甲基丙烯酰胺蛋白质结合剂及其用途的制作方法

plpro)分别是egfr、布鲁顿酪氨酸激酶(bruton’styrosinekinase，btk)和k-rasg12c的基于丙烯酰胺的抑制剂。这样的不可逆抑制剂具有以下优点：非平衡动力学，完全靶占据，以及在不牺牲效能和选择性的情况下改变吸收、分布、代谢和排泄(adme)问题的结构的灵活性(29-31)。共价抑制剂的效率取决于最初与蛋白质的可逆结合以及随后与靶亲核体的共价键形成。前者取决于其可逆结合动力学，而后者取决于亲电体的反应性及其精确定位。丙烯酰胺的固有反应性主要取决于它们的胺前体的性质，该胺前体在不影响配体的可逆结合的情况下进行修饰是复杂的。11.此外，α位或β位的取代通常降低丙烯酰胺的反应性。在另一个方面，α位的吸电子基团(ewg)增加了丙烯酰胺的反应性，同时赋予共价键形成可逆性。丙烯酰胺反应性的可调性对于设计靶向共价抑制剂是重要的。最近，丙烯酰胺类似物诸如联烯酰胺(29)、炔烃(30)、炔基苯并噁嗪和二氢喹唑啉(31)已经被报导为共价反应性基团。然而，它们在它们的结构和几何形状上与丙烯酰胺显著不同，并且因此在不需要修饰可逆结合支架的情况下，反应性部分不能简单地转换。此外，本发明的甲基丙烯酰胺改善了对靶向蛋白质的效率(与已知的丙烯酰胺类似物相比)，并且此外，本发明的甲基丙烯酰胺具有可以用作靶向药物递送或用作荧光/化学发光探针的开启(turn)的释放化合物。12.本发明涉及在靶向共价抑制剂的背景下作为具有不同反应性的亲电弹头(electrophilicwarhead)的α取代的甲基丙烯酰胺。这些化合物与位点特异性标记内源性蛋白质的靶向亲核体形成共价键，随后可能有伴随的离去基团的释放(图1-图3)，诸如毒素、荧光探针、化学发光探针、放射性标记探针、药物或任何生物活性基团。本发明涉及共价配体导向释放(coldr)化合物，其为靶向共价抑制剂设计的工具箱提供了一种多功能的补充，并且能够修饰多种潜在的药物靶，如btk、k-rasg12c和sars-cov-2plpro不同的探针。13.概述14.在一种实施方案中，本发明提供由式i的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物：[0015][0016]其中：[0017]r是蛋白质结合配体，荧光、化学发光探针，放射性标记探针或生物活性基团；[0018]r1是包含蛋白质结合配体，荧光、化学发光探针，放射性标记探针或生物活性基团的释放基团；[0019]其中r和r1是不同的，并且r和r1中的至少一个是蛋白质结合配体；[0020]w是键、nh、o、ch2或接头；[0021]g是o或s；以及[0022]x是键或接头；[0023]其中，如果x是键，则r1经由酯键、酰胺键、酸酐键、氨基甲酸酯键、氧原子、硫原子或氮原子直接连接至主链结构。[0024]在一种实施方案中，本发明提供包含本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物的前药，其中r是蛋白质结合配体并且r1是药物或靶向抑制剂，其中，在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，药物或靶向抑制剂被释放。[0025]在一种实施方案中，本发明提供包含本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物的蛋白质传感器或蛋白质标记，其中r或r1是荧光探针或化学发光探针，其中，[0026]如果r是荧光探针或化学发光探针，并且r1是蛋白质结合配体；则在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，配体被释放，并且荧光或化学发光探针共价地附接至蛋白质，并且从而导致探针的荧光或化学发光的变化；或者[0027]如果r是蛋白质结合配体，并且r1是荧光探针或化学发光探针，则在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，荧光探针或化学发光探针被释放，并且蛋白质结合配体共价地附接至蛋白质，并且从而导致探针的荧光或化学发光的变化。[0028]在一种实施方案中，本发明提供包含本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物的蛋白质邻近诱导剂化合物，其中r是第一蛋白质的蛋白质结合配体，并且r1是第二蛋白质的另一蛋白质结合配体，其中，在第二蛋白质和其蛋白质结合配体之间相互作用时，r1被释放，并且然后第二蛋白质具有活性并且用r标记，诱导与第一蛋白质的新的相互作用。[0029]附图简述[0030]作为类似物化合物的主题及其用途在说明书的结论部分中被特别指出并且明确要求保护。然而，当与附图一起阅读时，关于组织和操作的方法两者的合成类似物化合物及其用途，连同其目的、特征和优点，可以通过参考以下详细描述被最好地理解，在附图中：[0031]图1：靶半胱氨酸与被取代的α-甲基丙烯酰胺通过coldr(共价配体导向释放)化合物的反应的示意图。a指的是蛋白质结合配体，并且b是荧光/化学发光/放射性标记的探针或生物活性基团，其中b在与蛋白质相互作用时释放。[0032]图2：靶半胱氨酸与被取代的α-甲基丙烯酰胺通过coldr(共价配体导向释放)化合物的反应的示意图。a指的是蛋白质结合配体，并且b是荧光/化学发光/放射性标记的探针或生物活性基团，其中a在与蛋白质相互作用时释放。[0033]图3：使用coldr化学和随后的用于光子发射的离解途径，通过btk开启化合物3k的化学发光的机制。ibr指的是以下结构(伊布替尼衍生物)：[0034][0035]图4a-图4d：gsh反应性与离去基团的pka相关。图4a：示例性lc色谱图示出对1g与gsh在30min(蓝色)和48h(绿色)的反应的监测，gsh加合物：保留时间(rt)＝4.3min，m/z＝480；香豆素：rt＝4.5min；参考：rt＝4.8min；1g：rt＝5.3min；m/z＝332。图4b：gsht1/2相对于质子化离去基团的pka(对于胺pkb；对于1j，使用碳酸的pka)。图4c：1g的荧光强度作为以不同的gsh浓度的孵育时间的函数。图4d：以固定的gsh浓度(5mm)，ph对通过1g的香豆素释放和荧光的影响。[0036]图5：随着gsh浓度变化而变化的香豆素荧光。香豆素的固有荧光(ex/em＝385/435nm)在ph降低时，随着gsh浓度的增加而降低。从1g释放的香豆素的荧光初始随着更多的硫醇释放香豆素而增加，但然后随着固有荧光减少而减少。[0037]图6：随着时间变化而变化的100μm1g与gsh(0.5mm、1mm和5mm)的反应。gsh加合物的归一化％通过lc/ms定量。这示出香豆素的释放不随着gsh浓度的增加而减少，而是仅随着荧光(图5)。[0038]图7：ph对24小时之后5mmgsh与100μm1g的反应的影响。[0039]图8a-图8b：α-甲基丙烯酰胺示出不同的蛋白质组反应性。图8a：模型亲电炔烃探针的化学结构。图8b：用炔烃探针的原位蛋白质组标记。mino细胞用dmso、ia-炔烃或2a-2c处理持续2h，然后裂解，用tamra-叠氮化物“点击”，并且经由凝胶内荧光成像。[0040]图9：通过在ph8将5mmgsh添加至100μm的1g和2a中的任一种来触发香豆素的释放，示出几乎相同的释放速率。[0041]图10a-图10e：作为潜在抑制剂的伊布替尼的α取代的衍生物：图10a：伊布替尼衍生物的化学结构。图10b：时间进程lc-ms结合测定(在室温2μm化合物和2μmbtk)。图10c：使用野生型btk(0.6nmbtk，5μmatp)的体外激酶活性测定。图10d.伊布替尼衍生物的gsh半衰期(t1/2)与测量的ic50不相关。图10e.抗igm诱导的活化和用伊布替尼类似物处理持续24h之后b细胞反应的剂量依赖性抑制。[0042]图11a-图11i：使用coldr化学开启荧光探针。图11a-图11c.分别用于btk、egfr和k-rasg12c的开启荧光探针的结构。图11d-图11f.在ex/em＝385/435nm处测量的荧光强度(代表香豆素部分的释放)的时间依赖性。绿色曲线示出化合物本身(2μm)不发荧光。橙色曲线示出蛋白质本身(2μm)也不发荧光。只有当探针和靶混合时(蓝色曲线)，它才示出荧光的增加。图11g-图11i.与3j、4b和5a孵育的btk、egfr和k-rasg12c在每个板读取器测量结束时的解卷积lc/ms光谱。加合物质量对应于香豆素部分被释放的标记事件，验证了所提出的机制。对于btk(d)，用3j完成伊布替尼的可逆形式ibr-h(2μm；0.5h预孵育；图10a)(红色曲线)。这大幅减缓了香豆素的释放和对应的荧光的增加。[0043]图12：3j与低当量的btk的孵育(1μmbtk；50nm3j；ex/em＝385/435nm)示出了可检测的荧光的增加，但大幅减缓了反应，达到可以观察到初始动力学的点。[0044]图13a-图13b：用3j开启荧光(ex/em＝385/435nm)的时间依赖性。图13a：10μmbsa与2μm3j未示出反应，指示探针选择性。图13b：与2μm3j一起的用iaa完全标记的2μmbtk(红色)相比2μm未标记的btk(蓝色)。标记的btk缺乏信号指示荧光是由游离半胱氨酸触发的。[0045]图14：两种阿法替尼类似物4a和4b的egfr激酶活性测定。[0046]图15a-图15d：化学发光btk探针允许高通量筛选btk抑制剂。图15a.化学发光探针3k的结构；图15b：发光信号(代表化学发光部分的释放)的时间依赖性。化合物本身(2μm；绿色)不发光。蛋白质本身(2μm；橙色)也不发光。只有当探针和靶混合时(蓝色)，它才示出发光的增加。btk与伊布替尼的可逆形式ibr-h的预孵育(2μm；0.5h；红色)抑制发光。图15c：使用3k的hts中％btk结合抑制的示意性总结示出与非激酶抑制剂相比，文库中结合btk的已知激酶抑制剂的富集。图15d：hts中％btk结合抑制的总体视图。红色为已知激酶抑制剂，并且绿色为已知btk抑制剂。[0047]图16a-图16c：图16a：与毒素和化学治疗化合物连接的伊布替尼和阿法替尼衍生物的结构。图16b：lc-ms色谱图示出与btk反应之后coldr化学释放货物。c.阿法替尼衍生物的激酶活性。[0048]图17a-图17c：图17a：配体导向位点选择性标记酶的机制。图17b：伊布替尼附接的小分子探针的结构。图17c：使用lc-ms，用炔烃化合物、不具有配体的荧光且无铜的炔烃化合物标记btk。d.伊布替尼、7d和7f的b细胞活化。[0049]图18a-图18c：图18a.phic分子和加炔烃标签的nedd4抑制剂的结构。图18b.lc-ms示出用phic分子标记btk，消除ibr。[0050]图19呈现在存在btk(2μm)、kras(2μm)、btk+伊布替尼、btk+ibr-h的情况下，化合物7m的荧光开启结果，由此提供开启荧光，并且可以用于标记细胞中的btk并且使其保持在活性形式。[0051]图20a呈现细胞中的btk活性不受(7d)和(7f)的抑制。mino细胞用0.1％dmso、1μm伊布替尼-nh、1μm伊布替尼-共价、100nm(7d)或100nm(7f)处理持续1小时。样品中的一半用冷pbs洗涤×3次。用10μg/ml抗人igm诱导btk活性持续5min，将细胞收获，裂解，并且然后将50μg的裂解物装载在4％-20％bis-tris凝胶上。呈现了磷酸btk和总btk的免疫印迹。[0052]图20b呈现使用7f的btk半衰期计算。将mino细胞用100nm7f孵育持续1小时以脉冲标记btk，用冷pbs洗涤×3次，并且用新鲜培养基重悬。在指示的时间点处收获细胞的样品。将细胞裂解，点击至tamra-叠氮化物，并且使用typhonfla9500扫描仪在532nm处成像。用imagej定量btk水平，并且计算半衰期。[0053]图21呈现btk标记探针的合成方案。[0054]图22a-图22f呈现使用coldr化学的btk的位点选择性标记。图22a-具有多种功能性探针的伊布替尼附接的甲基丙烯酰胺的化学结构。图22b-btk(2μm)与7n(2μm)在25℃的ph820mmtris缓冲液中的反应的典型实例。图22c-解卷积lc/ms光谱，示出bodipy探针的标记，并且展示ibr-h离去。图22d-在25℃的ph820mmtris缓冲液中在10min、30min和120min用探针(7c、7d、7k、7f、7e、7m、7n、7o、7q、7r、7s；2μm)标记btk(2μm)的％。图22e-将btk(2μm)添加至在37℃的ph820mmtris缓冲液中的7m(2μm)时，在ex/em＝550/620nm处测量的荧光强度的增加的动力学(n＝4)(蓝色)。无btk的对照实验(红色)，在添加7m之前预孵育伊布替尼(4μm)和ibr-h(4μm)(分别为绿色和橙色)以及将k-rasg12c与7m孵育(粉色)未示出荧光。图22f-在荧光测量结束时用7m孵育的btk的解卷积lc/ms光谱(在22e中示出)。加合物质量对应于ibr-h部分被释放的标记事件，验证了所提出的机制。[0055]图23a-图23e呈现用还原的gsh的反应验证了配体的消除，并且证明了它们的固有硫醇反应性在母体丙烯酰胺的2倍内。图23a-gsh与7n在10℃的ph8100mmpbs缓冲液中的反应的典型实例。图23b-示例性lc色谱图示出对7n(100μm)与gsh(5mm)在0h(蓝色)和8h(绿色)的反应的监测，gsh加合物：保留时间(rt)＝5.17min，m/z＝707；ibr-h：rt＝5.0min；参考：rt＝5.60min；7n；rt＝5.38min；m/z＝786。测量的uv吸收在220nm-400nm之间。图23c-，在100μm化合物和5mmgsh之间在37℃的ph8pbs缓冲液中持续8h的反应中ibr-h衍生物(7d、7f7e、7m、7n、7q、7r和7s)的消耗率(n＝2)。d.图23d-在100μm7n和5mmgsh之间在37℃的ph8pbs缓冲液中的反应中，ibr-h、gsh加合物的lc-ms(吸收220nm-400nm)中的形成速率以及7n的消耗(n＝2)。图23e-所有探针和伊布替尼的gsht1/2。[0056]图24a-图24g呈现多种靶蛋白质的选择性标记。图24a、图24b、图24c-分别用于btk、k-rasg12c和sars-cov-2plpro的炔烃/酯标记的结构。图24d-在25℃的ph820mmtris中用7g(2μm)孵育10min的btk(2μm)的解卷积lc/ms光谱。图24e-在37℃的ph820mmtris中用7h(100μm)孵育16h的k-rasg12c(10μm)的解卷积lc/ms光谱。图24f-在25℃的ph850mmtris中用7t(10μm)孵育16h的plpro(2μm)的解卷积lc/ms光谱。加合物质量对应于配体被释放的标记事件。图24g-依沃卢替尼(evobrutinib)炔烃7g、7h和7t的合成路线。[0057]图25a-图25e呈现用coldr探针标记btk不抑制其在细胞中的活性。图25a.与mino细胞孵育2h之后7d、7f和7n以及在mino细胞裂解物中7e的细胞标记概况。7d和7f样品在成像之前，进一步与裂解物中的tamra-叠氮化物反应。