经修饰的冠状病毒结构蛋白的制作方法

本发明公开涉及经修饰的病毒结构蛋白。本发明还涉及包括经修饰的病毒结构蛋白的病毒样颗粒(vlp)以及在宿主或宿主细胞中生产vlp的方法。

背景技术：

1、冠状病毒(cov)是属于尼多病毒目(nidovirales)的最大一组病毒，其包括冠状病毒科(coronavirinae)、动脉炎病毒科(arteriviridae)、洋病毒科(mesoniviridae)和杆状套病毒科(roniviridae)。冠状病毒亚科包括冠状病毒科的两个亚科的一个，另一个是环曲病毒亚科(torovirinae)。冠状病毒亚科进一步细分为四个属，即α-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒。α-冠状病毒和β-冠状病毒的成员仅在哺乳动物中发现。α-冠状病毒属包括两种人病毒，hcov-229e和hcov-nl63。重要的动物α-冠状病毒为猪传染性胃肠炎病毒和猫传染性腹膜炎病毒。

2、严重急性呼吸综合征冠状病毒2(sars-cov-2，也称为2019-ncov和hcov-19)是一种新谱系b型β-冠状病毒(beta-cov)并在2019年导致冠状病毒疾病(covid-19)，它是一种具有高死亡率和发病率的呼吸系统疾病，对全世界公共卫生造成重大影响。由于病毒的潜伏期和传播性，sars-cov-2的爆发(如2020年开始的大流行)是医疗保健系统面临的重大挑战。因此，迫切需要针对covid-19的治疗，但对sars-cov-2爆发的长期管理将需要有效的疫苗。

3、如最近的冷冻电子断层扫描和冷冻电子显微镜研究所示，冠状病毒的病毒颗粒是球形的，其直径为约118-140nm。

4、冠状病毒最突出的结构特征是从病毒颗粒的表面发出的棒状刺突突起。冠状病毒颗粒由螺旋状核衣壳结构组成，由核衣壳(n)磷蛋白和病毒基因组rna之间的结合形成，被脂质双分子层包围，其中插入三或四种类型的结构蛋白：刺突蛋白(s)、膜蛋白(m)和包膜蛋白(e)，以及仅对于某些冠状病毒，血球凝集素-酯酶(he)蛋白(masters ps.the molecularbiology of coronaviruses.adv virus res.2006；66:193–292)。

5、膜蛋白(m)是病毒颗粒中最丰富的结构蛋白。它是一种具有三个跨膜结构域的小(～25-30kda)蛋白，且据认为赋予病毒颗粒形状。包膜蛋白(e)是一种短的，由76-109个氨基酸组成的完整膜蛋白，大小在从8.4kda至12kda的范围内。一级和二级结构显示e具有由7-12个氨基酸组成的短亲水性氨基末端，接着是由25个氨基酸组成的大疏水性跨膜结构域(tmd)，和具有长亲水性羧基末端的末端，其包括大部分的蛋白。e蛋白参与病毒生命周期的一些方面，如组装、出芽、包膜形成和发病机制。

6、刺突(s)蛋白是一种糖蛋白，它是识别多种冠状病毒的宿主受体以及病毒和宿主细胞膜融合以供病毒进入细胞所必需的(belouzard等人,viruses 2012jun；4(6):1011-33)。作为病毒包膜的表面上的主要糖蛋白，冠状病毒科的s蛋白是由天然感染(包括sars-cov-2感染)引发的中和抗体的主要靶标，并且是靶向实验性疫苗候选的关键抗原。

7、sars-cov-2s蛋白(与其它冠状病毒的s蛋白一样)最初是作为前体蛋白合成的。单个前体s蛋白形成同源三聚体，并在高尔基体区室内进行糖基化以及去除信号肽的加工。s蛋白需要两步蛋白酶介导的激活以辅助膜融合。sars-cov-2s蛋白的特征在于s1/s2连接处的rrar弗林蛋白酶(furin)切割位点，据推测其在高尔基体区室中加工以产生两种不同的多肽：s1和s2多肽(或亚基)，它们在融合前构象中在同源三聚体内作为s1/s2原聚体保持非共价结合(walls等人,cell 2020 181(2)281-292页；li等人elife 2019；8:e51230)。在s1/s2连接处的弗林蛋白酶切割和融合肽上游s2'位点处的切割发生在病毒进入细胞表面或内涵体期间，并可由一些蛋白酶介导。

