质的区域ii结合，物质稳定nk细胞与抗体的结合。
[0127]
(工序(1)：nk细胞群体等的准备)
[0128]
nk细胞群体的原材料可以是外周血、脐带血、骨髓和/或淋巴结、通过单采(apheresis)法采集的血液(分离血液)。另外，原材料可以是由选自由以下细胞构成的组中的至少一种细胞制备的材料：来自于选自由胚性干细胞、成体干细胞及人工多能干(ips)细胞组成的群中的任一种干细胞的造血干细胞；来自于脐带血的造血干细胞；来自于外周血的造血干细胞；来自于骨髓血的造血干细胞；脐带血单核细胞；外周血单核细胞。原材料的供体可以是接受利用高活性nk细胞等的免疫治疗的患者自身、该患者的近亲或与患者无血缘关系的健康者。供体可以是多个。
[0129]
(培养基)
[0130]
为了得到nk细胞群体，用于培养和活化作为原材料的细胞的培养基，包含kbm501培养基(kohjin bio株式会社，以1.750jru/ml包含il-2)、cos-008(cosmo bio，以1.750jru/ml包含il-2)、fkcm101(fukoku，不包含il-2、或以175iu/ml包含il-2)、cellgro scgm培养基(cellgenix，岩井化学药品株式会社)、x-viv015培养基(lonza，takara bio株式会社)、gibco(注册商标)cts(注册商标)aim v(注册商标)培养基(thermo fisher scientific，t细胞及树状细胞的增殖、操作用的已知组成的无血清培养基)、cts optmizer t细胞扩增基础培养基(thermo fisher scientific，人t淋巴细胞的生长及增殖用)、imdm、mem、dmem、rpmi-1640等，但并不限于此。优选的例子为kbm501培养基、fkcm101或cos-008。此外，关于本发明，对细胞的培养(对细胞进行培养)除了特别记载的情况以外，是指为了选自由细胞的生存维持、细胞的扩增及细胞的活化组成的组中的任一目的，将细胞在培养基或基于其的液体中维持一定时间。在特定温度下进行一定时间的处理时，有时称为孵育(进行孵育)。
[0131]
在培养基中，可以以能够达到本发明目的的浓度添加il-2。il-2的浓度可以为2500iu/ml～2813iu/ml。il-2优选具有人的氨基酸序列，在安全上，优选通过重组dna技术生产。il-2的浓度可以用国内标准单位(jru)和国际单位(iu)表示。由于1iu为约0.622jru，因此现有培养基的1750jru/ml相当于约2813iu/ml。
[0132]
可以将选自由il-12、il-15及il-18组成的组中的任一种以能够达到本发明目的的浓度与il-2同时添加或者代替il-2(上述leong jw et al.biol blood marrow transplant 20(2014)463-473)。各浓度与其他细胞因子的有无或浓度无关，可以为1pg/ml～1μg/ml。il-2优选具有人的氨基酸序列，在安全上，优选通过重组dna技术生产。
[0133]
在培养基中，可以添加受试者的自身血清、可从biowhittaker公司等得到的人ab型血清或可从日本红十字会得到的献血人血清白蛋白。自身血清及人ab型血清优选以1～10％的浓度添加，献血人血清白蛋白优选以1～10％的浓度添加。也可以将人血小板溶解物(human platelet lysate：hpl)与血清一同添加或代替血清。hpl被市售，ultragrotm系列
(aventacell biomedical公司)等被销售。使用hpl时，可以向培养基中进一步添加肝素钠。
[0134]
在不损害nk细胞的培养效果的条件下，培养基中可以包含适当的蛋白质、细胞因子、抗体、化合物及其他成分。细胞因子除了上述的il-2、il-12、il-15和il-18以外，还可以是il-3、il-7、il-21、干细胞因子(scf)和/或fms样酪氨酸激酶3配体(flt3l)。这些均优选具有人的氨基酸序列，在安全上，优选通过重组dna技术生产。
[0135]
培养基优选为无血清培养基。无血清培养基优选包含血清白蛋白、转铁蛋白和胰岛素。用于培养淋巴细胞的无血清培养基已被开发并市售着，在本发明中可以使用这些。无血清培养基的一个优选例子是在基础培养基中添加作为支持人t细胞增殖的组成而被市售的cts免疫细胞sr(thermo fisher scientific)所得到的培养基。