箭头指示btk的mw。图25b.在成像之前，在用100nm探针孵育mino细胞，随后与裂解物中的tamra-叠氮化物进行点击反应之后，使用btk的7f的时间依赖性标记概况。图25c.7d、7v，7f和7n与伊布替尼的竞争实验。将细胞用0.1％dmso或1μm伊布替尼预孵育持续30min，随后用200nm7d、7f或者100nm7v、7n孵育2h。图25d.将mino细胞用0.1％dmso、7d(100nm)孵育，或者用伊布替尼(1μm)预孵育然后用7d(100nm)孵育。将样品进一步与裂解物中的生物素-叠氮化物反应，随后进行富集、胰蛋白酶消化和通过lc/ms/ms的肽鉴定。7d相对于dmso富集的蛋白质的log(倍数比)被绘制为统计学显著性的函数。btk被清楚地鉴定为最富集的靶，指示了对应于通过凝胶内荧光鉴定的条带的另外的突出的靶(图25c)。图25e.如通过btk的自磷酸化测量的mino细胞中的btk活性测定。将细胞用0.1％dmso、1μm伊布替尼、1μmibr-h或者100nm7d、7f、7m或7n孵育持续1h。在通过抗igm诱导btk活性之前，洗涤或不洗涤细胞。图25f.btk活性测定：将mino细胞用dmso、1μm7d、7f、7n和7m孵育持续2h，洗涤，并且然后用伊布替尼(100nm)孵育持续45min。在通过抗igm诱导btk活性之前，再次洗涤细胞。coldr探针能够从伊布替尼的抑制中拯救btk活性。图25g.用增加剂量的伊布替尼、7d或7f处理24h之后由抗igm诱导的原代b细胞活化未示出coldr探针的抑制。[0058]图26a-图26f呈现btk半衰期的测量。图26a.使用7f的btk的半衰期测量。将mino细胞用100nm7f脉冲标记持续1h，并且然后洗涤以去除过量的探针。在指示的时间点处收获细胞，并且使裂解物与tamra-叠氮化物反应。定量btk的信号，并且计算半衰期。图26b.使用20μg/ml环己酰亚胺，用环己酰亚胺(chx)测定进行的btk的半衰期测量。图26c.mino细胞(7f：n＝3，chx：n＝4)中a和b中btk水平的定量(通过对蛋白质浓度的归一化)。图26d.通过两种方法计算的半衰期，呈现为平均值±sd。图26e.使用protac9d，用7m标记的btk的降解。将mino细胞用7m(100nm)孵育，并且然后洗涤以去除过量的探针，并且再次用protac9d以0.5μm和1μm孵育持续2h，并且然后裂解。使样品经受凝胶内荧光(fl)和蛋白质印迹(wb)。图26f.图26e中btk水平的定量(对于蛋白质印迹已经进行对β-肌动蛋白的归一化)。[0059]图27呈现制备protac的合成方案。[0060]图28呈现检测与btk的结合事件的开启荧光环境敏感探针。图28a-在存在/不存在btk(2μm)的情况下，7m(2μm)的荧光光谱扫描。插图示出归一化荧光光谱，其中明显存在蛋白质结合时峰的偏移。图28b-在添加过量配体(伊布替尼和ibr-h)之后，荧光的剂量依赖性减少，以及btk标记的7m的峰值发射的偏移。图28c-当用btk(2μm)孵育时，7n(2μm)的荧光强度的三倍增加，以及在添加过量配体之后荧光的减少。图28d-在添加btk(2μm)随后添加伊布替尼和ibr-h之后，7e(2μm)的荧光强度的变化。图28e-用多种btk结合剂孵育的btk标记的7m(2μm)的荧光扫描示出650/620发射比的超过2.5倍变化。图28f-btk抑制剂引起btk-7m的荧光的显著猝灭。[0061]图29呈现coldr探针标记不影响配体结合。图29a.用于标记spr芯片的基于伊布替尼的可逆化合物的结构。图29b-图29d.以不同浓度的(29b)btk、(29c)btk-7d和(29d)btk-伊布替尼的表面等离子体共振(spr)传感图。图29e.btk和btk-1b的缔合动力学参数(ka)和离解常数(kd)。se＝标准误差。[0062]图30：呈现了通过coldrprotac诱导的降解的测量。图30a.使用coldrprotac的靶降解的示意性图示。图30b.基于coldr的btkprotac的结构。图30c.在37℃的ph820mmtris缓冲液中btk(2μm)用9a-9c(2μm)的体外标记。图30d.在孵育24h之后，对不同浓度的9c反应的mino细胞中btk水平的蛋白质印迹评价。图30e.通过对mino细胞中β-肌动蛋白持家基因的归一化，图30d中btk水平的定量。通过使用prism软件将数据拟合至二阶多项式来计算dc50和d最大。图30f.在用btkprotac处理持续24h之前，将mino细胞用伊布替尼/沙利度胺-oh或dmso预处理持续2h(n＝2)。随后，经由蛋白质印迹测量btk水平。图30g.将mino细胞以4次重复用0.1％dmso或9c(500nm)处理持续24h。使裂解物经受胰蛋白酶消化和通过lc/ms/ms的肽鉴定。相对于9c处理的样品的dmso样品中富集的蛋白质的log2(倍数比)被绘制为统计学显著性的函数。显著降解的蛋白质用红色指示，并且定义为log2(dmso/9c)》1和p-值《0.01。[0063]图31a-图31f：呈现荧光标记不抑制活性位点结合和三元复合物形成。图31a.用coldr探针标记的蛋白质随后用protac降解的示意性图示。图31b.可逆protac9d的结构。图31c、图31d、图31e.将mino细胞用7n处理持续1h，洗涤并且用不同浓度的9d孵育。使用凝胶内荧光(图31c和图31e)和蛋白质印迹(图31d)测量降解。图31f.使用蛋白质印迹测量以50nm、100nm、500nm的9d的btk降解。[0064]将理解，为了说明的简单和清楚，在图中示出的要素不一定按比例绘制。此外，在认为合适的情况下，附图标记可以在附图中被重复以指示对应的要素或类似的要素。[0065]详述[0066]本发明涉及在靶向共价抑制剂的背景下作为具有不同反应性的亲电弹头的α取代的甲基丙烯酰胺化合物。[0067]本发明的α取代的甲基丙烯酰胺化合物是共价配体导向释放(coldr)化合物，其具有(1)蛋白质结合配体和(2)荧光、化学发光、放射性标记的探针或任何生物活性基团；其中，基于共价配体导向释放(coldr)化合物的设计，[0068]蛋白质结合配体与蛋白质共价地连接，并且荧光、化学发光或放射性标记的探针或任何生物活性基团在与蛋白质结合时被释放；或者[0069]荧光、化学发光或放射性标记的探针或任何生物活性基团与蛋白质共价地连接，并且蛋白质结合配体在与蛋白质结合时被释放。[0070]这些化合物与靶向蛋白质的亲核体经由加成-消除反应形成共价键，其随后可能有伴随的离去基团(即式i的化合物的r1)的释放。(图1-图3)。[0071]本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物可以用于调节选择性共价抑制剂、传感器、诊断剂的反应性，或者可以用作针对蛋白质的开启探针。[0072]在一种实施方案中，本发明涉及由式i的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物：[0073][0074]其中：[0075]r是蛋白质结合配体，荧光、化学发光、放射性标记的探针或生物活性基团；[0076]r1是包含蛋白质结合配体，荧光、化学发光、放射性标记的探针或生物活性基团的释放基团；[0077]其中r和r1是不同的，并且r和r1中的至少一个是蛋白质结合配体；[0078]w是键、nh、o、ch2或接头；[0079]g是o或s；以及[0080]x是键或接头；[0081]其中，如果x是键，则r1经由酯键、酰胺键、酸酐键、氨基甲酸酯键、氧原子、硫原子或氮原子直接连接至主链结构。[0082]在一种实施方案中，本发明涉及由式ia的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物：[0083][0084]其中：[0085]r是蛋白质结合配体，荧光、化学发光、放射性标记的探针或生物活性基团；[0086]r1是包含蛋白质结合配体，荧光、化学发光、放射性标记的探针或生物活性基团的释放基团；[0087]其中r和r1是不同的，并且r和r1中的至少一个是蛋白质结合配体；[0088]g是o或s；以及[0089]x是键或接头；[0090]其中，如果x是键，则r1经由酯键、酰胺键、酸酐键、氨基甲酸酯键、氧原子、硫原子或氮原子直接连接至主链结构。[0091]在一种实施方案中，本发明涉及由式ib的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物：[0092]1、mt1、ms023、sch772984、bay-1816032、fm-381、尼拉帕利(niraparib)、unc1215、sr-318、mrtx849、a-196、cct251236、jq1、ch5424802、at1、bay-598、ucsf7447、am-6761、vx-745、pfi-1、pfi-3、gsk4027、sgc0946、sgc707、eed226、bgj-398、blu9931、托法替布(tofacitinib)、gdc-0879、p505-15、pf-cbp1、amg900、skepinone-l、azd2014、gsk484、chir-99021、(r)-9s、ucsf4226、nvs-pak1-1、ei1、kzr-504、azd1152、sgx-523、cct241533、rg7388、vh298、pf-477736、bms-911543、ab680、bay1125976、gsk583、bi-2545、epz-5676、g-5555、a-395、gnf-5、洛米迪星(romidepsin)、epz011989、ulk-101、thpp-1、do264、bay-707、mz1、unc1999、wehi-539、nvp-aew541、thz1、amg-18、jnk-in-8、bibet、epz-6438、gsk-j4、cct244747、cpi-1612、ki-696、pf3644022、sgc-cbp30、tubacin、舍美替尼(selumetinib)、rapamycin、gsk591、ml323、abbv-744、ac220、他佐帕利(talazoparib)、pdd00017273、菲戈替尼(filgotinib)、a-485、rg7112、baz2-icr、mi-888、bmx-in-1、bi-9564、pf-3758309、bay-985、mcc950、unc2025、azd-6482、rgfp966、bistramidea、ogerin、i-brd9、i-cbp112、eleutherobin、gsk864、salvinorina、mli-2、ici-199441、bix-02188、奥拉帕利(olaparib)、a-1155463、wz4003、kh-cb19、tubastatina、amg176、ecf309、e7449、az191、bay-826、ro2468、abt-100、xmd8-87、ni-57、nms-p118、gw3965、ecf506、acy-738、bay-549、hg-9-91-01、wm-1119、t-26c、az6102、格列苯脲(glyburide)、培迪司他(pevonedistat)、gne7915、relacatib、巴非替尼(bafetinib)、匹替利司(pictilisib)、阿法替尼、ve-821、a-1210477、avl-292、xmd8-92、ruski-201、unc3866、mps1-in-1、gne-2861、sto609、az0108、i-bet151、bay-885、2-mt63、ddr1-in-1、epz020411、cpi-1205、tp-004、瑞格列奈(repaglinide)、l-moses、lxr-623、gsk-5959、cpi-637、gpr40ant39、unc0638、gsk2801、m-808、jak3i、cx-4945、rsl3、bay-299、cotransin、miv-6r、cp-673451、ac-4-130、lly-507、abpa3、tp-020、pf-4800567、englerina、lp99、jqez5、bi2536、agi-6780、ku-60019、ds-437、bms-265246、cmld-2、bi-d1870、agi-5198、wh-4-023、cortistatina、ni-42、bix-01294、tx1-85-1、cfi-400945、(r)-锌-3573、urmc-099、xav939、jw55、ttt20171、伊马替尼、dtrim24、mbm-55、mzp-54、tbk1protac3i、gne-049、wz4002、nct-505、sr9238、u18666a、niksmi1、tl13-112、gsk2982772、md-224、lnp-023、amg-337、mk-8033、azd3988、ru.521、dbet6、ars-1620、mlt-748、gdc-0834、lsn3213128、gsk2033、pt2385、adavosertib、vz185、gsk2194069、mg-277、tak-243、a-770041、gnf-5837、gsk2973980a、thal-sns-032、dtag-13、gne-781、eml631、qc6352、卡马替尼(capmatinib)、pf-06869206、bsj-03-123、阿西米尼(asciminib)、sb-612111或th1760、tp-024。[0112]如本文提及的“经批准的药物”是获得美国食品药品监督管理局、中国食品药品监督管理局、欧洲药品管理局或任何监管机构批准用于人类的任何化学实体。[0113]如本文提及的“毒素”和“细胞毒性剂”是具有非选择性细胞杀死活性的化合物。[0114]“化学治疗剂”的非限制性实例包括：放线菌素、全反式维甲酸、阿扎胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、硼替佐米、卡铂、卡培他滨、顺铂、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、阿糖胞苷、柔红霉素、多西他赛、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星、表柔比星、埃博霉素(epothilone)、依托泊苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、伊马替尼、伊立替康、氮芥(mechlorethamine)、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奥沙利铂、紫杉醇、培美曲塞、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、托泊替康(topotecan)、戊柔比星(valrubicin)、维罗非尼(vemurafenib)、长春碱、长春新碱或长春地辛。[0115]“放射性标记探针”或“放射性药物”分别包括具有放射性同位素的任何探针或药物。放射性药物的非限制性实例包括：177lu-psma-617(镥lu177vipivotidetetraxetan)。