8、该三聚体在经由受体结合结构域(rbd)表位结合至宿主细胞上的靶标受体之前保持处于融合前构象。受体结合使融合前三聚体不稳定，从而导致s1亚基脱落，且s2亚基通过病毒与细胞膜的融合转变为稳定的融合后蛋白构象(wrapp等人,science,13mar 2020,367卷,6483期,1260-1263页)。中和来自感染有sars-cov-2的个体的抗体已显示靶向s蛋白的s1亚基的rbd(premkumar,l.,2020science immunology 2020年6月11日:5卷,48期)。

9、s蛋白胞外结构域在融合前构象中的稳定往往会提高重组表达得率，其可能是通过防止由于采用更稳定的融合后结构的趋势所产生的引起或错误折叠(hsieh等人.science 2020,369 1501-1505页)。

10、s蛋白胞外结构域的突变已显示辅助融合前构象的稳定。wo 2018/081318及pallesen,j等人的配套出版物(pnas,2017年8月29日114(35))公开了在七肽重复序列区1(hr1)与中心螺旋之间的连接处或附近的双脯氨酸替换，这使得在融合前构象和替换中稳定mers-cov刺突蛋白的s胞外结构域三聚体，以防止蛋白酶在s1/s2切割位点处切割和s胞外结构域的s2'切割位点处切割。在同源氨基酸残基处用双脯氨酸替换稳定的sars-cov-2s蛋白已用于通过冷冻em确定高分辨率结构(wrapp等人science 2020 367,1260–1263；walls等人.cell 2020,181,281–292)。此外，弗林蛋白酶识别位点的破坏被认为能使s蛋白保留在融合前构象中(wrapp等人science 2020 367,1260–1263)。然而，即使有这些替换，sars-cov-2s蛋白胞外结构域仍然不稳定，且难以在哺乳动物细胞中可靠地产生，从而阻碍了有效和高得率的亚基疫苗的开发(hsieh等人.science 2020,369 1501-1505页)。

11、hsieh等人.(science 2020,369p.1501-1505)基于先前确定的冷冻em结构设计并在哺乳动物细胞中表达了100多种结构引导的sars-cov-2刺突蛋白变体。这些变体在生物化学、生物物理和结构上表征以识别导致得率和稳定性升高的替换。hsieh等人报导了多种脯氨酸、二硫键、盐桥和空腔填充替换，其相对于双脯氨酸替换提高了刺突蛋白的表达和/或稳定性。最佳识别的变体hexapro具有6个有益的脯氨酸替换，从而导致比其亲代构建体的表达高10倍，并且能够耐受热应激、室温储存和多次冻融。

12、s2亚基可分为三个结构域：大胞外结构域、跨膜结构域(tm)和胞质尾(ct)。s蛋白的胞质尾先前已被显示是组装所需的。冠状病毒科的ct中可以发现两种不同的保留信息：i)内质网回收信号(errs)和/或ii)酪氨酸依赖性定位信息(yxxi或yxxf基序)。errs包括结合至外被体复合物i(copi)的二元kxhxx基序。当与sars膜(m)蛋白共表达时，该基序是sarss蛋白定位至ergic/高尔基体区所必需的，并且可以通过突变kxhxx基序来破坏定位(mcbride等人j.virol.feb 2007,81(5)2418-2428)。含有errs的s蛋白被招募到copi囊泡中，并从高尔基体逆行收回到内质网(er)。在er与高尔基体之间的s蛋白的重复循环导致s蛋白的胞内保留。α-冠状病毒和β-冠状病毒两者的s蛋白都包括errs(ujike等人journalof general virology(2016),97,1853–1864)。