[0136]
在可得到目标培养效果的条件下，培养基的更换或补充可以在培养开始后的任何时间进行，但优选每3～5天。
[0137]
培养时所使用的培养容器包括可从商业上得到的培养皿、烧瓶、板、多孔板，但并不限于此。培养条件在不损害nk细胞的培养效果的条件下没有特别限定，但一般为37℃、5％co2和饱和水蒸气氛围下的培养条件。培养期间在可得到目标培养效果的条件下没有特别限定。
[0138]
(抗体、抗体药物)
[0139]
关于本发明，抗体除了特别记载的情况以外，是指免疫球蛋白的任一种的型(同型)。在人的情况下，抗体有igg、igm、iga、igd、ige这5种型。另外，关于本发明，抗体除了特别记载的情况以外，除抗体之外，还包括具有来自抗体的序列的抗体药物。关于本发明，抗体药物除了特别记载的情况以外，没有限定来源的生物种。本发明中所使用的抗体药物可以是小鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、不具有表示来源的亚词干系统的抗体。在本说明书及附图中，关于本发明，以抗体为igg的情况为例进行说明，但如果是本领域技术人员则对于使用其他型的抗体的情况，也可以适用其说明来理解。
[0140]
(igg)
[0141]
关于本发明，igg除了特别记载的情况以外，除igg之外，还包括衍生自igg的分子。衍生自igg的分子包括抗体片段。作为该例子，可举出fab、scfv、v
h-v
l
、scfv-ch3、vhh、dab、它们的多聚体、它们的融合体。(nature biotechnology volume 23，pages1126-1136(2005))。衍生自igg的分子还包括单域抗体。作为该例子，可举出vhh、vnar、sdab。单域抗体可以选择性地与特异性抗原结合，并且与igg和fab、scfv等抗体片段相比为低分子量。vhh抗体(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，重链抗体的重链可变区)是仅由骆驼科动物(美洲驼、羊驼等)的h链构成的抗体(重链抗体)的可变区，具有高稳定性，可以低成本生产，期待用作抗体医药(front immunol.2017 jun 9；8：653.)。
[0142]
关于本发明，igg还包括具有来自igg的序列的抗体药物。作为具有igg或来自igg的序列的抗体药物的例子，可举出作为小鼠抗体的莫罗单抗-cd3(muromonab-cd3)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、碘131托西莫单抗(iodine 131tositumomab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、博纳吐单抗(blinatummab)、帕舒托-莫塞妥莫单抗(moxetumomab pasudotox)、作为嵌合抗体的阿昔单抗(abciximab)、利妥昔单抗(rituximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、英夫利昔单抗(infliximab)、西妥昔单抗(cetuximab)、维汀-本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、司妥昔单抗(siltuximab)、地努妥昔单抗(dinutuximab)、奥托萨
昔单抗(obiltoxaximab)、作为人源化抗体的达利珠单抗(daclizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、阿仑单抗(alemtuzumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、贝伐单抗(bevacizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、培戈-赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、恩星-曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)、维多利珠单抗(vedolizumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、依达赛珠单抗(idarucizumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、埃罗妥珠单抗(elotuzumab)、艾塞吉珠单抗(ixekizumab)、瑞利珠单抗(reslizumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、奥瑞组单抗(ocrelizumab)、英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin)、艾美赛珠单抗(emicizumab)、贝那利珠单抗(benralizumab)、伽奈珠单抗(galcanezumab)、瑞玛奈珠单抗(fremanezumab)、替拉珠单抗(tildrakizumab)、卡帕珠单抗(caplacizumab)、依巴利珠单抗(ibalizumab)、雷夫利珠单抗(ravulizumab)、罗莫珠单抗(romosozumab)、利散吉珠单抗(risankizumab)、作为人抗体的阿达木单抗(adalimumab)、帕尼单抗(panitumumab)、戈利木单抗(golimumab)、乌司奴单抗(ustekinumab)、卡那单抗(canakinumab)、奥法妥木单抗(ofatumumab)、地诺单抗(denosumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、贝利木单抗(belimumab)、雷昔库单抗(raxibacumab)、雷莫卢单抗(ramucirumab)、纳武单抗(nivolumab)、司库奇尤单抗(secukinumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、阿利库单抗(alirocumab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、达雷木单抗(daratumumab)、布罗达单抗(brodalumab)、奥拉单抗(olaratumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、度匹鲁单抗(dupilumab)、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、古塞库单抗(guselkumab)、沙立芦单抗(sarilumab)、布洛舒单抗(burosumab)、厄瑞努单抗(erenumab)、拉那利尤单抗(lanadelumab)、作为不具有表示来源的亚词干系统的抗体的依玛鲁单抗(emapalumab)。
[0143]
本发明中所使用的抗体药物优选为用于处理癌症或传染病的抗体药物。
[0144]
(工序(2)：抗体与nk细胞的结合的稳定化)
[0145]
在本发明中，是在本发明的物质的存在下，向nk细胞群体中加入抗体，得到与抗体结合的nk细胞群体的工序，此时，nk细胞与物质的区域i结合，并且抗体与物质的区域ii结合，物质稳定nk细胞与抗体的结合。在此，nk细胞群体、抗体及本发明的物质的混合可以在使用时进行。例如，可以维持将nk细胞群体、抗体和物质保持在不同容器中的状态，在即将向对象施用前～数小时前混合。
[0146]
混合时，混合的顺序可以适当设定。例如，可以在将nk细胞群体与物质混合而孵育后加入抗体进一步孵育，也可以在将抗体与物质混合而孵育后加入nk细胞群体进一步孵育。
[0147]
在nk细胞群体的制备方法中，可以有除去不与nk细胞结合的抗体的工序。即，在通过该制备方法得到的nk细胞群体中，包含nk细胞和抗体，但优选抗体全部与nk细胞结合，实质上不包含不与nk细胞结合的抗体。
[0148]
[药物组合物]
[0149]
本发明还提供药物组合物，其包含与抗体药物结合的nk细胞群体，通过具有以下区域的物质，抗体药物与nk细胞的结合稳定。
[0150]
能够与nk细胞的表面蛋白结合的区域i；及