177lupsma-617是靶向前列腺癌中前列腺特异性膜抗原(psma)的放射性标记药物。psma是一种膜结合糖蛋白，其在前列腺癌中过表达。镥-177一旦内化到细胞中，则不可逆地螯合在靶向肿瘤细胞内。它发出超过毫米范围的辐射，这对于根除癌细胞是理想的。治疗剂候选物通过与表达psma的癌细胞结合并且表现出细胞毒性而起作用。镥lu-177dotatate或镥(177lu)oxodotreotide(lutathera)：镥lu177dotatate与生长抑素受体结合，对于亚型2受体(ssrt2)具有最高的亲和力。在与表达生长抑素受体的细胞(包括恶性生长抑素受体阳性肿瘤)结合时，化合物被内化。来自lu177的β发射通过在生长抑素受体阳性细胞和邻近细胞中形成自由基来诱导细胞损伤。镭-223氯化物(xofigo)：镭ra223二氯化物的活性部分是发射α粒子的同位素镭-223，它模拟钙并且在骨转换(诸如骨转移)增加的区域与骨矿物质羟基磷灰石形成复合物。α发射体的高线性能量转移(80kev/微米)导致相邻细胞中高频率的双链dna断裂，导致对骨转移的抗肿瘤作用。来自镭-223二氯化物的α粒子范围小于100微米(小于10个细胞直径)，这限制了对周围正常组织的损伤。[0116]在一些实施方案中，本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物包含荧光、化学发光或放射性标记的探针。在其他实施方案中，荧光探针包括以下的非限制性实例：罗丹明、花青、香豆素、尼罗红(nilered)、尼罗蓝(nileblue)、丹酰(dansyl)、伞形酮(umberiferon)、氟硼荧(bodipy)、环境敏感荧光团或其衍生物。在其他实施方案中，化学发光探针包括基于二氧杂环丁烷的化合物，2,3-二氢酞嗪二酮诸如荧光素(luciferin)和鲁米诺(luminol)或其衍生物。在其他实施方案中，放射性标记探针包括具有放射性同位素的任何配体。[0117]在一些实施方案中，本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物包含蛋白质结合配体。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体包括任何基于丙烯酰胺或基于乙烯基砜或基于α,β不饱和羰基的蛋白质抑制剂或其类似物。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体包括阿法替尼、伊布替尼、依沃卢替尼、amg-510、plpro抑制剂或其衍生物。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是阿法替尼或珀齐替尼(poziotinib)或奥希替尼(osimertinib)或奈拉替尼(neratinib)，并且其靶向蛋白质是egfr。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是伊布替尼或泽布替尼(zanubrutinib)或依沃卢替尼或remibrutinib或司培卢替尼(spebrutinib)，并且其靶向蛋白质是btk或blk。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是amg-510或ars-1620或mrtx849，并且其靶向蛋白质是k-rasg12c。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是pf-06651600，并且其蛋白质靶是jak3。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是futibatinib或fiin1或fiin2或fiin3、prn1371，并且其蛋白质靶是fgfr。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是nu6300，并且其蛋白质靶是cdk2。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是thz1，并且其蛋白质靶是cdk7。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是thz531，并且其蛋白质靶是cdk12或cdk13。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是cnx-1351，并且其蛋白质靶是pi3kα。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是jnk-in-8(或其衍生物或类似物)，并且其蛋白质靶是jnk。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是mkk7-cov-3(或其衍生物或类似物)，并且其蛋白质靶是mkk7。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是cc-90003，并且其蛋白质靶是erk1或erk2。在另一种实施方案中，蛋白质结合配体的非限制性实例是e6201，并且其蛋白质靶是mek1。[0118]在一些实施方案中，本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物由式i、式ia、式ib或式ic的结构表示。在其他实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r1是释放基团，其中在蛋白质和共价配体导向释放(coldr)化合物的蛋白质靶配体之间相互作用时，r1被释放。在另一种实施方案中，如果r1是蛋白质结合配体，则r1的蛋白质结合配体被释放。[0119]在一些实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是蛋白质结合配体，并且r1是荧光、化学发光或放射性标记的探针。在另一种实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是蛋白质结合配体，并且r1是荧光、化学发光或放射性标记的探针，其中r1(荧光、化学发光或放射性标记的探针)在与蛋白质结合时释放，同时蛋白质结合配体与蛋白质共价地连接。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质的亲核部分和式i、式ia、式ib或式ic的化合物结构的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0120]在一些实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是蛋白质结合配体，并且r1是生物活性基团。在另一种实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是蛋白质结合配体，并且r1是生物活性基团，其中r1(生物活性基团)在与蛋白质结合时释放，同时蛋白质结合配体与蛋白质共价地连接。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质的亲核部分和式i、式ia、式ib或式ic的化合物结构的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0121]在一些实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是荧光、化学发光或放射性标记的探针，并且r1是蛋白质结合配体。在另一种实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是荧光、化学发光或放射性标记的探针并且r1是蛋白质结合配体，其中r1(蛋白质结合配体)在与蛋白质结合时释放，同时荧光、化学发光或放射性标记的探针与蛋白质共价地连接。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质的亲核部分和式i、式ia、式ib或式ic的化合物结构的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0122]在一些实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是生物活性基团，并且r1是蛋白质结合配体。在另一种实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是生物活性基团并且r1是蛋白质结合配体，其中r1(蛋白质结合配体)在与蛋白质结合时释放，同时生物活性基团与蛋白质共价地连接。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质的亲核部分和式i、式ia、式ib或式ic的化合物结构的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0123]在一些实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是第一蛋白质的蛋白质结合配体，并且r1是第二蛋白质的蛋白质结合配体。在另一种实施方案中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的r是第一蛋白质的蛋白质结合配体并且r1是第二蛋白质的蛋白质结合配体，其中r1(第二蛋白质的蛋白质结合配体)在与第二蛋白质相互作用时释放，同时第一蛋白质的蛋白质结合配体与第一蛋白质共价地连接。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质的亲核部分和式i、式ia、式ib或式ic的化合物结构的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0124]在一些实施方案中，如式i、式ia、式ib或式ic的结构中定义的x是接头或键。在其他实施方案中，x是键。在其他实施方案中，x是接头。在其他实施方案中，接头包括烃基、环烃基、杂环烃基、芳基、杂芳基、酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、酸酐键、氧原子、胺、硫原子、氮原子、树枝状大分子、自裂解接头(selfimmolativelinker)、peg或其组合。在另一种实施方案中，接头是亚烃基二胺。在另一种实施方案中，接头是-n-烃基-n、n-烃基-c(o)n-、-n-烃基-n(co)-、-n-烃基-o-c(o)-n-、-oc(o)-烃基-n-、-oc(o)-烃基-c(o)n-、-oc(o)-烃基-n(co)-、-oc(o)-烃基-o-c(o)-n-、-c(o)o-烃基-n-、-c(o)o-烃基-c(o)n-、-c(o)o-烃基-n(co)-、-c(o)o-烃基-o-c(o)-n-、-o-(co)-n-烃基-c(o)n、-o-(co)-n-烃基-nc(o)-、-o-(co)-n-烃基-n-、-o-c(o)-n-烃基-o-c(o)-n-；其中氮(n)和烃基可以被任选地取代。在另一种实施方案中，接头是自裂解接头。在另一种实施方案中，接头是树枝状大分子。在另一种实施方案中，接头是peg。[0125]在其他实施方案中，其中，如果式i、式ia、式ib或式ic的结构的x是键，则r1经由酯键、酰胺键、酸酐键、氨基甲酸酯键、氧原子、硫原子或氮原子直接连接至主链结构。每一种都是本发明的单独的实施方案。[0126]在一些实施方案中，如式i、式ia、式ib或式ic的结构中定义的g是氧原子(o)或硫原子(s)。在其他实施方案中，g是氧原子(o)。在其他实施方案中，g是硫原子(s)。[0127]在一些实施方案中，如式i的结构中定义的w是键、nh、氧原子(o)、ch2或接头。在其他实施方案中，w是键。在其他实施方案中，w是nh。在其他实施方案中，w是氧原子(o)。在其他实施方案中，w是ch2。在其他实施方案中，w是接头。在其他实施方案中，接头包括烃基、环烃基、杂环烃基、芳基、杂芳基、酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、酸酐键、氧原子、胺、硫原子、氮原子、树枝状大分子、自裂解接头、peg或其组合。在另一种实施方案中，接头是亚烃基二胺。在另一种实施方案中，接头是-n-烃基-n、n-烃基-c(o)n-、-n-烃基-n(co)-、-n-烃基-o-c(o)-n-、-oc(o)-烃基-n-、-oc(o)-烃基-c(o)n-、-oc(o)-烃基-n(co)-、-oc(o)-烃基-o-c(o)-n-、-c(o)o-烃基-n-、-c(o)o-烃基-c(o)n-、-c(o)o-烃基-n(co)-、-c(o)o-烃基-o-c(o)-n-、-o-(co)-n-烃基-c(o)n、-o-(co)-n-烃基-nc(o)-、-o-(co)-n-烃基-n-、-o-c(o)-n-烃基-o-c(o)-n-；其中氮(n)和烃基可以被任选地取代。在另一种实施方案中，接头是自裂解接头。在另一种实施方案中，接头是树枝状大分子。在另一种实施方案中，接头是peg。[0128]在一些实施方案中，本发明涉及前药，其中所述前药包含由本发明的式i、式ia、式ib或式ic的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物，其中r是蛋白质结合配体，并且r1是药物或靶向抑制剂、或毒素、或放射性药物、或化学治疗剂，其中，在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，药物或靶向抑制剂或毒素或化学治疗剂被释放。[0129]在一些实施方案中，本文提供了药物组合物，该药物组合物包含：包括由式i、式ia、式ib或式ic的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物的前药，其中r是蛋白质结合配体，并且r1是药物、放射性药物、靶向抑制剂、毒素或化学治疗剂；以及药物可接受的载体。[0130]在另一种实施方案中，在蛋白质和本文提供的共价配体导向释放(coldr)化合物的蛋白质结合配体之间形成共价键。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质的亲核部分和本文提供的coldr化合物的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0131]在一些实施方案中，本发明提供蛋白质传感器或蛋白质标记，该蛋白质传感器或蛋白质标记包含由本发明的式i、式ia、式ib或式ic的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物，其中r或r1是荧光探针或化学发光探针，其中，[0132]如果r是荧光探针或化学发光探针，并且r1是蛋白质结合配体；则在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，蛋白质结合配体被释放，并且荧光或化学发光探针共价地附接至蛋白质，并且从而导致探针的荧光或化学发光的变化(图2，其中a是荧光或化学发光探针，并且b是蛋白质结合配体)；或者[0133]如果r是蛋白质结合配体，并且r1是荧光探针或化学发光探针，则在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，荧光探针或化学发光探针被释放，并且蛋白质结合配体共价地附接至蛋白质，并且从而导致探针的荧光或化学发光的变化。