13、β-冠状病毒的s蛋白，如mers-cov、sars-cov和sars-cov2的s蛋白，仅具有errs，并且不可以胞内保留，从而导致s蛋白释放到质膜中。缺少errs的突变sars-cov s蛋白被转运至质膜，而天然s蛋白在与m蛋白共表达时，会在出芽位点附近与m蛋白相互作用，从而导致s蛋白胞内保留，这表明sars-cov的errs通过与m蛋白相互作用促进s蛋白在后内侧高尔基体区室中的特异性积累，从而导致s蛋白引入vlp(ujike等人.journal of general virology(2016),97,1853–1864)。最近发现移除errs将有助于sars-cov-2s蛋白向慢病毒假病毒中的掺入(ou等人.,2020nature communications volume 11,article number:1620)。

14、yu等人.(2020science)构建了一组原型dna疫苗，其表达具有胞质尾和跨膜结构域的各种缺失的sars-cov-2s蛋白的六种变体，并评价了它们在恒河猕猴中对sars-cov-2病毒攻击的免疫原性和保护效力。尽管sars-cov-2s蛋白胞外结构域的可溶性片段引起sgmrna水平的降低(指示病毒复制)，但通过全长s蛋白免疫原实现了最佳保护。

15、broer等人.(2006j.virol.1302–1310页)使用sars-cov s假型反转录病毒(sarspp)研究s蛋白的跨膜和细胞质结构域在sars-cov的感染性和膜融合活性中的作用。sarspp，其中s的胞质结构域被来自水泡性口炎病毒g蛋白(vsv-g)的胞质结构域替换，具有传染性，是野生型的高达40％。相反，同时含有tmd和vsv-g细胞质结构域的sarspp的传染性严重受损(＜5％)。这显示s的tmd可能参与sars-cov的进入过程。

16、疫苗接种通过在感染前诱导受试者对可能的病原体产生免疫应答来提供对抗疾病的保护。通常，这是通过使用活减毒或完全灭活形式的传染剂作为免疫原来实现的。为了避免使用完整病毒(如灭活或减毒病毒)作为疫苗的危险，病毒蛋白或亚基或其重组形式已被用作疫苗。使用天然或重组病毒蛋白作为疫苗试剂的主要障碍是确保蛋白质的构象模拟其在自然环境中的抗原。合适的佐剂，以及就肽来说，载体蛋白可用于增强免疫应答。此外，作为疫苗的病毒蛋白或亚基可以主要引发体液反应，因此无法激发持久的免疫性。亚基疫苗可以对其中可以证实完整灭活病毒可提供优越保护的疾病无效。

17、病毒样颗粒(vlp)可用于免疫原性组合物以表达具有改善的向免疫系统的抗原递呈的优选构象的病毒蛋白。vlp非常类似于成熟病毒粒子，但是它们不含病毒基因组材料，并且它们是非复制性的，这使它们作为疫苗施用是安全的。另外，vlp可以工程化以在vlp表面上表达病毒糖蛋白，这是它们天然的生理学构象。由于vlp类似完整病毒颗粒并且是多价颗粒结构，因此vlp在诱导对糖蛋白的中和抗体时可以比可溶性包膜蛋白抗原更有效。

18、多种表达系统已被用于生产vlp，包含哺乳动物细胞系、细菌、昆虫细胞株、酵母和植物细胞。已在昆虫和哺乳动物系统中产生了用于疫苗目的的30多种不同病毒的vlp(noad,r.and roy,p.,2003,trends microbiol11:438-44)。vlp还已在植物中产生(参见wo2009/076778；wo2009/009876；wo 2009/076778；wo 2010/003225；wo 2010/003235；wo2010/006452；wo2011/03522；wo 2010/148511；wo2014153674和wo2012/083445)。

