用于过继性细胞疗法的多肽的制作方法

本发明涉及一种用于过继性细胞疗法(act)的多肽。该多肽包含自杀部分，即，使得表达所述多肽的细胞能够被删除的表位。因此，所述多肽提供了一种为细胞提供安全开关的手段，该开关允许细胞被“关闭”或消除。本发明还提供了一种编码这种多肽的核酸、包含这种核酸的细胞以及其治疗用途。

背景技术：

1、遵循早期期待，过继性细胞疗法(act)在对抗恶性和传染性疾病的临床应用中正被越来越多地使用和测试。经基因工程化以识别cd19的t细胞已被用于治疗滤泡性淋巴瘤，而使用经基因修饰以表达抗肿瘤t细胞受体的自体淋巴细胞的act已被用于治疗转移性黑色素瘤。act在黑色素瘤和ebv相关的恶性肿瘤中的成功激发了人们为重新定位效应t细胞来治疗其他肿瘤而努力，并且t细胞已经被工程化来表达具有新特异性的t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。

2、据报导，car修饰的t淋巴细胞已用于b系恶性肿瘤的免疫治疗(kohn等(2011)mol.ther.19：432-438)，并且抗gd2 car转导的t细胞已用于神经母细胞瘤的治疗(pule等(2008)nat.med.14：1264-1270)。在成人淋巴瘤的car临床研究中也报导了显示有疗效的数据，并且用识别黑色素瘤抗原的初始t细胞受体转导的t细胞使播散性黑色素瘤得到了显著缓解。

3、其他类型的免疫细胞也被用于或被建议用于act，包括例如nk细胞，包括被工程化以表达car的nk细胞。最近，已经开发出了用于act的调节性t细胞(treg)。treg具有免疫抑制功能。它们的作用是控制细胞病变的免疫应答，并且对维持免疫耐受性至关重要。treg的抑制特性可以在治疗上用于例如改善和/或预防炎症性疾病、自身免疫性疾病和移植中的免疫介导的器官损伤。

4、过继性免疫疗法不断提高的疗效一直与严重不良事件的报告联系在一起。已有输注工程化t细胞后的急性不良事件报导，例如细胞因子风暴。另外，已经发生了慢性不良事件，并且已通过动物模型预测到了其他不良事件。例如，由于碳酸酐酶ix(caix)在胆道上皮上的意外表达，重定向到caix(由肾癌表达的抗原)的t细胞在数名患者中产生了肝毒性。由于目标抗原在皮肤和虹膜上的表达，抗黑色素瘤的初始t细胞受体转移研究已导致患者出现白癜风和虹膜炎。在初始tcr转移后，小鼠中已有因tcr交叉配对引起的移植物抗宿主病(gvhd)样综合征的报导。在用一些含有共刺激的car过继转移后，动物模型中已有淋巴增生性疾病的报导。最后，载体插入突变的风险始终存在。虽然急性毒性可以通过谨慎给药来解决，但慢性毒性可能与细胞剂量无关。

5、由于工程化t效应细胞可以在给药后扩增并持续数年，并且鉴于患者在施用任何免疫疗法后都存在不良事件的风险，因此希望能纳入一种安全机制，以允许在面临毒性时选择性地删除过继输注的t细胞及其他免疫细胞。

6、自杀基因使得能够选择性删除体内转导的细胞。有两个自杀基因已接受了临床测试：hsv-tk和icasp9。单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)在t细胞中的表达赋予了对更昔洛韦的易感性。hsv-tk的使用仅限于深度免疫抑制的临床环境，比如单倍体相合骨髓移植，因为这种病毒蛋白具有高度免疫原性。进一步地，它排除了使用更昔洛韦来治疗巨细胞病毒。诱导型caspase 9(icasp9)可以通过施用小分子药物(ap20187)来激活。icasp9的使用取决于临床级ap20187的可用性。另外，除了基因工程细胞产物外，使用实验性小分子可能会导致监管问题。

7、其他自杀基因正在开发中，并且ep-2836511b已经报导了基于抗原cd20的最小表位的构建体，该构建体由裂解抗体利妥昔单抗识别。利妥昔单抗是一种针对蛋白cd20的免疫治疗嵌合单克隆抗体，蛋白cd20主要发现于b细胞表面。当利妥昔单抗与cd20结合时，会触发细胞死亡，因此利妥昔单抗可用于靶向和杀伤表达cd20的细胞。已经开发出了模仿利妥昔单抗识别的表位的肽(所谓的模拟表位)，并且这些肽在ep2836511中被用作自杀-标志物联合构建体中的自杀部分，该构建体还包含cd34最小表位作为标志物部分。