(图1，其中a是蛋白质结合配体，并且b是荧光或化学发光探针)。[0134]在一些实施方案中，本发明提供蛋白质传感器或蛋白质标记，该蛋白质传感器或蛋白质标记包含由本发明的式i、式ia、式ib或式ic的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物，其中r或r1是放射性药物探针，其中，[0135]如果r是放射性药物探针，并且r1是蛋白质结合配体；则在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，蛋白质结合配体被释放，并且放射性标记探针共价地附接至蛋白质，并且从而蛋白质可以被诊断/感测(图2，其中a是放射性标记探针，并且b是蛋白质结合配体)；或者[0136]如果r是蛋白质结合配体，并且r1是放射性标记探针，则在蛋白质和蛋白质结合配体之间相互作用时，放射性标记探针被释放，并且蛋白质结合配体共价地附接至蛋白质，并且从而蛋白质可以被诊断/感测。(图1，其中a是蛋白质结合配体，并且b是放射性标记探针)。[0137]在另一种实施方案中，在蛋白质和蛋白质结合配体之间形成共价键。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质的亲核部分和式i、式ia、式ib或式ic的化合物的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0138]以下表中表示本发明的式i、式ia-式ic的化合物的示例性特定化合物：[0139][0140][0141][0142][0143][0144][0145][0146][0147][0148][0149]α取代的甲基丙烯酰胺，其在与硫醇亲核体反应时(参见图1)，经历共轭加成-消除反应，最终在α’位释放取代基。这些化合物已经被用作靶向共价抑制剂和共价配体导向释放(coldr)化学，用于开启荧光和化学发光探针(图1)。若干种胺、酚、羧酸和氨基甲酸酯在与硫醇基团反应之后成功地经历消除。配体在甲基丙烯酰胺的α’位的适当附接可以导致配体(识别元件)在与官能团亲电体(即半胱氨酸的硫醇)反应之后的消除，这可以用于用多种探针在蛋白质活性位点进行位点特异性标记(图2)。[0150]在一些实施方案中，本发明提供第一蛋白质和第二蛋白质的蛋白质邻近诱导剂，该蛋白质邻近诱导剂包含由本发明的式i、式ia、式ib或式ic的结构表示的共价配体导向释放(coldr)化合物，其中r是第一蛋白质的蛋白质结合配体，并且r1是第二蛋白质的另一蛋白质结合配体，其中，在第二蛋白质和对应的蛋白质结合配体之间相互作用时，r1被释放，然后第二蛋白质具有活性并且用r标记，诱导与第一蛋白质的新的相互作用。[0151]在另一种实施方案中，在第一蛋白质和对应的蛋白质结合配体之间形成共价键。在另一种实施方案中，共价键经由蛋白质a的亲核部分和式i、式ia、式ib或式ic的化合物的双键(-c＝ch2)形成。在另一种实施方案中，蛋白质的亲核部分是硫醇、胺或羟基。[0152]在一些实施方案中，本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物用作蛋白质标记以诊断疾病或用作靶向蛋白质的蛋白质标记。靶向蛋白质的标记通过以下完成：本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物与靶向蛋白质结合时荧光或化学发光或放射性性质的变化。[0153]在一些实施方案中，本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物用作蛋白质传感器以诊断疾病或用作靶向蛋白质的蛋白质传感器。靶向蛋白质的感测通过以下完成：当本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物与靶向蛋白质结合时，在使用放射性标记探针/放射性药物情况下荧光或化学发光性质或放射性性质的变化。[0154]在一些实施方案中，本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物用作前药或药物递送系统，其中药物在本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物与靶向蛋白质结合时被释放。[0155]在一些实施方案中，本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物用于蛋白质邻近诱导剂，其中式i、式ia-式ic的r是第一蛋白质的蛋白质结合配体，并且r1是第二蛋白质的另一蛋白质结合配体，其中，在第二蛋白质和其蛋白质结合配体之间相互作用时，r1被释放，并且然后第二蛋白质具有活性并且用r标记，诱导与第一蛋白质的新的相互作用。[0156]本发明的前药、药物递送系统、蛋白质传感器、蛋白质邻近诱导剂或蛋白质标记为药物发现和化学生物学提供若干个优点，包括可预测的反应性衰减，在未对核心支架进行另外修饰的情况下的后期安装，以及重要的是将化合物官能化为开启探针的能力。[0157]在模型化合物的背景下(参见实施例2)被取代的甲基丙烯酰胺跨越硫醇反应性的宽窗口(如通过它们与gsh的反应的t1/2评价的；表1)，这是可预测的并且取决于他们相应的离去基团的pka(图4b)。这些类型的亲电体适合用于具有多种蛋白质组反应性的化学蛋白质组应用(图8)。因此，这些加入了日益增长的一批细胞相容性半胱氨酸靶向亲电体，这可以扩展可靶向半胱氨酸组(cysteinome)的范围。这些甲基丙烯酰胺在蛋白质组标记的半胱氨酸上留下相同的加合物，这样的化合物的混合物可以用作定量化学蛋白质组学的方便的探针，具有潜在增加的覆盖率(coverage)。[0158]在靶向共价抑制剂的背景下，模型化合物(参见实施例2)展示出显著降低的硫醇反应性(图10c)，并且绝大多数化合物示出比母体未被取代的丙烯酰胺更低的gsh反应性。这可能通过降低可能的脱靶数来赋予这样的靶向共价抑制剂改善的选择性，所述可能的脱靶数如先前针对伊布替尼的较低反应性共价类似物示出的。在这种情况下，还有趣的是注意到酯探针(例如2c和3g)的细胞反应性，其也可以赋予如先前针对富马酸酯示出的动力学选择性。[0159]这些化合物中的若干种示出比伊布替尼改善的btk抑制，伊布替尼已经是一种高度优化的btk抑制剂(图10b-图10e)。也许是通过将亲电体锁定在与共价键形成更相容的构象中。这表明这类亲电体可以用于靶向共价抑制剂的后期优化。特别是因为它们可以直接安装在丙烯酰胺上。在原代b细胞中的b细胞受体信号传导抑制的功能测定示出，它们在细胞环境中具有活性，具有与伊布替尼相当的效能(图10e)。[0160]在一些实施方案中，这类新的亲电体提供了由特定靶半胱氨酸促进的触发化学货物的释放的能力。大多数先前报导的开启方法是基于还原酶、糖苷酶、蛋白酶和内酰胺酶的酶功能。在共价标记的背景下，酰氧基甲基酮用于产生蛋白酶的基于fret的开启荧光探针，醌甲基化物化学也用于基于猝灭活性的探针。最近，也已经报导了基于pet的荧光探针和半胱氨酸反应性开启荧光探针。相关地，hamachi和同事报导了若干种配体导向化学，其中在探针与蛋白质表面上的随机亲核残基(赖氨酸、丝氨酸和组氨酸)反应之后，导向配体离开活性位点。这些方法已经被用于开发开启荧光探针(32-36)，但需要配体在用相对大的反应性基团修饰之后保持对其靶蛋白质的高亲和力和选择性。[0161]在本发明中，以选择性方式触发荧光团的开启释放(图11；图13)。这种方法，称为coldr化学，通常通过将其应用至三种不同的靶向共价抑制剂(包括针对具有挑战性的k-rasg12c致癌突变体的抑制剂)进行证实。这种方法当然不限于荧光团。由于存在宽范围的相容性离去基团官能团(酚、胺、羧酸)，许多货物应当可用于靶向释放，诸如可能对于诊断和治疗两者都有用的前药(37-39)、化学治疗剂(40-41)、显像剂(42-44)或自裂解接头(16)。[0162]在本发明中，证明了coldr化学也可用于产生开启化学发光(图15)，并且已经使用这种新颖的功能性探针来促进针对btk的小的高通量筛选，该筛选导致已知btk抑制剂和非选择性激酶抑制剂的鉴定。这种测定比典型的基于酶的测定简单得多，因为它不需要任何底物或酶反应优化。此外，它具有位点选择性筛选的益处，因为只有将与探针相竞争的抑制剂才降低信号，所述探针结合在抑制剂的靶附近。例如，用k-rasg12c探针的类似筛选被预期主要鉴定switch-ii口袋结合剂。这允许一种方便的方法以筛选例如在靶口袋附近存在的变构结合剂。[0163]本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物结构可以用于调节选择性共价抑制剂的反应性，或可以用作针对蛋白质(诸如btk、egfr和k-rasg12c)的开启荧光探针，以及用于btk的开启化学发光探针。[0164]在本发明中，式i、式ia、式ib或式ic的结构的α取代的甲基丙烯酰胺是一类新的适合用于靶向共价抑制剂的亲电体。虽然通常α取代使丙烯酰胺失活，但杂α取代的甲基丙烯酰胺示出具有与蛋白质较高的亲核反应性，并且经历共轭加成-消除反应，最终释放取代基。它们与蛋白质的亲核反应性是可调的并且与离去基团的pka相关。[0165]使用本文提供的共价配体导向释放(coldr)化学，用不同的探针修饰多种潜在的药物靶，如btk、kras、sars-cov-2-plpro。对于btk，示出了炔烃和荧光团标签两者在细胞中的选择性标记。通过传统的亲和方法的蛋白质标记通常抑制蛋白质活性，因为导向配体永久地占据靶结合口袋。使用coldr化学，通过本文提供的探针在细胞中对btk的修饰保留了btk的活性。此外，使用本发明的共价配体导向释放(coldr)化合物结构来确定药物靶(诸如btk)在其扰动最小的天然环境中的半衰期。使用环境敏感的‘开启’荧光探针，监测配体与药物靶(诸如btk)的活性位点结合。在另一种实施方案中，提供了基于coldr的btkprotac(dc50《100nm)对btk的高效降解，该基于coldr的btkprotac将e3连接酶结合剂靶(例如crbn结合剂)安装在btk上。在本文提供的另一种实施方案中，通过将e3连接酶结合剂共价安装在靶上，提供了基于coldr的protac对蛋白质靶的高效降解。这种类型的蛋白水解靶向嵌合体(protac)可以实现调节靶蛋白质的降解动力学，同时将蛋白质保持在其活性形式。这种方法加入了保持靶蛋白质活性的非常少的可用标记策略，并且由此为化学生物学的工具箱进行了重要的添加。[0166]在一些实施方案中，本文公开的化合物或探针用于将蛋白质(非限制性实例包括：btk、kras和sars-cov-2-plpro)标记到它们的活性位点(具有羟基、硫醇或胺基团)。这种位点选择性标记具有许多优点，如开发“开启”荧光探针、在天然细胞环境中的半衰期鉴定以及用于降解的protac(蛋白水解靶向嵌合体)。[0167]在一些实施方案中，本文公开的化合物/探针用于配体导向的化学—用于鉴定潜在共价抑制剂的脱靶或用于成像实验。由于这些化合物衍生自它们对应的共价抑制剂，因此不需要优化接头长度以标记相同的官能团(即半胱氨酸的硫醇)。这些探针的重要性在于，在用活性探针标记之后，它们不抑制天然蛋白质的活性及其下游信号(图26)。这允许研究蛋白质在天然细胞环境中的性质。[0168]在一些实施方案中，本文公开的化合物/探针用于将环境敏感染料(即尼罗红)标记到蛋白质(即btk)作为开启荧光探针，这示出荧光强度的改善。由于环境敏感探针给予蛋白质结构的信息，并且配体的存在可以改变其结构，这种方法有助于在不存在配体的情况下发现蛋白质的结构。此外，活性位点中配体的缺乏保持蛋白具有活性同时开启荧光。[0169]在一些实施方案中，本文公开的化合物/探针用于发现蛋白质在其天然细胞环境中的半衰期，而不干扰其他生物过程。已经报导了若干种用于鉴定蛋白质的半衰期的方法，如脉冲追踪放射性标记测定和环己酰亚胺(chx)测定。脉冲追踪测定的主要缺点在于它包括许多可能耗时的步骤并且需要放射性标记。此外，环己酰亚胺通过停止所有蛋白质的合成来改变细胞过程。本文公开的化合物/探针在环己酰亚胺测定中不改变半衰期，而伊布替尼将其半衰期缩短2小时。用不同的功能部分如peg接头或疏水性降解剂修饰蛋白质半衰期而不影响其活性是可能的。[0170]在一些实施方案中，本文公开的化合物/探针用于使用protac降解蛋白质(即btk)，其中与蛋白质共价附接的e3连接酶结合剂(即crbn结合剂)在不存在配体的情况下高效地降解蛋白质。这种方法有助于调节蛋白质降解动力学而不影响其活性。[0171]在一些实施方案中，本文提供式i、式ia-式ic的coldr化合物，其中r或r1两者都是蛋白质结合配体并且r或r1中的一个是泛素连接酶结合剂，从而获得基于coldr的蛋白质protac化合物。[0172]在一些实施方案中，本文公开的化合物/探针用于标记天然细胞环境中的蛋白质，该蛋白质在标记时释放配体，从而保持活性。这种方法能够实现多种应用，如蛋白质的半衰期鉴定和靶向降解。[0173]在一些实施方案中，本文公开的化合物/探针允许感兴趣的天然蛋白质的位点特异性细胞标记，同时保留其酶活性。[0174]本文公开的化合物/探针的优点在于不需要改变亲电碳的位置，将干扰与靶的共价键形成的风险最小化。这也意味着先验地知道哪个残基将被新安装的标签标记。[0175]已经表明，可以安装具有多种功能的标签(图22a)，指示该方法是通用的。[0176]在一些实施方案中，将本文公开的化合物/探针用于标记平台提供了环境敏感的“开启”荧光探针。除了结合时产生荧光之外，活性蛋白质被标记，并且染料可以用作蛋白质中结合事件的报告分子(图28)，并且也许还可以用作蛋白质的构象的报告分子。本文提供的探针不阻碍与活性位点结合的这一事实可以有助于研究替代配体结合事件。[0177]本文提供了用于蛋白质的位点特异性标记的新平台，其与细胞条件相容并且保留了标记的蛋白质的活性。这种方法加入了非常少的这样的可用的策略，并且由此为化学生物学的工具箱进行了重要的添加。[0178]如本文使用的，在一种实施方案中，单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语烃基指的是“c1至c18烃基”，并且表示直链和支链的、饱和或不饱和的(例如，烯基、炔基)基团，后者仅当烃基链中的碳原子数大于或等于2时，并且可以包含混合的结构。非限制性实例是具有从1个至6个碳原子的烃基基团(c1至c6烃基)，或具有从1个至4个碳原子的烃基基团(c1至c4烃基)。饱和的烃基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、叔戊基和己基。烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、烯丙基、丁烯基及类似基团。