19、已使用来自严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov或sars-cov-1)的天然表面蛋白生产vlp，包含在昆虫细胞和哺乳动物细胞中的s蛋白、m蛋白、e蛋白(liu等人.,2008,jvirol.,11318–11330页)。sars-cov-2病毒样颗粒(vlp)也已通过在哺乳动物细胞中共表达病毒表面蛋白s、m和e来组装(xu等人.front.bioeng.biotechnol.,2020年7月30日)。研究进一步显示m蛋白对于病毒样颗粒(vlp)形成是不可缺少的(siu等人.journal ofvirology(2008)82:11318–11330，huang等人.journal of virology(2004)78:12557–12565)。在哺乳动物细胞中，膜蛋白(m)和小包膜蛋白(e)的表达对于sars-cov-2vlp的有效形成和释放是必需的(xu等人.front.bioeng.biotechnol.,2020年7月30日)。尽管如此，组装sars-cov vlp的最低要求仍然存在争议。y.huang等人.(journal of virology(2004)78:12557–12565)描述了在感染的人细胞中vlp的形成仅需要m和n病毒蛋白的共表达，而siu等人.(journal of virology(2008)82:11318–11330)显示e和n蛋白两者都必须与m蛋白共表达才能在感染的哺乳动物细胞中有效产生和释放sars-cov vlp。

20、wo2012/083445公开了在植物中sars cov s蛋白的产生，其中s蛋白的跨膜结构域和胞质尾结构域(tm/ct)被流感ha蛋白的tm/ct替换。

21、一些研究组提出用sars-cov vlp免疫作为有效疫苗策略。在这些研究中使用了昆虫细胞中产生的vlp或哺乳动物细胞中产生的嵌合mhv/sars-cov vlp(lokugamage等人vaccine 2008年2月6日；26(6):797-808，lu等人.2007immunology 122496-5024)。

22、然而，sars-cov-2vlp在其数量可满足全球人口广泛接种疫苗的需要的情况下的有效放大和生产需要有效的病毒结构蛋白和vlp生产。

技术实现思路

1、本发明涉及经修饰的病毒结构蛋白。本发明还涉及包括经修饰的病毒结构蛋白的病毒样颗粒(vlp)以及在宿主或宿主细胞中生产vlp的方法。更具体地，本发明涉及经修饰的冠状病毒s蛋白。本发明还涉及包括经修饰的s蛋白的病毒样颗粒(vlp)以及在宿主或宿主细胞中生产vlp的方法。

2、在一个方面，提供了经修饰的冠状病毒s蛋白，其依次包括：

3、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

4、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

5、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

6、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白。

7、如本文所述的经修饰的s蛋白可形成三聚体。因此，还提供了包括如本文所述的经修饰的冠状病毒s蛋白的三聚体。

8、在另一个方面，提供了病毒样颗粒(vlp)，其包括经修饰的s蛋白或包含如上所述的经修饰的s蛋白的三聚体。因此，所述vlp包括经修饰的冠状病毒s蛋白或包括所述经修饰的s蛋白的三聚体，所述经修饰的s蛋白包括：

9、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

10、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

11、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

12、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白。

13、所述vlp还可以包含植物脂质。

14、所述tm可直接融合至所述ct。所述tm可以来源于冠状病毒s蛋白tm，且所述ct可以来源于流感ha蛋白ct。此外，所述tm可以是包含来源于所述冠状病毒s蛋白tm的n末端序列和来源于所述流感ha蛋白tm的c末端序列的嵌合tm。所述嵌合tm可包括来源于所述冠状病毒s蛋白tm的n末端序列，所述n末端序列包括对应于seq id no：18或seq id no：169是氨基酸1-20的至少20个氨基酸，或对应于seq id no：118或164的氨基酸1-21的至少21个氨基酸，或对应于seq id no：123的氨基酸1-22的至少22个氨基酸，和来源于所述流感ha蛋白tm的c末端的一个或多于一个氨基酸。来源于所述流感ha蛋白tm的c末端的一个或多于一个氨基酸可选自agl或agl的保守替换、magl或magl的保守替换。所述嵌合tm可包括对应于seqid no：18的氨基酸1-20的氨基酸。