[0151]
能够与抗体结合的区域ii。
[0152]
药物组合物典型而言是与抗体结合且通过物质其结合稳定了的nk细胞悬浊在溶液中的状态。用于悬浊nk细胞的溶液一般为例如包含dmso的冷冻用保护液、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(pbs)、培养基、血清等。溶液可以包含作为药物和护肤品的药学上可接受的载体。
[0153]
本发明的药物组合物的制备优选在符合药物和护肤品的制备管理和品质管理规则的条件(good manufacturing practice、gmp)和再生医疗等产品的制备管理和品质管理的基准(good gene，cellular，and tissue-based products manufacturing practice、gctp)下实施。
[0154]
通过本发明提供的药物组合物可以适用于具有高活性nk细胞等敏感性的各种疾病的处理。这样的疾病的例子为癌症或传染病，具体而言，包括皮肤癌、口腔癌、胆囊癌、胆管癌、肺癌、肝癌、胃癌、大肠癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、白血病、或由病毒、细菌等引起的传染病，但并不限于此。
[0155]
利用本发明的药物组合物的细胞疗法可以单独实施，也可以与外科疗法、化学疗法、放射线疗法、抗体药物等组合实施。
[0156]
本发明中所得到的一个重要见解是，nk细胞即使在体外进行活化培养，不管有没有与抗体医药结合也不完全杀伤正常细胞。该见解示出，通过将抗体药物的adcc活性的效应细胞限定为nk细胞，可维持adcc活性的优点，提高抗体药物的安全性。nk细胞仅存在于外周血中时，由于用于治疗恶性肿瘤或传染病的数量和活性都少，因此优选在体外进行活化培养。根据本见解，可以将在体外活化了的nk细胞限定为抗体药物的adcc活性的效应细胞，在治疗中更容易使用抗体药物和高活性nk细胞。特别是，在使用高活性nk细胞时，该见解在安全上尤为重要。
实施例
[0157]
[实验
·
实施例间共通的方法]
[0158]
a).高活性nk细胞gaia-102的培养方法
[0159]
解冻冷冻单采血液(hemacare，pb001clp)，使用lovo细胞处理系统(fresenius kabi)进行清洗和浓缩，得到pbmcs。向得到的pbmcs中添加cd3珠
※1、cd34珠
※2，使其悬浊，在4℃孵育15分钟后，加入分离缓冲液
※3，充分悬浊，以300
×
g进行离心分离10分钟。除去上清液，以每1个ld柱(miltenyi biotec，130-042-901)的细胞数最大为1x108细胞的方式，悬浊在0.5ml的分离缓冲液中。预先添加分离缓冲液2ml后，向ld柱中添加细胞悬浊液，回收来自ld柱的洗脱液。进一步向ld柱中添加分离缓冲液1ml，回收洗脱液。然后，用分离缓冲液1ml清洗(wash)柱，计数回收的液体中的细胞数，算出总细胞数。以500
×
g进行离心分离5分钟，除去上清液后，进行培养，或者用stem-cellbanker以1x107细胞/ml在-80℃冷冻为除去cd3、cd34的pbmcs。将冷冻pbmcs用于培养时，用包含血清的培养基以10倍稀释进行解冻，开始培养。
[0160]
培养以如下方式进行，即，以成为1x106细胞/ml的方式悬浊在kbm501培养基
※4中，使用6孔板(thermo fisher scientific，140675)、t-75烧瓶(thermo fisher scientific，156499)或粘附培养用袋(nipro)，在co2培养箱中进行(37℃，5％co2)。培养第9天，以6孔板时最终液量为每孔6ml、t-75烧瓶时最终液量为每烧瓶50ml、袋时最终液量为每袋500ml的方式，添加kbm501培养基，孵育至第14天。
[0161]
※
1：clinimacs cd3，miltenyi biotec，130-017-601(每1x107细胞5μl)
[0162]
※
2：clinimacs cd34，miltenyi biotec，130-017-501(每1x107细胞2.5μl)
[0163]
※