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基及类似基团。类似地，术语“c1至c18亚烃基”表示1个至18个碳的二价基团。[0179]烃基基团可以是未被取代的或者被一个或更多个选自由以下组成的组的取代基取代：卤素、羟基、烃氧基、芳氧基、烃基芳氧基、杂芳氧基、氧代、环烃基、苯基、杂芳基、杂环基、萘基、氨基、烃基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、二烃基氨基、二芳基氨基、烃基芳基氨基、烃基杂芳基氨基、芳基杂芳基氨基、酰基、酰氧基、硝基、羧基、氨基甲酰基、甲酰胺、氰基、磺酰基、磺酰基氨基、亚磺酰基、亚磺酰基氨基、硫醇、烃基硫基、芳基硫基或烃基磺酰基基团。任何取代基可以是未被取代的或者被这些上文提及的取代基中的任一个进一步取代。[0180]本文单独使用或作为另一基团的一部分使用的术语“芳基”表示具有从6个-14个环碳原子的芳香族环体系。芳基环可以是单环、双环、三环及类似物。芳基基团的非限制性实例是苯基；萘基，包括1-萘基和2萘基；及类似基团。芳基基团可以是未被取代的或者通过可用的碳原子被一个或更多个诸如以下的基团取代：卤素、烃基、芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、烃基芳氧基、杂芳氧基、氧代、环烃基、苯基、杂芳基、杂环基、萘基、氨基、烃基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、二烃基氨基、二芳基氨基、烃基芳基氨基、烃基杂芳基氨基、芳基杂芳基氨基、酰基、酰氧基、硝基、羧基、氨基甲酰基、甲酰胺、氰基、磺酰基、磺酰基氨基、亚磺酰基、亚磺酰基氨基、硫醇、烃基硫基、芳基硫基、烃基磺酰基、-ocn、-scn、-n＝c＝o、-ncs、-no、-n3、-op(＝o)(or*)2、-p(＝o)(or*)2、-p(＝o)(o-)2、-p(＝o)(oh)2、-p(o)(or*)(o-)、-c(＝o)r*、-c(＝o)x、-c(s)r*、-c(s)or*、-c(o)sr*、—c(s)sr*、-c(s)nr*2或-c(＝nr*)nr*2基团，其中每个r*独立地是h、烃基、芳基、芳基烃基、杂环，或保护基团或前药部分基团。任何取代基可以是未被取代的或者被这些上文提及的取代基中的任一个进一步取代。[0181]术语“杂芳基”指的是包含从5个-14个成员环的芳香族环体系，该芳香族环体系在环中具有至少一个杂原子。可以被包含在芳香族环中的合适的杂原子的非限制性实例包括氧、硫、磷和氮。杂芳基环的非限制性实例包括吡啶基、吡咯基、噁唑基、吲哚基、异吲哚基、嘌呤基、呋喃基、噻吩基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、咔唑基、咪唑基、噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、喹啉基、异喹啉基、哒嗪基(pyridazyl)、嘧啶基、吡嗪基等。杂芳基基团可以是未被取代的或者通过可用的碳原子被一个或更多个诸如以下的基团取代：卤素、烃基、芳基、羟基、烃氧基、芳氧基、烃基芳氧基、杂芳氧基、氧代、环烃基、苯基、杂芳基、杂环基、萘基、氨基、酰氨基、烃基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、二烃基氨基、二芳基氨基、烃基芳基氨基、烃基杂芳基氨基、芳基杂芳基氨基、酰基、酰氧基、硝基、羧基、氨基甲酰基、甲酰胺、氰基、磺酰基、磺酰基氨基、亚磺酰基、亚磺酰基氨基、硫醇、烃基硫基、芳基硫基、烃基磺酰基、-ocn、-scn、-n＝c＝o、-ncs、-no、-n3、-op(＝o)(or*)2、-p(＝o)(or*)2、-p(＝o)(o-)2、-p(＝o)(oh)2、-p(o)(or*)(o-)、-c(＝o)r*、-c(＝o)x、-c(s)r*、-c(s)or*、-c(o)sr*、—c(s)sr*、-c(s)nr*2或-c(＝nr*)nr*2基团，其中每个r*独立地是h、烃基、芳基、芳基烃基、杂环，或保护基团或前药部分。任何取代基可以是未被取代的或者被这些上文提及的取代基中的任一个进一步取代。[0182]术语“化合物”和“探针”在本文可互换地使用。实施例[0183]方法[0184]lc/ms测量[0185]使用电喷雾电离，以正离子模式，在watersacquityuplcclassh仪器上进行lc/ms运行。小分子的uplc分离使用c18-csh柱(1.7μm，2.1mm×50mm)。将柱保持在40℃，并且将自动进样器保持在10℃。流动相a是在水中的0.1％甲酸，并且流动相b是在乙腈中的0.1％甲酸。运行流量是0.3ml/min。所使用的梯度是100％a持续2min，经5min线性增加至90％b，保持在90％b持续1min，在0.1min内改变至0％b，并且保持在0％b持续1.9min(对于1b，梯度从100％a开始并且经2min线性降低至60％a，经2.0-6.0min60％-40％a，在0.5min内40％-10％a，并且经1.5min10％-100％a)。蛋白质的uplc分离使用c4柱(1.7μm，2.1mm×100mm)。将柱保持在40℃，并且将自动进样器保持在10℃。流动相a是在水中的0.1％甲酸，并且流动相b是在乙腈中的0.1％甲酸。运行流量是0.4ml/min，梯度是20％b持续2min，经3min线性增加至60％b，保持在60％b持续1.5min，在0.1min内改变至0％b，并且保持在0％b持续1.4min(对于动力学标记实验，使用的梯度是90％a持续0.5min，经0.50-2.30min90％-40％a，经2.60-3.20min40％-10％a，10％a持续0.2min，经另一0.2min10％-90％a以及90％a持续0.6min)。质量数据在waterssqd2检测器上以2-3071.98da的m/z范围收集，btk以800-1500da的m/z范围，efgr以900-1800da的m/z范围，并且k-rasg12c以750-1550da的m/z范围。[0186]基于ms/ms的蛋白质组学[0187]将5μm的重组btk激酶结构域用50μm的7d或dmso在20mmtris中孵育。然后通过蛋白质的甲醇-氯仿(400μlmeoh+100μlchcl3+300μlh2o)沉淀去除化合物。将干燥的沉淀物溶解在50μl的50mmtrisph8+5％sds中，并且加热至95℃持续6min。使用bca测定(使用bsa作为标准)估计蛋白质的浓度。将2μg每个样品用tris50mmph＝8+5％sds稀释至15μl，用dtt还原(0.75μl，0.1m在5％sds/tris50mmph8中，45min65℃)，冷却至室温，然后用0.75μl的在水中的0.2m碘乙酰胺烷基化(在黑暗中在室温30min)。然后根据制造商的说明将蛋白质分离并且在s-traps(protifi)上胰蛋白酶消化。每种分子制备一式三份。[0188]所有色谱步骤均使用ulc/ms级溶剂。使用不分流纳米超高效液相色谱法(10kpsinanoacquity；waters,milford,ma,usa)装载每个样品。流动相是：a)h2o+0.1％甲酸和b)乙腈+0.1％甲酸。使用反相symmetryc18捕集柱(180μm内径，20mm长度，5μm粒度；waters)在线进行样品的脱盐。然后使用t3hss纳米柱(75μm内径，250mm长度，1.8μm粒度；waters)以0.35μl/min分离肽。使用以下梯度将肽从柱中洗脱到质谱仪中：在155min内4％至30％b，在5min内35％至90％b，保持在90％持续5min，并且然后回到初始条件。[0189]nanouplc通过nanoesi发射器(10μm尖端；newobjective；woburn,ma,usa)在线耦联至四极轨道阱质谱仪(qexactivehfx，thermoscientific)，使用flexion纳米喷雾装置(proxeon)。[0190]使用top10方法，以数据依赖型采集(dda)模式采集数据。ms1分辨率设置为120,000(在200m/z)，质量范围为375-1650m/z，agc为3e6，并且最大注射时间设置为60msec。ms2分辨率设置为15,000，四极隔离1.7m/z，agc为1e5，动态排除为45sec，并且最大注射时间为60msec。[0191]蛋白质组学分析[0192]使用maxquant1.6.3.4进行分析。btk的序列用于分析。将消化酶设置为胰蛋白酶，最大漏切次数为0。氨基甲酰氨基甲基(carbamidomethyl)和分子的修饰作为对半胱氨酸的可变修饰被包括。“重新定量(re-quantify)”选项被启用。污染物被包括。以7的最小肽长度和4,500da的最大肽质量搜索肽。“第二肽”被启用，并且“依赖性肽”被禁用。启用了选项“运行间匹配”，匹配时间窗口为0.7min，并且对齐窗口为20min。0.01的fdr被用于蛋白质fdr、psmfdr和xpsmfdr。分别分析每种化合物(或dmso处理的蛋白质)的一式三份测量结果。[0193]在maxquant分析后，仅对完全裂解的肽进行定量，并且未被碘乙酰胺或化合物修饰的含半胱氨酸的肽被忽略。每种肽的强度被计算为三份重复的平均值。如果重复中的一个的强度为零，则忽略该肽。含非半胱氨酸的肽的强度针对每个数据集进行平均，并且用于归一化含半胱氨酸的肽的强度。通过比较dmso处理的样品和分子处理的样品之间氨基甲酰氨基甲基修饰的肽的强度来完成序列中含半胱氨酸的肽的标记程度的估计。使用skyline提取氨基甲酰氨基甲基修饰的肽和分子修饰的肽的ms/ms光谱。[0194]使用btk的伊布替尼衍生物的标记实验[0195]如先前报导表达和纯化btk激酶结构域(46)。结合实验在室温在tris20mmph8.0、50mmnacl中进行。将btk激酶结构域在缓冲液中稀释至2μm，并且2μm伊布替尼衍生物(7c、7d、7k、7f、7e、7m、7n、7o、7q、7r、7s和7g)通过添加来自200μm溶液的1/100体积来添加。将反应混合物在室温在不同时间注射到lc/ms中。对于数据分析，使用20000:40000da窗口和1da分辨率对原始光谱进行解卷积。化合物的标记百分比被确定为特定化合物(单独或与其他化合物一起)的标记除以全部检测的蛋白质物质。对于k-rasg12c，10μm的蛋白质用100μm的化合物7h在37℃的tris20mmph8.0、50mmnacl中孵育持续16h。对于plpro，2μm的蛋白质用10μm7t在25℃的300mmnacl、50mmtrisph8、1mmtcep中孵育持续16h。[0196]板读取器荧光和发光测量[0197]使用具有透明底部的黑色384孔板，在tecansparkcontrol10m荧光测量上进行板读取器测量。使用384白色孔板、积分100ms和1ms稳定时间进行发光测量。[0198]使用7m的荧光强度测量[0199]将btk激酶结构域在缓冲液中稀释至2μm，并且2μm7m通过添加来自200μm溶液的1/100体积来添加。在不存在蛋白质和btk的情况下，用4μmibr-h/伊布替尼预孵育持续5min来进行对照测量。对于btk，每种条件在20mmtrisph8.0和50mmnacl中以一式四份进行。对于btk/k-rasg12c，每2min进行荧光测量持续1h。在测量结束时，将样品直接注射到lc/ms中用于标记定量。[0200]使用7m的高通量筛选[0201]在384孔黑色板(thermofisherscientific-nunclon384flatblack[nun384fb])中，针对初始筛选使用selleck化合物收集以200μm进行高通量筛选。将btk(2μm)用化合物7m(4μm)孵育持续1h。将得到的btk-7m(50μl)添加至抑制剂。在32℃用20mmtrisph8.0、50mmnacl进行筛选，并且在10min之后记录荧光。[0202]伊布替尼衍生物的gsh反应性测定[0203]分别将亲电体(7c、7d、7k、7f、7e、7m、7n、7o、7q、7r、7s)的100μm(0.5μl的20mm储备液)样品用5mmgsh(5μl的100mm储备液，新鲜溶解)、5mmnaoh(以抵消由gsh赋予的酸性)和作为内标的100μm4-硝基氰基苯(0.5μl的20mm储备溶液)以9:1的比例在ph8.0的100mm磷酸钾缓冲液和dmf中孵育。将所有溶剂都用氩气鼓泡。将反应混合物保持在10℃。每隔1h将来自反应混合物的5μl注射到lc/ms中。反应之后是通过4-硝基氰基苯的面积归一化的亲电体的峰面积(即通过起始材料的消失)。结果的自然对数拟合至线性回归，并且t1/2被计算为t1/2＝ln2/–斜率。[0204]模型化合物的gsh反应性测定[0205]分别将亲电体(1a-1j)的100μm(0.5μl的20mm储备液)样品用5mmgsh(50μl的100mm储备液)和作为内标的100μm4-硝基氰基苯(5μl的20mm储备溶液)在ph8.0的100mm磷酸钾缓冲液(940μl)中孵育。将所有溶剂都用氩气鼓泡。将反应混合物在摇动的情况下保持在37℃。在如图中示出的一定的时间间隔之后，将来自反应混合物的5μl立即注射到lc/ms中。反应之后是通过4-硝基氰基苯的面积归一化的亲电体的峰面积。结果的自然对数拟合至线性回归，并且t1/2被计算为t1/2＝ln2/–斜率。[0206]经由荧光测量的1g的gsh反应性。[0207]将100μm的1g单独地添加至在ph8.0的100mm磷酸钾缓冲液中的0.1mm、0.5mm、1mm、5mm和10mmgsh。在37℃在435nm处的立即荧光强度测量值每10min采集持续1h，并且每1h采集持续24h。使用tecanspark10m板读取器在384孔板中进行测定。还进行了无gsh和1g的对照实验。将化合物以一式三份测量。[0208]ph对1g与gsh的反应性的影响[0209]将100μm的1g添加至在不同ph5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的100mm磷酸钾缓冲液中的5mmgsh。在37℃在435nm处的立即荧光强度测量值每10min采集持续1h，并且每1h采集持续24h。使用tecanspark10m板读取器在384孔板中进行测定。将化合物以一式三份测量。[0210]伊布替尼衍生物的gsh反应性测定[0211]分别将100μm的亲电体(3a-3l)用作为内标的100μm4-硝基氰基苯和5mmgsh以9:1的比例在ph8.0(在添加gsh之后滴定)的100mm磷酸钾缓冲液和dmf中孵育。将所有溶剂都用氩气鼓泡。将反应混合物在摇动的情况下保持在37℃。在如图中示出的一定的时间间隔(1.5h、4h、8h、12h、24h、48h、72h)之后，将来自反应混合物的50μl立即注射到lc/ms中。反应之后是通过4-硝基氰基苯的面积归一化的亲电体的峰面积。结果的自然对数拟合至线性回归，并且t1/2被计算为t1/2＝ln2/–斜率。[0212]伊布替尼衍生物与btk的动力学标记实验[0213]如先前报导表达和纯化btk激酶结构域65。结合实验在tris20mmph＝8、50mmnacl和1mmdtt中进行。