15、所述ct可以是包含来源于所述冠状病毒s蛋白ct的n末端序列和来源于所述流感ha蛋白ct的c末端序列的嵌合ct。所述嵌合ct可包括来源于所述流感ha蛋白ct的c末端序列，所述c末端序列包括对应于seq id no：18、126、127、128、129、130或131的氨基酸27-37的至少11个氨基酸，和来源于所述冠状病毒s蛋白ct的n末端的一个或多于一个氨基酸。来自冠状病毒s蛋白ct的n末端的一个或多于一个氨基酸可以选自c或c的保守替换、cc或cc的保守替换或者ccm或ccm的保守替换。所述嵌合ct可包括对应于seq id no：18、126、128、129、130或131的氨基酸27-37的氨基酸；或seq id no：127的氨基酸27-36。在一个方面，所述嵌合tmct可包括嵌合tm及嵌合ct，所述嵌合tm包括对应于seq id no：18或seq id no：169的氨基酸1-20的氨基酸，或对应于seq id no：118或seq id no：164的氨基酸1-21的氨基酸，或对应于seq id no：123的氨基酸1-22的氨基酸，所述嵌合ct包括对应于seq id no：18、126、127、128、129、130或131的氨基酸27-37的氨基酸；或其组合。

16、所述ct或所述ct的一部分可包括与seq id no：15，或与seq id no：6、8、7、9、10、12、13或14的氨基酸35-50，或与seq id no：11的氨基酸34-49，或与seq id no：3的氨基酸553-568，或与seq id no：18的氨基酸22-37，或与seq id no：19的氨基酸21-40，或与seqid no：37的氨基酸21-39，或与seq id no：38的氨基酸25-36，或与seq id no：39的氨基酸24-34，或与seq id no：126、128、129、130或131的氨基酸22-37，或与seq id no：127的氨基酸22-36的序列的80％至100％的同一性。所述tm或所述tm的一部分可包括与seq id no：132或133的序列的80％至100％的同一性。

17、所述tmct可包括与下列序列具有约80％至约100％的同一性的序列：seq id no：18、19、37、38、39、64、126、127、128、129、130、131、118、119、120、123、124、125、134、135、164、165、166、169、170、171、172或173。

18、所述经修饰的s蛋白可包含s1亚基和s2亚基，其中所述s2亚基包括所述嵌合tmct。

19、所述经修饰的s蛋白可作为前体蛋白产生，所述前体蛋白包括所述经修饰的s蛋白和信号肽。包括所述经修饰的s蛋白和信号肽的前体蛋白可包括与seq id no：1的氨基酸1-1234，或与seq id no：5的氨基酸1-1234，或与seq id no：21的氨基酸1-1219，或与seq idno：30的氨基酸1-1243的80％至100％的同一性，并且其中所述ct的氨基酸序列包括与seqid no：15，或与seq id no：6、8、7、9、10、12、13或14的氨基酸35-50，或与seq id no：11的氨基酸34-49，或与seq id no：3的氨基酸553-568的序列的80％至100％的同一性。

20、所述信号肽对于所述s蛋白可以是天然或非天然。所述非天然的信号肽可以来源于蛋白二硫键异构酶(pdi)的信号肽。所述经修饰的s蛋白还可包括植物特异性n-聚糖。

21、所述经修饰的s蛋白中的所述ct或所述ct的一部分可以来源于流感血球凝集素(ha)蛋白，其来源于乙型流感或h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16亚型流感。流感血球凝集素(ha)蛋白可以来源于乙型流感或h1、h3、h5、h6、h7或h9亚型流感。

22、经修饰的s蛋白的胞外结构域可来源于sars-cov-2、sars-cov-1、mers-cov、oc43-cov或229e-cov，所述tm或所述tm的一部分可以来源于sars-cov-2、sars-cov-1、mers-cov、oc43-cov或229e-cov，或所述胞外结构域和所述tm或所述tm的一部分两者可以来源于sars-cov-2、sars-cov-1、mers-cov、oc43-cov或229e-cov。

23、在另一个方面，与野生型冠状病毒氨基酸序列相比时，所述经修饰的s蛋白可包括一个或多于一个氨基酸替换。所述一个或多个一个替换可以将s蛋白维持在融合前状态。

24、所述一个或多于一个氨基酸替换可包括：i)限制在s1与s2亚基之间的切割位点处的加工的替换；ii)一个或多于一个氨基酸替换为一个或多于一个脯氨酸，或iii)限制在s1与s2亚基之间的切割位点处的加工的替换和一个或多个氨基酸替换为一个或多个一个脯氨酸。

25、当与在宿主或宿主细胞中表达的不具有一个或多于一个替换的相应s蛋白的得率相比时，在宿主或宿主细胞中表达时，所述一个或多于一个替换将s蛋白维持在融合前状态或产生更高得率的经修饰的s蛋白。