8、具体地，ep-2836511b关注于在单个致密多肽中同时提供自杀部分和标志物部分，并为此目的开发了一种由ep-2836511的seq id no.4表示的被称为rqr8的多肽。rqr8包含两个环状肽cd20模拟表位(“r”)，这些模拟表位位于具有本文seq id no.1(对应于ep-2836511b的seq id no.2)序列的特定cd34表位(“q”)两侧，cd34表位由单克隆抗体qbend10识别。这很重要，因为qbend10抗体用于miltenyi clinimacs磁性细胞选择系统，该系统被广泛用于临床环境中的细胞分离。因此，将q表位包含作为标志物使已经修饰的细胞能够表达易于使用常见选择系统选择出的该多肽。关键性地，多肽中的r表位和q表位通过间隔序列(“s”)根据以下通式相互分离：st-r1-s1-q-s2-r2。已讨论过组合长度需要至少10个氨基酸(其是特定构建体rqr8中的14个氨基酸)的间隔序列s1和s2与q相结合对于保持r1和r2表位在正确距离的重要性，这样多肽不能同时与利妥昔单抗的两个抗原结合位点结合，从而确保多肽能够有效诱导细胞死亡。特别指出，r1与r2之间的距离可以超过st是茎序列，当多肽在细胞上表达时，茎序列允许r表位和q表位从细胞表面伸出。在rqr8中，茎序列来自cd8。

9、对用于act的改进或替代性自杀构建体的需求仍在继续，包括不限于使用qbend10cd34标志物系统的构建体，而本发明就是针对这一需求。

技术实现思路

1、特别地，在开发本发明中，本发明人已经意识到cd20表位(r表位)之间的物理距离或间距并不像ep-2836511b所认为的那样关键或重要。特别地，本发明人已经确定，防止两个r表位与同一利妥昔单抗分子结合可以通过关注于分离它们的序列的灵活性来实现，而不仅仅是物理距离(即，分离它们的序列的长度)。因此，本发明人已经表明，实际上可以产生功能性自杀多肽，在该多肽中，r表位被比ep-2836511b中所需的那些序列短得多的序列分离。进一步地，通过r表位之间不包含标志物，可以去除对多肽设计的约束，并且可以使用范围广得多的不同接头序列来将自杀多肽构建体的r表位联结在一起并使其分离。与仅限于使用miltenyi clinimacs系统的那些相比，这样的多肽可以在更广泛的细胞修饰方案和应用中找到实用性。特别地，本发明人发现，通过增加分离两个r表位的序列的灵活性，构建体诱导细胞裂解的能力，特别是构建体对利妥昔单抗或其生物仿制药的敏感性也增加了，并且本发明进一步包括了具有高细胞耗竭能力的改进构建体的开发。具体地，使用具有增强的利妥昔单抗敏感性的构建体可以在出现不良反应的情况下减少对患者所需施用的利妥昔单抗的量。

2、因此，在第一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽包含具有下式的序列：

3、r1-l-r2-st

4、其中

5、r1和r2是利妥昔单抗结合表位；

6、st是茎序列，当该多肽在靶细胞的表面表达时，该茎序列导致r1表位和r2表位从细胞表面伸出；以及

7、l是将r1的c末端连接到r2的n末端的柔性接头序列，并且该柔性接头序列不包含qbend10结合表位，该qbend10结合表位包含seq id no.1所示的序列。

8、更具体地，l可以选自：

9、(i)柔性接头序列，该柔性接头序列具有不超过25个氨基酸的长度，优选不超过24个、23个、22个或21个氨基酸的长度；和/或

10、(ii)接头序列，该接头序列包含至少40％的甘氨酸残基或甘氨酸和丝氨酸残基；和/或

11、(iii)接头序列，该接头序列包含丝氨酸残基和/或甘氨酸残基，和不超过15个其他氨基酸残基，优选不超过14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、6个、7个、5个或4个其他氨基酸残基；和/或

12、(iv)接头序列，该接头序列具有氨基酸序列，其中至少80％、90％或100％的氨基酸残基为丝氨酸残基、甘氨酸残基、苏氨酸残基、丙氨酸残基、赖氨酸残基和谷氨酸残基；和/或

13、(v)接头序列，该接头序列具有不包含任何脯氨酸残基的氨基酸序列。

14、因此，替代地定义，本发明的该方面可以看作是提供了一种多肽，该多肽包含具有下式的序列：

15、r1-l-r2-st

16、其中，

17、r1和r2是利妥昔单抗结合表位；

18、st是茎序列，当该多肽在靶细胞的表面表达时，该茎序列导致r1表位和r2表位从细胞表面伸出；以及

19、l是将r1的c末端连接到r2的n末端的柔性接头序列，其中l选自：

20、(i)柔性接头，该接头不包含具有seq id no.1所示序列的qbend10结合表位；和/或

21、(i)柔性接头序列，该柔性接头序列具有不超过25个氨基酸的长度，优选不超过24个、23个、22个或21个氨基酸的长度；和/或

22、(ii)接头序列，该接头序列包含至少40％的甘氨酸残基或甘氨酸和丝氨酸残基；和/或

23、(iii)接头序列，该接头序列包含丝氨酸残基和/或甘氨酸残基，和不超过15个其他氨基酸残基，优选不超过14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、6个、7个、5个或4个其他氨基酸残基；和/或

24、(iv)接头序列，该接头序列具有氨基酸序列，其中至少80％、90％或100％的氨基酸残基为丝氨酸残基、甘氨酸残基、苏氨酸残基、丙氨酸残基、赖氨酸残基和谷氨酸残基；和/或