将btk激酶结构域在缓冲液中稀释至2μm，并且2μm伊布替尼衍生物通过添加来自200μm溶液的1/100体积来添加。将反应混合物在室温在不同时间注射到lc/ms中。对于数据分析，使用20000:40000da窗口和1da分辨率对原始光谱进行解卷积。来自质量20000:30000和33000:40000的信号(其不包含峰)被平均并且从整个信号中减去。在每个方向上使用100da窗口对每个物质的峰进行积分(将窗口减小至10da不显著改变结果)。[0214]基于凝胶内荧光活性的分析[0215]将mino细胞用0.1％dmso或指示浓度的ia-炔烃、2a、2b、2c处理持续2h。用ripa缓冲液(sigma)裂解细胞，并且使用bca蛋白质测定(thermofisherscientific)确定蛋白质浓度。然后将裂解物在pbs中稀释至2mg/ml，并且点击至tamra-叠氮化物。使用在60μl的最终体积中40μmtamra-叠氮化物、3mmcuso4、3mm三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(thpta，sigma)和3.7mml-抗坏血酸钠(sigma)的最终浓度进行点击反应。将样品在25度孵育持续2小时。添加20μl的4×lds样品缓冲液(nupage，thermofischerscientific)，随后在70度孵育10min。然后将样品装载在4％-20％bis-tris凝胶(surepage,genescript)上，并且使用typhoonfla9500扫描仪成像。[0216]模型化合物的缓冲液稳定性测定[0217]将亲电体(7c、7d、7k、7f、7e、7m、7n、7o、7q、7r、7s、9c、9a和9b)的100μm样品用作为内标的100μm的4-硝基氰基苯在ph8.0的100mm磷酸钾缓冲液中孵育。将所有溶剂都用氩气鼓泡。将反应混合物在摇动的情况下保持在37℃。在4天之后(除非另外提及)，将来自反应混合物的5μl注射到lc/ms中以检查化合物的稳定性。[0218]基于凝胶内荧光活性的分析[0219]将mino细胞在37℃和5％co2在补充有15％fbs和1％p/s的rpmi培养基中培养。将细胞用0.1％dmso或指示浓度的7d、7f、7n处理持续2h。对于竞争实验，将细胞用1μm伊布替尼预孵育持续30min，随后用200nm7d、200nm7f和100nm7n孵育2h。用ripa缓冲液(sigma，r0278)裂解细胞，并且使用bca蛋白质测定(thermofisherscientific，23225)确定蛋白质浓度。然后将裂解物在pbs中稀释至2mg/ml。在25℃在裂解物中进行用7e的孵育持续2h。将7d和7f的情况下的裂解物点击至tamra-叠氮化物(lumiprobe)。对于7d，使用在60μl的最终体积中40μmtamra-叠氮化物、3mmcuso4、3mm三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(thpta，sigma)和3.7mml-抗坏血酸钠(sigma)的最终浓度进行“点击”反应。对于7f，通过用40μmtamra-叠氮化物孵育进行“点击”反应。将样品在25℃孵育持续2h。添加20μl的4×lds样品缓冲液(nupage，thermofischerscientific，np0007)，随后在70℃孵育10min。然后将样品装载在4％-20％bis-tris凝胶(surepage,genescript)上，并且使用typhoonfla9500扫描仪成像。7d和7f在532nm处扫描，7n和7e在473nm处扫描。[0220]细胞中的btk活性[0221]将mino细胞用0.1％dmso或指示浓度的伊布替尼、ibrh、7d和7f处理持续1h。然后将细胞用10μg/ml抗人igm(jacksonimmunoresearch,109-006-129)在37℃孵育持续10min，收获并且进行磷酸btk、总btk和b-肌动蛋白的免疫印迹。[0222]b细胞反应实验[0223]将来自c57bl/6小鼠的脾细胞通过迫使脾组织通过网进入包含2％胎牛血清和1mmedta的pbs中进行分离，并且通过裂解缓冲液耗尽红细胞。将细胞在96孔u型底皿中培养(在rpmi10％fcs中1×106个细胞/ml)，并且在37℃在5％加湿co2中用不同浓度(1nm、10nm、100nm、1000nm)的伊布替尼、7d和7f孵育持续24h。孵育24h后，将细胞用抗igm(5μg/ml，sigma-aldrich)刺激过夜。随后，将细胞在4℃用抗b220(克隆ra3-6b2，biolegend)和抗cd86(克隆gl-1，biolegend)抗体(抗小鼠cd86biolegend1050081:400，抗小鼠/人cd45r/b220biolegend1032121:400)染色持续30min。通过流式细胞仪(cytoflex，beckmancoulter)分析单细胞悬浮液。[0224]免疫印迹[0225]将细胞沉淀物用冰冷的pbs洗涤，并且使用ripa缓冲液(sigma，r0278)裂解。将裂解物在4℃以21,000g澄清持续15min，并且使用bca蛋白质测定(thermofisherscientific，23225)确定蛋白质浓度。包含50μg总蛋白质的样品用4×lds样品缓冲液(nupage，thermofischerscientific，np0007)制备，并且然后在4％-20％bis-tris凝胶(genescriptsurepage，m00657)上分离。将蛋白质通过电泳分离，并且然后使用trans-blotturbo系统(bio-rad)转移至硝酸纤维素膜(bio-rad，1704158)。将膜在室温用在tbs-t(w/v)中的5％bsa封闭持续1h，用tbs-t洗涤持续5min×3次，并且用以下一级抗体孵育：兔抗磷酸btk(#87141s，cell-signaling，1:1000，在4℃过夜)，小鼠抗btk(#56044s，cell-signaling，1:1000，在室温1h)，小鼠抗b-肌动蛋白(#3700，cell-signaling，1:1000，在室温1h)。将膜用tbs-t洗涤持续5min×3次，并且在室温用对应的hrp连接的二级抗体(mouse#7076/rabbit#7074，cell-signaling)孵育持续1h。ez-ecl试剂盒(biologicalindustries，20-500-1000)用于检测hrp活性。在每个二级抗体之后，使用restore剥离缓冲液(thermofisherscientific，21059)剥离膜，然后用下一个二级抗体印迹。[0226]半衰期确定[0227]使用7f的测量通过以下进行：在mino细胞中将btk用100nm7f脉冲标记持续1h，随后用pbs洗涤×3次以去除过量的探针。将细胞在37℃在5％加湿co2的培养箱中孵育，并且在指示的时间点处收获。将细胞沉淀物用ripa缓冲液裂解，用tamra-叠氮化物点击，将蛋白质通过电泳分离，并且如凝胶内荧光部分中详细描述的进行成像。btk的条带使用imagej软件进行定量，并且在时间点零处的btk水平被定义为100％。[0228]使用环己酰亚胺(chx)的测量通过用20μg/mlchx处理mino细胞来进行。在指示的时间点处收获细胞，用于通过btk和b-肌动蛋白的免疫印迹进行的随后分析。条带使用imagej进行定量，将btk信号归一化为b-肌动蛋白，并且在时间点零处的水平被定义为100％。对于这两种方法，绘制btk水平相对于时间点的图，并且将数据拟合至prism8中的单相衰减(one-phasedecay)以计算半衰期。[0229]btk的体外活性测定(由nanosyn，santaclara，ca，usa进行)[0230]将测试化合物在dmso中稀释至范围从2μm至11.3pm的最终浓度，同时所有测定中dmso的最终浓度保持在1％。将化合物用btk在包含以下的2×缓冲液中孵育持续2h：1.2nmbtk，100mmhepesph＝7.5，10mmmgcl2，2mmdtt，0.1％bsa，0.01％tritonx-100，20μm原钒酸钠和20μmβ-甘油磷酸盐。反应通过2倍稀释到包含5μmatp和底物的溶液中开始。类似地测试参考化合物星形孢菌素。[0231]b细胞反应实验[0232]将来自c57bl/6小鼠的脾细胞通过迫使脾组织通过网进入包含2％胎牛血清和1mmedta的pbs中进行分离，并且通过裂解缓冲液耗尽红细胞。将细胞在96孔u型底皿中培养(在rpmi10％fcs中1×106个细胞/ml)，并且在37℃在5％加湿co2中用不同浓度(1nm、10nm、100nm、1000nm)的btk抑制剂孵育持续24小时。孵育24小时后，将细胞用抗igm(5μg/ml，sigma-aldrich)刺激过夜。随后，将细胞在4℃用抗b220(克隆ra3-6b2，biolegend)和抗cd86(克隆gl-1，biolegend)抗体染色持续30分钟。通过流式细胞仪(cytoflex，beckmancoulter)分析单细胞悬浮液。[0233]coldr开启探针的荧光强度测量[0234]分别将2μm的btk、egfr或k-rasg12c添加至2μm3j、4b或5a。在没有蛋白质或化合物的情况下进行对照测量，并且对于btk，用2μm非共价伊布替尼预孵育持续30分钟。对于btk和k-rasg12c，每种条件在20mmtrisph8、50mmnacl中以一式三份，对于egfr，在50mmtrisph8.0、100mmnacl中以一式三份。对于btk和egfr，每2分钟进行荧光测量持续2小时，并且对于k-rasg12c，每10分钟进行荧光测量持续15小时。在测量结束时，将样品直接注射到lc/ms中用于标记％定量。k-rasg12c如先前描述表达和纯化66，egfr激酶结构域由michaeleck教授慷慨捐赠。[0235]使用1f的荧光强度测量[0236]将btk激酶结构域在缓冲液中稀释至2μm，并且2μm7m通过添加来自200μm溶液的1/100体积来添加。在不存在蛋白质和btk的情况下，用4μmibr-h/伊布替尼预孵育持续5min来进行对照测量。对于btk，每种条件在20mmtrisph8.0和50mmnacl中以一式四份进行。对于btk/k-rasg12c，每2min进行荧光测量持续1h。在测量结束时，将样品直接注射到lc/ms中用于标记定量。[0237]使用化学发光探针的hts[0238]使用gnfwdii洗涤器/分配器(novartis，usa)在1536孔白色板(nanc，cat264712)中使用selleck化合物收集以10μm进行高通量筛选。将btk用化合物预孵育持续15分钟，随后添加3k发光探针。用0.75μmbtk和1.5μm的探针以20mmtrisph8、50mmnacl、0.1％bsa、1mmdtt最终浓度进行筛选。在30分钟之后使用bmgpherastar板读取器记录发光。[0239]实施例1[0240]本发明的化合物的合成。[0241](r)-7-((2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羰基)烯丙基)氧基)-2h-色烯-2-酮(3j)的合成7.34(m,6h),7.48-7.57(m,2h),7.72(br.s.,3h),7.82(d,j＝16.3hz,1h),7.99(d,j＝15.2hz,1h),8.21(br.s.,1h)；13cnmr(125mhz,cd3od)d29.8,29.9,31.3,34.6,38.2,39.7,39.8,40.2,40.3,43.1,46.8,52.4,54.3,55.2,57.7,75.6,75.8,98.2,120.1,120.9,125.4,126.9,129.6,130.7,131.3,131.4,139.6,141.1,141.4,148.4,153.4,154.7,155.0,157.8,160.7,168.6,170.9。[0249](e)-3-(2-((2-((r)-3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羰基)烯丙基)氧基)-3-氯-5-((1r,3r,5r,7r)-4'-甲氧基螺[金刚烷-2,3'-[1,2]二氧杂环丁烷]-4'-基)苯基)丙烯酸甲酯(3k)：[0250][0251]在25℃并且在黄色光存在的情况下向烯醇醚(3l)(8.4mg，0.01mmol)在干燥dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加亚甲基蓝。将反应混合物用氧气鼓泡并且允许搅拌持续20min。在完成之后(如通过lc-ms监测的)，将dcm在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供白色固体(4.36mg，38％收率)。[0252]1hnmr(500mhz,cd3od)d1.55-1.74(m,6h),1.75-1.87(m,5h),1.96(s,2h),2.05(br.s.,1h),2.13-2.30(m,2h),2.38(br.s.,2h),3.20(s,3h),3.67(br.s.,3h),3.79(br.s.,1h),3.92(br.s.,1h),4.27-4.50(m,2h),4.65(br.s.,1h),5.06(br.s.,2h),5.50(br.s.,1h),5.72(br.s.,1h),5.79(br.s.,1h),6.49-6.63(m,1h),7.13(br.s.,5h),7.18-7.25(m,1h),7.44(t,j＝7.2hz,2h),7.64(t,j＝8.5hz,2h),7.80(br.s.,1h),7.93(d,j＝8.3hz,1h)；13cnmr(125mhz,cd3od)d27.6,28.0,28.9,33.0,33.4,34.6,35.1,37.9,38.7,49.9,50.3,52.7,52.7,53.5,75.8,97.5,113.1,119.1,119.6,120.3,121.0,125.6,127.4,127.6,131.4,131.5,131.6,134.9,137.0,138.8,141.4,150.0,158.0,160.8,162.4,168.5,171.3。[0253]2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酸[0254][0255]向7-羟基香豆素(92mg，0.56mmol)在dmf(3ml)中的搅拌的溶液中添加nah(44.8mg，1.12mmol)和溴甲基丙烯酸(90.1mg，0.56mmol)，并且允许反应混合物在氮气气氛下在25℃搅拌持续2h。在通过tlc监测反应完成之后，将反应混合物用水猝灭，并且用etoac(3×10ml)萃取。将合并的有机层用盐水溶液(3×15ml)洗涤，并且将有机层在na2so4中干燥并且然后在减压下蒸发以给出粗制酸，该粗制酸使用硅胶色谱法使用己烷:乙酸乙酯混合物纯化，以获得白色固体(105mg，76％)。