26、当与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，所述一个或多于一个氨基酸替换可对应于在位置667、668、670、802、923、927、971、972处或其组合的氨基酸。

27、在一个方面，与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，所述一个或多于一个氨基酸替换对应于在位置971和972处的氨基酸。在另一个方面，与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，所述一个或多于一个氨基酸替换对应于在位置802、927、971和972处的氨基酸。此外，与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，所述经修饰的s蛋白可包括对应于在位置667、668、670处或其组合的氨基酸的一个或多于一个氨基酸替换。因此，与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，所述经修饰的s蛋白可包括对应于在位置667、668和670处的氨基酸的替换。

28、在一个方面，与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，所述一个或多于一个替换可对应于在位置667、668、670、971和972处的氨基酸。对应于在seq id no：2的位置667处的氨基酸的氨基酸替换可以是甘氨酸或甘氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置668的氨基酸的替换可以是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置670的氨基酸替换可以是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置971处的氨基酸的氨基酸替换可以是脯氨酸或脯氨酸的保守替换，并且对应于seq id no：2的位置972处的氨基酸的氨基酸替换可以是脯氨酸或脯氨酸的保守替换。与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，如上所述的经修饰的s蛋白还可以包括对应于位置923处的氨基酸的氨基酸替换。

29、在另一个方面，当与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，所述一个或多于一个氨基酸替换可对应于位置667、668、670、802、927、971和972处的氨基酸。对应于在seq idno：2的位置667处的氨基酸的氨基酸替换可以是甘氨酸或甘氨酸的保守替换，对应于seqid no：2的位置668的氨基酸的替换可以是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置670的氨基酸的替换可以是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置802处的氨基酸的氨基酸替换可以是脯氨酸或脯氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置927处的氨基酸的氨基酸替换可以是脯氨酸或脯氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置971处的氨基酸的氨基酸替换可以是脯氨酸或脯氨酸的保守替换，并且对应于seqid no：2的位置972处的氨基酸的氨基酸替换可以是脯氨酸或脯氨酸的保守替换。

30、在另一个方面，与seq id no：2的参考氨基酸序列相比时，如上所述的经修饰的s蛋白还可以包括对应于位置923处的氨基酸的氨基酸替换。对于氨基酸在经修饰的s蛋白中的替换，对应于seq id no：2的位置667处的氨基酸的氨基酸替换可以是甘氨酸或甘氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置668处的氨基酸的替换可以是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置670的氨基酸的替换可以是丝氨酸或丝氨酸的保守替换，对应于seq id no：2的位置802、927、971和972处的氨基酸的氨基酸替换可以是脯氨酸或脯氨酸的保守替换，并且对应于seq id no：2的位置923的氨基酸替换可以是苯丙氨酸或苯丙氨酸的保守替换。

31、所述经修饰的s蛋白可具有与以下各项80％至100％的同一性：seq id no：5、21、30、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、95、96、97、108、109、110、144、145、146、155、156或157的序列，或与seq id no：47的氨基酸24-1259，seq id no：48的氨基酸25-1259，seq id no：49的氨基酸25-1259，seq id no：50的氨基酸25-1259，seq id no：51的氨基酸25-1259，seq id no：52的氨基酸25-1259，seq id no：53的氨基酸25-1259，seqid no：54的氨基酸25-1259，seq id no：55的氨基酸25-1259，seq id no：56的氨基酸25-1259，seq id no：57的氨基酸25-1259，seq id no：58的氨基酸25-1259，seq id no：59的氨基酸25-1262，seq id no：60的氨基酸25-1261，seq id no：61的氨基酸25-1258，或seq idno：62的氨基酸25-1256，seq id no：95的氨基酸25-1243，seq id no：96的氨基酸25-1240，seq id no：97的氨基酸25-1243，seq id no：108的氨基酸25-1341，seq id no：109的氨基酸25-1338，seq id no：110的氨基酸25-1341，或seq id no：144的氨基酸25-1351，seq idno：145的氨基酸25-1348，seq id no：146的氨基酸25-1351，seq id no：155的氨基酸25-1159，seq id no：156的氨基酸25-1156，或seq id no：157的氨基酸25-1159的80％至100％的同一性。