3：包含0.5％人ab型血清(cosmo bio，12181301，在56℃下经过了30分钟的非激活处理)、2mm edta(thermo fisher scientific，15575-020)的pbs(nacalai tesque，14249-24)
[0164]
※
4：包含5％人ab型血清(cosmo bio，12181301，在56℃下经过了30分钟的非激活处理)或向5％ultragro(aventacell，hpcplcrl10)中添加2u/ml肝素钠而成的物质的kbm 501(kohjin bio，16025015)
[0165]
b).高活性nk细胞gaia-102的回收方法
[0166]
在培养第14天回收培养液，进一步向培养容器中加入1mm edta，剥离粘附的细胞，用kbm501培养基对回收剥离细胞后的培养容器进行清洗。对所有细胞回收液进行离心后，用kbm501培养基进行清洗、再悬浊。
[0167]
c).gaia-102与抗体药物的结合确认
[0168]
对于与各抗体药物反应的gaia-102，在以各1μg/ml的浓度混合以下所示的抗体的抗体液中，在4℃下染色30分钟后，进行离心分离(500
×
g，5分钟)，除去上清液，悬浊在pbs中后，使用流式细胞仪(bd lsrfortessa，bd生物科学公司)进行测定，用flowjo软件(flowjo，llc)进行分析。
[0169]
《使用的抗体》
[0170]
alexa fluor(注册商标)700标记抗人cd56抗体(biolegend，318316)、percp/c5.5标记抗人cd3抗体(biolegend，300430)、pe-cy7标记抗人cd16抗体(biolegend，302016)、pe标记抗人igg抗体(southernbiotech，2043-09)
[0171]
[实验1：联合使用抗体药物时对allo-9wbc的杀伤的确认]
[0172]
对按照上述b)所记载的步骤得到的nk细胞的活细胞数进行计数，使1x107细胞悬浊在1ml的stem-cellbanker中，在-80℃下冷冻，在37℃、水浴中解冻后，用plasmalyte-a稀释10倍，在常温下保管1小时后，悬浊在kbm501培养基中培养3小时。
[0173]
为了测定细胞毒性活性，准备了使解冻nk细胞和k562细胞反应的组、作为阴性对照的仅k562细胞的组、作为阳性对照的用10％福尔马林固定k562细胞的组。
[0174]
《nk》
[0175]
回收上述解冻后培养3小时的细胞，用10％fbs/rpmi1640调整为2x106细胞/ml的浓度。
[0176]
《肿瘤细胞株》
[0177]
将k562细胞(人慢性骨髓性白血病细胞株)、hut78细胞(人t淋巴瘤(塞泽里综合征，sezary syndrome))悬浊在不含血清成分的rpmi1640培养基中，使用pkh26红色荧光细胞连接试剂盒(sigma，pkh26gl-1kt)进行染色，最终用10％fbs/rpmi1640调整为2x106细
胞/ml。
[0178]
《pbmc》
[0179]
外周血单核细胞(pbmcs：peripheral blood mononuclear cells)使用了通过上述a)的步骤得到的细胞。在不含血清成分的rpmi1640培养基中使其悬浊，使用pkh67绿色荧光细胞连接试剂盒(sigma，pkh67gl-1kt)进行染色，最终用10％fbs/rpmi1640调整为2x106细胞/ml。
[0180]
将nk细胞和k562细胞、pbmc以细胞比为1∶1或1∶1∶1的方式添加到96孔板(iwaki，4870-800sp)中，对于poteligeo(+)，以终浓度为10μg/ml的方式添加poteligeo并进行混合，在37℃、5％co2下反应2小时。反应后，进行离心分离(500
×
g，5分钟)，除去上清液后，添加用pbs稀释的7-aad溶液，使其悬浊，在室温下孵育20分钟。使用流式细胞仪进行测定，用flowjo软件进行分析，算出细胞毒性活性(％溶解)
※
5。
[0181]
※
5：细胞毒性活性(％溶解)＝(细胞死细胞率-阴性对照死细胞率)/(阳性对照死细胞率-阴性对照死细胞率)
×
100
[0182]
将结果示于图1。即使联合使用poteligeo时，也未发现对pbmc的杀伤。
[0183]