[0256]1hnmr(500mhz,cdcl3)d4.82(s,2h),6.03(s,1h),6.26(d,j＝9.4hz,1h),6.50(s,1h),6.86(s,1h),6.89(d,j＝10.7hz,1h),7.38(d,j＝8.5hz,1h),7.64(d,j＝9.5hz,1h),8.04(s,2h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d66.5,102.0,112.9,113.3,127.9,128.9,135.1,143.5,155.8,161.3,161.5,168.1。[0257]n-(4-((3-氯-4-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)-2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酰胺(4b)：[0258][0259]向2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酸(12.3mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的搅拌的溶液中添加socl2(18.1μl，0.25mmol)和dmf(3.9μl，0.05mmol)，并且允许反应混合物在25℃搅拌持续4h。在完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物在真空中浓缩。将粗制酰氯溶解在ch2cl2中并且缓慢地添加至阿法替尼胺(0.05mmol，15.9mg)和dipea(17.8μl，0.1mmol)的溶液，使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化处理，以提供白色固体(12.5mg，46％收率)。[0260]1hnmr(500mhz,dmso-d6)d3.97(br.s.,3h),5.03(br.s.,2h),6.03(br.s.,1h),6.27-6.39(m,2h),7.06(d,j＝6.5hz,1h),7.12(br.s.,1h),7.32(br.s.,1h),7.37-7.46(m,1h),7.69(d,j＝8.3hz,1h),7.80(br.s.,1h),8.02(d,j＝9.1hz,1h),8.56(br.s.,1h),8.82(br.s.,1h),9.59(br.s.,1h),9.85(br.s.,1h)；13cnmr(125mhz,dmso-d6)d56.4,67.6,101.7,106.9,108.8,112.8,112.8,112.8,113.0,116.4,116.5,117.1,122.4,123.5,124.9,126.8,129.6,136.8,138.6,144.3,149.5,154.1,155.3,155.9,156.8,160.2,160.9,164.4。[0261]6-氟-7-(2-氟-6-羟基苯基)-1-(2-异丙基-4-甲基吡啶-3-基)-4-((s)-2-甲基-4-(2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酰基)哌嗪-1-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-2(1h)-酮(5a)：[0262][0263]向2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酸(a)(1.23mg，0.05mmol)在ch2cl2(200μl)中的搅拌的溶液中添加socl2(1.81μl，0.25mmol)和dmf(0.4μl，0.05mmol)，并且允许反应混合物在25℃搅拌持续4h。在完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物在真空中浓缩。将粗制酰氯溶解在ch2cl2中并且缓慢地添加至胺5b(0.005mmol，2.53mg)和dipea(1.78μl，0.01mmol)的溶液，并且允许在25℃在n2气氛下搅拌。在完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物在真空中浓缩，并且使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供白色固体5a(2.8mg，42％收率)。[0264]1hnmr(500mhz,cd3od)d1.15(t,j＝7.1hz,4h),1.24-1.35(m,6h),1.37-1.44(m,4h),2.22(d,j＝7.7hz,3h),3.02-3.11(m,3h),4.47(d,j＝19.8hz,1h),4.53(br.s.,1h),4.96(br.s.,2h),5.52-5.59(m,1h),5.81(s,1h),6.29(d,j＝9.5hz,1h),6.63(t,j＝8.9hz,1h),6.68(s,1h),7.04(s,1h),7.18(d,j＝8.5hz,1h),7.26(d,j＝7.3hz,2h),7.41-7.48(m,1h),7.59(d,j＝8.5hz,1h),7.64-7.73(m,2h),7.91(d,j＝9.5hz,1h),8.40(d,j＝8.9hz,1h),8.54-8.60(m,1h)。[0265]6a的合成：[0266][0267]在0℃向醇(3l)(23.5mg，0.05mmol)在乙酸乙酯(2ml)中的搅拌的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(40.8mg，0.2mmol)和4-二甲基氨基吡啶(24.4mg，0.2mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续2h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物用0.1nhcl(2ml)猝灭，并且将含水层用etoac(3×4ml)萃取。将有机层在真空中浓缩。将粗制反应混合物溶解在dmf(0.5ml)中并且添加至多柔比星(27.2mg，0.05mmol)。允许反应在室温进一步搅拌持续1小时。在反应完成之后，将甲醇浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供白色固体6a(22.4mg，43％收率)。[0268]6b的合成：[0269][0270]在0℃将喜树碱(15mg，0.05mmol)和pnp-氯甲酸酯(40.8mg，0.2mmol)溶解在二氯甲烷(2ml)中，随后添加dmap(24.4mg，0.2mmol)。将得到的澄清溶液在室温搅拌持续1h。通过lc-ms监测反应。在完成之后，将混合物用2ml的二氯甲烷稀释，并且用3mlhcl0.1n洗涤。将有机层经硫酸镁干燥，在减压下浓缩至10ml，并且用乙醚沉淀。将沉淀的固体过滤并且干燥，以给出粗制化合物。将粗制对硝基苯基喜树碱碳酸酯溶解在dmf中，并且添加n,n′‑二甲基乙二胺(3mg，0.05mmol)。将混合物搅拌持续30min，并且在减压下去除dmf，以给出呈粗制形式的化合物i。[0271]在另一个小瓶中，在0℃向醇(3l)(23.5mg，0.05mmol)在乙酸乙酯(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(40.8mg，0.2mmol)和4-二甲基氨基吡啶(24.4mg，0.2mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续2h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物用0.1nhcl(2ml)猝灭，并且将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩以给出粗制产物ii。[0272]向在dmf中的i的此粗制产物中添加对硝基苯基伊布替尼碳酸酯ii并且允许搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩以给出粗制产物，该粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供白色固体6b(18.4mg，39％收率)。[0273]6c的合成：[0274][0275]在25℃向溴化合物(3m)(26.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加粗制喜树碱胺(i)(0.05mmol，上文给出了i的合成)和dipea(9.8μl，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供化合物6c的白色固体(24mg，45％收率)。[0276]6d的合成：[0277][0278]afa-br化合物使用3m的合成中示出的相同程序制备，其中使用阿法替尼胺而不是ibr-h。[0279][0280]在25℃向afa-br化合物(23.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加苯丁酸氮芥(15.0mg，0.05mmol)和dipea(9.8μl，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供化合物6d的白色固体(11mg，收率32％)。[0281]6e的合成[0282][0283]在0℃向喜树碱(15mg，0.05mmol)在无水dmf(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加nah(4mg(60％在矿物油中)，0.1mmol))。在搅拌持续5min之后，在0℃在n2气氛下添加afa-br(23mg，0.05mmol)。将反应混合物在室温在n2气氛下搅拌持续4h，并且在0℃用h2o(2ml)猝灭。将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供白色固体6e(8.4mg，22％收率)。[0284]6f的合成：[0285][0286]使用针对6c的合成示出的相同的方案和程序制备6f化合物，然而3m被替换为afa-br。[0287]6g的合成：[0288][0289]在25℃向依托泊苷(29.5mg，0.05mmol)在无水dmf(0.8ml)中的搅拌的溶液中添加k2co3(27.6mg，0.1mmol)。在搅拌持续5min之后，在25℃在n2气氛下添加afa-br(23mg，0.05mmol)。将反应混合物在室温在n2气氛下搅拌持续4h，并且用h2o(2ml)猝灭。将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供28.1mg的白色固体6g(58％收率)。[0290]6h的合成[0291][0292]在25℃向afa-br化合物(23.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加丝裂霉素-c(15.0mg，0.05mmol)和dipea(9.8μl，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供化合物6h的白色固体(4mg，11％收率)。[0293]6i的合成：[0294][0295]在25℃向afa-br化合物(23.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加n-甲基乙醇胺(3.7mg，0.05mmol)和dipea(9.8μl，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将ch2cl2用水洗涤并且用ch2cl2(3×2ml)萃取，并且将有机层在真空中浓缩。在0℃将醇和pnp-氯甲酸酯(40.8mg，0.2mmol)溶解在二氯甲烷(2ml)中，随后添加dmap(24.4mg，0.2mmol)。将得到的澄清溶液在室温搅拌持续1h。通过lc-ms监测反应。在完成之后，将混合物用2ml的二氯甲烷稀释，并且用3mlhcl0.1n洗涤。将有机层经硫酸镁干燥，在减压下浓缩至10ml，并且用乙醚沉淀。将沉淀的固体过滤并且干燥，以给出粗制化合物。将粗制碳酸酯溶解在dmf中，并且添加多柔比星(27mg，0.05mmol)。将混合物搅拌持续30min，并且将dmf在减压下去除，以给出化合物6i(5mg，10％收率)。[0296]7a的合成：[0297][0298]在25℃向ibr-h(387mg，1mmol)在无水dcm(6ml)中的搅拌的溶液中添加dipea(178μl，1mmol)和2-(溴甲基)丙烯酸(161mg，1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。[0299]以己烷：乙酸乙酯：甲醇溶剂体系，使用快速柱色谱法纯化粗制羧酸，以得到纯的羧酸7j(334mg，收率72％)。[0300][0301]在25℃向羧酸(23.5mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(23mg，0.06mmol)、dipea(11μl，0.6mmol)和n-甲基丙-2-炔-1-胺盐酸盐(6.3mg，0.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供18mg白色固体7a(69％收率)。[0302]7b的合成：[0303][0304]7b的合成与7e相同，其中n-boc乙二胺被替换为n-boc乙醇胺。[0305]7c的合成：[0306]将2μl的ibr-h的100mm溶液和2μl的溴甲基丙烯酸乙酯的100mm溶液混合，并且每5分钟进行涡旋，持续30分钟。将得到的4μl的50mm溶液按原样用于与btk进行体外结合。[0307]7d的合成：[0308][0309]在25℃向羧酸(23.5mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(23mg，0.06mmol)、dipea(11μl，0.6mmol)和丁-3-炔-1-胺盐酸盐(6.3mg，0.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供18mg白色固体7a(69％收率)。[0310]7e的合成：[0311][0312]在25℃向胺-7m(0.05mmol，26mg)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加dipea(9μl，0.05mmol)和fitc(19mg，0.05mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供29mg白色固体7e(66.0％收率)。[0313]7f的合成：[0314][0315]在25℃向羧酸(15.3mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(23mg，0.12mmol)、dipea(11μl，0.12mmol)和胺7m(26mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供15mg白色固体7f(37.5％收率)。