32、在另一个方面，提供了核酸，其包括编码如上所述经修饰的s蛋白的核苷酸序列。

33、在另一个方面，提供了组合物，其包括有效剂量的经修饰的s蛋白，包含所述经修饰的s蛋白的三聚体或包括如上所述经修饰的s蛋白的vlp，和药物可用的载体、佐剂、媒介物或赋形剂。在另一个方面，提供了用于诱导免疫应答的疫苗。所述疫苗包括有效剂量的经修饰的s蛋白、包括所述经修饰的s蛋白的三聚体或包括如上所述经修饰的s蛋白的vlp。

34、所述组合物还包含药物可用的载体、佐剂、媒介物或赋形剂。在另一个方面，提供了用于诱导免疫应答的疫苗。所述疫苗包括有效剂量的vlp，所述vlp包括如上所述经修饰的冠状病毒。所述疫苗可以是多价疫苗，其包含vlp的混合物。

35、在另一个方面，提供了包括如上所述经修饰的s蛋白、三聚体或vlp的(非人)宿主或宿主细胞。在另一个方面，提供了包括如上所述vlp的宿主或宿主细胞。在另一个方面，提供了组合物，其包括有效剂量的包含如上所述经修饰的s蛋白的vlp。

36、在另一个方面，提供了s蛋白三聚体。所述三聚体包括经修饰的冠状病毒s蛋白，所述经修饰的s蛋白包括：

37、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

38、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

39、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

40、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白。如上所述，在与野生型冠状病毒氨基酸序列相比时，所述三聚体中的经修饰的s蛋白可包括一个或多于一个氨基酸替换。在另一个方面，提供了组合物，其包括有效剂量的如上所述的三聚体，和药物可用的载体、佐剂、媒介物或赋形剂。在另一个方面，还提供了包括如上所述的三聚体的病毒样颗粒(vlp)。所述vlp还可以包含植物脂质。在另一个方面，提供了组合物，其包括有效剂量的包含如上所述的三聚体的vlp，并且提供了药物可用的载体、佐剂、媒介物或赋形剂。在另一个方面，提供了用于诱导免疫应答的疫苗。所述疫苗包括有效剂量的如上所述的三聚体。在另一个方面，提供了用于诱导免疫应答的疫苗。所述疫苗包括有效剂量的包含如上所述的三聚体的vlp。所述疫苗可以是多价疫苗，其包含vlp的混合物。在另一个方面，提供了非人宿主或宿主细胞，其包括三聚体或包含如上所述的三聚体的vlp。

41、在另一个方面，提供了用于在受试者中诱导对冠状病毒感染的免疫性的方法，所述方法包括施用如上所述的组合物或疫苗。所述组合物或疫苗可以一次施用至受试者，或者所述组合物或疫苗可以多次施用至受试者。所述组合物或疫苗可以作为初始剂量施用，并且可以在从施用初始剂量的1天至6个月之间施用一剂或多于一剂后续剂量。所述后续剂量可以在从施用初始剂量21天后施用。

42、在另一个方面，提供了使用如上所述的组合物或疫苗制备的抗体或抗体片段。

43、在另一个方面，提供了：a)在(非人)宿主或宿主细胞中生产病毒样颗粒(vlp)的方法，其包括：

44、a)将包括编码如上所述的经修饰的s蛋白的核苷酸序列的核酸引入非人宿主或宿主细胞；或提供包括含有编码如上所述的经修饰的s蛋白的核苷酸序列的核酸的非人宿主或宿主细胞，以及

45、b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述非人宿主或宿主细胞，从而产生所述vlp。

46、在其它步骤c)中，可以收获非人宿主或宿主细胞。

47、在另一个方面，提供了：b)在(非人)宿主或宿主细胞中提高冠状病毒s蛋白的生产得率的方法，其包括：

48、a)将包括编码如上所述的经修饰的s蛋白的核苷酸序列的核酸引入非人宿主或宿主细胞；或提供包括含有编码如上所述的经修饰的s蛋白的核苷酸序列的核酸的非人宿主或宿主细胞；以及