[实验2：在培养基中nk细胞对抗体药物的保持]
[0184]
对按照高活性nk细胞的培养方法、回收方法中所记载的步骤得到的gaia-102的活细胞数进行计数，以成为1x106细胞/ml的方式，悬浊在包含100μg/ml莫格利珠单抗(poteligeo静脉滴注20mg，kyowa kirin)的pbs(nacalai tesque，14249-24)中。将悬浊的gaia-102接种到低吸附6孔板(iwaki，4810-800sp)中，在室温下静置1小时。反应1小时后，回收细胞，用pbs清洗3次后，将悬浊在pbs中的gaia-102+莫格利珠单抗、悬浊在kbm501培养基(5％ultragro+2u/ml肝素钠)中的gaia-102+莫格利珠单抗分别按照c)中所记载的步骤进行抗体染色、测定，对示出cd56+且cd3-的细胞群体中的cd16低和cd16高时的gaia-102与莫格利珠单抗有无结合进行分析。
[0185]
将结果示于图2。可知gaia-102在kbm501培养基中无法通过cd16保持抗体。
[0186]
[实验3：培养基添加物的影响]
[0187]
按照与实验2相同的步骤，使gaia-102和100μg/ml莫格利珠单抗在室温下反应1小时。用pbs清洗3次后，分为5组，在(1)kbm501培养基(5％ultragro+2u/ml肝素钠)、(2)不含血清成分的kbm501培养基(以下称为无血清kbm501培养基)、(3)包含3,000iu/ml il-2(imunace
(注册商标)
、盐野义制药)的10％fbs/rpmi1640培养基
※5、(4)10％fbs/rpmi1640、(5)pbs中使其再悬浊。将各组静置约5分钟后，按照c)中所汜载的步骤进行抗体染色、测定，对示出cd56+且cd3-的细胞群体中的cd16低和cd16高时的gaia-102与莫格利珠单抗有无结合进行分析。
[0188]
※
5：包含10％fbs(nichirei bioscience，171012-500ml)和100单位青霉素、100μg/ml链霉素(nacalai tesque，26253-84)的rpmi1640培养基
[0189]
将结果示于图3。可知gala-102在包含ultragro的培养基中无法通过cd16保持抗体。
[0190]
[实验4：在血液中的影响]
[0191]
按照与实验2相同的步骤，使gaia-102和100μg/ml莫格利珠单抗在室温下反应1小时。用pbs清洗3次后，分为8组，分别在(1)10％fbs/kbm501培养基、(2)5％ultragro/kbm501
培养基、对5％ultragro/kbm501培养基用无血清kbm501培养基阶段性地每次稀释5倍而得到的(3)1％ultragro/kbm501培养基、(4)0.2％ultragro kbm501培养基、(5)5％ultragro/rpmi1640培养基、(6)包含3,000iu/ml 11-2的5％ultragro/rpmi1640培养基、(7)从由健康人志愿者采集的外周血中分离出的ppp(platelet-pour plasma)
※6、(8)从健康人志愿者采集的外周血(pb)中使其再悬浊。将各组静置约5分钟后，按照c)中所记载的步骤进行抗体染色、测定，对示出cd56+且cd3-的细胞群体中的cd16低和cd16高时的gaia-102与莫格利珠单抗有无结合进行分析。
[0192]
※
6：将外周血在室温(brake off)下以2000
×
g离心15分钟而得到的上清液
[0193]
将结果示于图4。不论培养液的种类如何，在ug或血液的存在下，抗体从gaia-102中脱离。可知gaia-102在人血液中无法通过cd16保持抗体。
[0194]
[实验5：igg的影响]
[0195]
按照实验2中所记载的步骤，同样地，使gaia-102和100μg/ml莫格利珠单抗在室温下反应1小时。用pbs清洗3次后，分为5组，分别在(1)包含1mg/ml曲妥珠单抗(herceptin
(注册商标)
注射用、中外制药)的无血清kbm501培养基、(2)5％ultragro/kbm501培养基、(3)5％人ab型血清/kbm501培养基、(4)无血清kbm501培养基、(5)pbs中使其再悬浊。将各组静置约5分钟后，按照c)中所记载的步骤进行抗体染色、测定，对示出cd56+且cd3-的细胞群体中的cd16低和cd16高时的gaia-102与莫格利珠单抗有无结合进行分析。