25、(v)接头序列，该接头序列具有不包含任何脯氨酸残基的氨基酸序列。

26、更具体地，本发明的多肽可以具有式r1-l-r2-st。

27、多肽可以与如编码tcr或car的基因等的治疗性转基因共表达。

28、在实施方案中，接头l不含标志物。然而，不排除多肽包含标志物。在一个实施方案中，所述多肽可以包含除在l中的标志物。在另一实施方案中，所述多肽不含标志物。在另一实施方案中，所述多肽可以与标志物共表达。

29、所述多肽可以包含seq id no.27所示的序列或其变体，该变体与seq id no.27所示的序列具有至少80％的同一性，并且该变体(i)与利妥昔单抗结合和(ii)当在细胞表面表达时，在利妥昔单抗存在下诱导杀伤该细胞。

30、在第二方面，本发明提供了一种融合蛋白，该融合蛋白包含本文定义的本发明的多肽和多肽融合配偶体，例如本文定义的任选地通过接头序列连接到多肽融合配偶体的本发明的多肽。融合配偶体可以是目标蛋白质(poi)。

31、poi可以是抗原受体，例如嵌合受体(比如嵌合抗原受体(car)或t细胞受体(tcr))、或标志物。

32、所述融合蛋白可以包含多肽与融合配偶体(例如目标蛋白质)之间的自剪切肽。

33、在一个实施方案中，本发明的多肽可以包含在多肽融合配偶体(例如poi)内。换言之，所述多肽可以在融合配偶体中融合或联结。在这方面来说，本发明的多肽可以例如包含在car内，例如car的胞外结构域内。因此，car可以包含胞外结构域，该胞外结构域包含抗原靶向部分，例如scfv和本发明的多肽。

34、在第三方面，本发明提供了一种核酸分子，该核酸分子包含能够编码如本文所定义的根据本发明的多肽或融合蛋白的核苷酸序列。

35、在第四方面，本发明提供了一种载体，该载体包含如本文所定义的本发明的核酸分子。

36、所述载体还可以包含另一编码序列或其他目标核苷酸序列。例如，其可以包含代表目标转基因的核苷酸序列，该核苷酸序列可以在一个实施方案中编码目标蛋白质，例如嵌合抗原受体或t细胞受体或标志物。

37、在第五方面，本发明提供了一种细胞，该细胞表达如本文所定义的本发明的多肽。

38、还提供了一种细胞，该细胞包含如本文所定义的核酸分子或载体。

39、所述细胞可以在细胞表面共表达所述多肽和poi。

40、所述细胞可以是免疫细胞或其前体，比如多能干细胞(psc)、例如ipsc，特别是t细胞、nk细胞、树突状细胞或骨髓源性抑制细胞(mdsc)，例如treg细胞，该细胞包括衍生自前体的这样的细胞，以及原代细胞和细胞系。

41、在第六方面，本发明提供了一种用于制造根据本发明第五方面的细胞的方法，该方法包括将根据本发明第四方面的载体引入细胞(例如用该载体转导或转染细胞)的步骤。

42、在第七方面，本发明提供了一种用于删除根据本发明第五方面的细胞的方法，该方法包括将细胞暴露于具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体的步骤。在一个方面，所述方法可以是一种体外方法。

43、替代地看，本发明的该方面可以包括具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体用于治疗已施用了如本文所定义的本发明的细胞的受试者，以删除所述细胞。

44、更进一步地根据该方面，本发明提供了一种试剂盒或组合产品，该试剂盒或组合产品包含(a)如本文所定义的本发明的多核苷酸、载体或细胞和(b)具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体。所述试剂盒或产品可以用于act。特别地，所述试剂盒或产品可以用于通过act使用所述细胞或制造供使用的本发明的细胞来治疗受试者，然后从所述受试者删除所述细胞。在施用所述细胞后(例如在一段时间后)或如果受试者表现出不想要的或有害的细胞治疗症状或效果，可以向受试者施用所述抗体。

45、在一个实施方案中，所述抗体可以是利妥昔单抗。

46、在第八方面，本发明提供了一种用于治疗受试者中疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用根据本发明第五方面的细胞的步骤。所述受试者可以是需要治疗的受试者，而细胞可以以对受试者治疗有效的量被施用。

47、替代地定义，该方面可以涉及一种通过act治疗受试者的方法或一种受试者的act方法。

48、所述方法可以包括以下步骤：

49、(i)将根据本发明第四方面的载体引入细胞样本(例如，从受试者分离或从供体获得的细胞样本)中(例如，通过用所述载体转导或转染所述细胞)，以及

50、(ii)将包含所述载体的细胞施用于所述受试者(例如，在自体细胞的情况下，将细胞返回到所述受试者)。

51、该方法可以包括向所述受试者施用具有利妥昔单抗的结合特异性的抗体的进一步步骤。

52、在第九方面，本发明提供了一种用于治疗的根据本发明第五方面的细胞。

53、在第十方面，本发明提供了一种用于通过过继性细胞转移来治疗的根据本发明第五方面的细胞。

54、所述方法或用途可以用于治疗癌症或者感染性或神经退行性疾病或用于免疫抑制。