49、b)在允许由所述核酸编码的所述经修饰的s蛋白表达的条件下培养所述非人宿主或宿主细胞，借此与在类似或相同条件下表达未经修饰的s蛋白的宿主或宿主细胞相比，以更高得率产生所述经修饰的s蛋白。

50、在其它步骤c)中，可以收获非人宿主或宿主细胞。

51、在另一个方面，提供c)在(非人)宿主或宿主细胞中提高病毒样颗粒(vlp)的生产得率的方法，其包括：

52、a)将编码经修饰的冠状病毒s蛋白的核酸导入至非人宿主或宿主细胞，所述经修饰的冠状病毒s蛋白包括：

53、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

54、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

55、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

56、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白；

57、提供包括编码经修饰的s蛋白的核酸的非人宿主或宿主细胞，所述经修饰的s蛋白包括：

58、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

59、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

60、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

61、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白；以及

62、b)在允许由所述核酸编码的所述经修饰的s蛋白表达的条件下培养所述非人宿主或宿主细胞，借此与在相似或相同条件下表达未经修饰的s蛋白的宿主细胞的宿主中的vlp得率相比，以更高得率生产包括所述经修饰的s蛋白的vlp。

63、在另一个方面，提供了d)在(非人)宿主或宿主细胞中生产病毒样颗粒(vlp)的方法，其包括：

64、a)将编码经修饰的冠状病毒s蛋白的核酸导入至非人宿主或宿主细胞，所述经修饰的冠状病毒s蛋白包括：

65、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

66、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

67、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

68、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白；或

69、提供包括编码经修饰的s蛋白的核酸的非人宿主或宿主细胞，所述经修饰的s蛋白包括：

70、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

71、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

72、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

73、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白；以及

74、b)在允许所述核酸表达的条件下培养所述非人宿主或宿主细胞，从而产生所述vlp。

75、在另一个方面，方法a)、b)、c)或d)的vlp还可从宿主或宿主细胞中提取和纯化。所述宿主或宿主细胞可包括植物、植物细胞、真菌、真菌细胞、昆虫、昆虫细胞、动物或动物细胞。方法a)、b)、c)或d)的宿主或宿主细胞可以是植物、植物部分或植物细胞。

76、在另一个方面，提供了通过由a)、b)、c)或d)的方法产生的vlp。

77、此外，在另一个方面，提供了包括佐剂和病毒样颗粒(vlp)的组合物，所述vlp包括经修饰的冠状病毒s蛋白，所述经修饰的s蛋白包括：

78、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

79、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

80、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

81、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白，并且其中与seq id no：2所示的参考氨基酸序列相比时，所述经修饰的s蛋白还包括位置667、668、670、971和972处的替换。

82、在另一个方面，提供了包括病毒样颗粒(vlp)的组合物，所述vlp包括经修饰的冠状病毒s蛋白，所述经修饰的s蛋白包括：

83、来源于冠状病毒s蛋白的胞外结构域；

84、跨膜和胞质尾结构域(tmct)，其中所述tmct是嵌合tmct，其包括：

85、跨膜结构域(tm)，其中所述tm或所述tm的一部分来源于冠状病毒s蛋白，和

86、胞质尾(ct)，其中所述ct或所述ct的一部分来源于流感血球凝集素(ha)蛋白，；并且其中所述经修饰的s蛋白包括在位置667处的甘氨酸替换、在位置668处的丝氨酸替换、在位置670处的丝氨酸替换、在位置971处的脯氨酸替换和在位置972处的脯氨酸替换，所述位置对应于seq id no：2的参考氨基酸序列。所述流感血球凝集素(ha)蛋白可以来源于乙型流感或h1、h3、h5、h6、h7或h9亚型流感。所述组合物还可包含佐剂。

87、在另一个方面，提供了包括病毒样颗粒(vlp)的组合物，所述vlp包括经修饰的冠状病毒s蛋白，所述经修饰的s蛋白包括seq id no：21的序列。所述组合物还可包含佐剂。

88、本
技术实现要素：
不必需描述本发明的所有特性。