[0196]
将结果示于图5。可知与nk细胞结合的抗体药物由于其他igg的竞争而结合脱离。
[0197]
[实施例1：原型物质的制作]
[0198]
设计具有与nk细胞膜上的抗原nkp46结合的区域和与igg结合的区域的蛋白质，并尝试将抗体药物锚定在细胞上。更详细地，作为与nkp46结合的区域，使用了wo2017/114694中所记载的抗人nkp46scfv(该文献中记载的排列号：121)。另外，作为与igg结合的区域，使用了蛋白质g的序列(https：//www.uniprot.org/uniprot/p19909)中的373-297aa。
[0199]
融合蛋白委托给kaico株式会社(819-0388日本福冈市西区九大新町4-1福冈市产学联合交流中心217)，通过利用蚕的重组蛋白表达技术而制作。
[0200]
将设计的蛋白质的氨基酸序列(385个氨基酸长度)示于图6。
[0201]
[实施例2：抗体药物在细胞上的锚定]
[0202]
对按照高活性nk细胞的培养方法、回收方法中所记载的步骤得到的gaia-102，通过下述方法进行利用纯化的原型物质(pg2-nkp46)的锚定。
[0203]
使用低吸附96孔板(iwaki，4870-800sp)，接种gaia-102(1x106细胞/ml)25μl，进行离心(500
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g，5分钟)后，除去上清液，悬浊在包含350μg/ml原型物质的pbs 25μl中。在室温下静置1小时后，用pbs清洗1次，用包含1μg/ml赫赛汀的pbs 25μl置换，进一步在室温下静置1小时。然后，用pbs清洗1次，按照c)中所记载的步骤进行抗体染色、测定，分析有无赫赛汀的结合。
[0204]
使用低吸附96孔板，向包含350μg/ml原型物质的pbs 25μl中，以成为1μg/ml的方式添加赫赛汀，在室温下静置1小时。预先接种gaia-102(1x106细胞/ml)25μl，进行离心后，除去上清液，将所得到的细胞悬浊在反应1小时的原型物质+赫赛汀液中。进一步在室温下静置1小时，用pbs清洗1次，按照c)中所记载的步骤进行抗体染色、测定，分析有无赫赛汀的结合。
[0205]
使gaia-102和pbs反应1小时，按照c)中所记载的步骤进行抗体测定，作为上述2组的对照。
[0206]
将结果示于图7。确认到通过原型物质可以锚定。可知无论与抗体或gaia-102的混合顺序如何，原型物质都可以锚定。
[0207]
[实施例3：对于各种抗体药物的效果]
[0208]
将按照高活性nk细胞的培养方法、回收方法中所记载的步骤得到的gaia-102 1x105细胞悬浊在包含13.3μg/ml原型物质的5％ultragro/kbm501培养基100μl中，在室温下静置1小时。1小时后，用pbs清洗1次后，分为5组，分别在包含1μg/ml的如下各种抗体药物的pbs中使其悬浊，上述各种抗体药物为西妥昔单抗(erbitux
(注册商标)
注射液，merck biopharma)、赫赛汀、poteligeo、利妥昔单抗(rituxan
(注册商标)
静脉滴注，全药工业)、地努妥昔单抗(unituxin，united therapeutics公司)。作为对照，将gaia-102(无利用原型物质的锚定)同样地悬浊在包含各抗体药物的pbs中。在室温下静置1小时后，用pbs清洗1次，按照c)中所记载的步骤进行抗体染色、测定，分析有无各抗体药物的结合。
[0209]
将结果示于图8。可知无论使用何种抗体药物，通过利用原型物质的锚定，细胞与抗体的结合都稳定。
[0210]
序列表自由文本
[0211]
seq id no：1核苷酸序列，pg/fc-nkp46/scfv
[0212]
seq id no：2氨基酸序列，pg/fc-nkp46/scfv
[0213]
seq id nos：3-12和32-42能够与nk细胞表面蛋白结合的区域
[0214]
seq id nos：13-31 wo2016/186206，seq id nos：1～17、36和37。