[0316]7g的合成：[0317][0318]在25℃向依沃卢替尼胺(37.5mg，0.1mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加dipea(17.8μl，0.1mmol)和2-(溴甲基)丙烯酸(16.1mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供40mg依沃卢替尼酸的白色固体(78％收率)。[0319][0320]在25℃向依沃卢替尼酸(23mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(23mg，0.06mmol)、dipea(11μl，0.6mmol)和丁-3-炔-1-胺盐酸盐(6.3mg，0.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供14mg白色固体7a(56％收率)。[0321]7h的合成：[0322][0323]在25℃向amg-510胺(2.5mg，0.005mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加dipea(1.6μl，0.01mmol)和化合物2a(2.9mg，0.01mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续12h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供1mg白色固体7h(31.0％收率)。[0324][0325]在25℃向阿法替尼胺(32mg，0.1mmol)在无水dcm(2ml)中的搅拌的溶液中添加dipea(17.8μl，0.1mmol)和2-(溴甲基)丙烯酸(16.1mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供16mg阿法替尼羧酸的白色固体(42％收率)。[0326][0327]在25℃向羧酸(20mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(23mg，0.06mmol)、dipea(11μl，0.06mmol)和n-甲基丙-2-炔-1-胺盐酸盐(6.3mg，0.06mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供12.4mg白色固体7i(55％收率)。[0328][0329]在25℃向羧酸7j(188mg，0.4mmol)在ch2cl2(5ml)中的溶液中添加hatu(182mg，0.48mmol)、dipea(85μl，0.48mmol)和n-boc乙二胺(96mg，0.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续2h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且将粗制产物溶解在二氯甲烷中的50％tfa中，并且允许在25℃搅拌持续2h。将反应混合物浓缩并且通过使用以己烷：乙酸乙酯：甲醇溶剂体系的快速柱色谱法纯化，以得到94mg纯的羧酸7m(46.0％收率)。[0330]7m的合成：[0331][0332]在25℃向羧酸(19mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(23mg，0.12mmol)、dipea(11μl，0.12mmol)和胺7k(26mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供9mg白色固体7m(20％收率)。[0333]7n的合成[0334][0335]在25℃向胺7k(6.4mg，0.0125mmol)在ch2cl2(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加bodipynhs酯(4.9mg，0.0125mmol)、dipea(2.2μl，0.025mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物在真空下浓缩，并且使用水:acn(0.1％tfa)溶剂梯度通过制备型hplc纯化粗制产物，以提供6.2mg作为亮黄色固体的7n(收率＝64％)。[0336]1hnmr(400mhz,cd3od):δ1.32-1.37(m,2h),1.85-2.02(br.s.,2h),2.21(d,j＝7.5hz,2h),2.28(s,3h),2.46(br.s.,4h),3.10(t,j＝7.7hz,2h),3.14(dt,j＝3.3,1.7hz,1h),3.49(dt,j＝3.2,1.7hz,1h),3.58-3.73(m,3h),3.77(s,1h),3.95-4.03(m,1h),4.03-4.11(m,1h),4.15(d,j＝12.8hz,1h),5.36-5.46(m,1h),6.02(s,1h),6.21(s,2h),6.25(br.s.,1h),6.96(br.s.,1h),7.11(d,j＝7.7hz,2h),7.18(d,j＝9.5hz,2h),7.20-7.25(m,1h),7.35-7.50(m,3h),7.52-7.64(m,1h),7.80-7.92(m,1h),8.38(br.s.,1h)；13cnmr(100mhz,cd3od):δ11.3,15.0,20.0,25.7,28.4,36.1,41.0,52.1,53.2,55.5,61.2,117.5,120.0,120.9,121.6,125.5,125.9,127.4,129.7,131.3,132.0,134.9,136.7,140.5,146.2,153.5,154.2,157.9,158.4,160.7,161.6,169.3,175.2；hr-ms(m/z):c42h46bf2n10o3的计算值[m+h]+：787.3815；实测值[m+h]+：787.3828。[0337]8a和8b的合成：[0338][0339]在25℃向羧酸(0.1mmol)在ch2cl2(5ml)中的溶液中添加hatu(45.6mg，0.12mmol)、n,n-二异丙基乙胺(dipea)(21.5μl，0.12mmol)和克唑替尼胺(45mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续2h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且将粗制产物溶解在二氯甲烷中的50％tfa中，并且允许在25℃搅拌持续2h。将反应混合物浓缩并且使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供白色固体8g/8h。[0340][0341]在25℃向羧酸(23.5mg，0.05mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(23mg，0.12mmol)、dipea(11μl，0.12mmol)和8g/8h(0.05mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供白色固体8a/8b。[0342]8c和8d的合成：[0343]8c和8d的合成已经使用与8a和8b的合成所使用的相同的方案和程序进行，其中克唑替尼胺被阿法替尼胺替换。[0344][0345]8e的合成：[0346][0347]在25℃向吲哚羧酸(27.3mg，0.1mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(6.9μl，0.1mmol)和2-(溴甲基)丙烯酸(16.1mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。[0348]在25℃向粗制羧酸在ch2cl2(0.5ml)中的溶液中添加hatu(45.6mg，0.12mmol)、dipea(21.5μl，0.12mmol)和丁-3-炔-1-胺盐酸盐(12.6mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供9.8mg白色固体8e(37％收率)。[0349]8f的合成：[0350][0351]在25℃向吲哚羧酸(27.3mg，0.1mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加socl2(73μl，1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续4h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制酰氯。将粗制酰氯溶解在1mlthf中，并且倒入0℃的5ml氢氧化铵溶液中，并且允许搅拌持续10min。将反应混合物在真空中浓缩，并且使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以60％收率提供白色固体8j(14mg)。[0352][0353]在25℃在n2气氛下向8j(14mg，0.05mmol)在无水dmf(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加nah(6.9μl，0.1mmol)和2-(溴甲基)丙烯酸(16.1mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续3h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供白色固体羧酸。[0354]在25℃向羧酸(5mg，0.02mmol)在ch2cl2(0.5ml)中的溶液中添加hatu(11.4mg，0.03mmol)、dipea(5μl，0.03mmol)和丁-3-炔-1-胺盐酸盐(3.1mg，0.03mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供9.8mg白色固体8f(37％收率)。[0355]实施例2[0356]本发明的模型化合物的合成。[0357]n-苄基-2-(羟甲基)丙烯酰胺(1k)[0358][0359]在25℃向丙烯酰胺(644mg，4mmol)在1，4-二氧六环∶h2o(3∶1v/v，12ml)中的搅拌的溶液中添加dabco(492.8mg，4.4mmol)、苯酚(87μl，1mmol)和多聚甲醛(2.4g，80mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续3d。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩1，4-二氧六环，并且将含水层用etoac(3×30ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用etoac/石油醚作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化，以给出作为白色固体的纯的醇(412mg，收率＝54％)。[0360]n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)[0361][0362]在0℃在n2气氛下向醇(191mg，1mmol)在ch2cl2(5ml)中的搅拌的溶液中添加pbr3(105μl，1.1mmol)和dmf(77μl，1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h，并且用0℃的h2o(5ml)猝灭。将含水层用ch2cl2(3×8ml)萃取，在真空中浓缩。使用etoac/石油醚作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化粗制产物，以给出作为白色固体的纯的溴化合物(207mg，收率＝82％)。[0363]n-苄基甲基丙烯酰胺(1a)[0364][0365]在25℃向苄胺(10.6mg，0.1mmol)在无水dcm(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(13.9μl，0.1mmol)和甲基丙烯酸酐(15.4μl，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供15.1mg的白色固体1a(86.2％收率)。[0366]1hnmr(500mhz,cdcl3)d1.99(s,3h),4.51(d,j＝5.6hz,2h),5.36(s,1h),5.73(s,1h),6.12(br.s.,1h),7.27-7.38(m,5h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d18.7,43.8,119.7,127.5,127.8,128.7,138.2,139.9,168.3。[0367]n-苄基-2-(哌啶-1-基甲基)丙烯酰胺(1b)[0368][0369]在25℃向哌啶(9.9μl，0.1mmol)在无水dcm(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(13.9μl，0.1mmol)和n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)(25.4mg，0.1mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供20.1mg白色固体1b(78％收率)。[0370]1hnmr(400mhz,cdcl3)d1.56(br.s.,1h)1.91(br.s.,3h)2.02(d,j＝11.7hz,2h)2.81(t,j＝11.3hz,2h)3.62(d,j＝11.7hz,2h)4.05(s,2h)4.69(d,j＝5.9hz,3h)6.21(s,1h)6.35(s,1h)7.35-7.59(m,5h)7.78(br.s.,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)d21.7,22.7,43.9,53.2,56.7,127.6,127.8,128.7,129.4,133.8,137.7,167.0。[0371]n-苄基-2-((甲基(苯基)氨基)甲基)丙烯酰胺(1c)[0372][0373]在25℃向n-甲基苯胺(10.7mg，0.1mmol)在无水dcm(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(13.9μl，0.1mmol)和n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)(25.4mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供22.4mg白色固体1c(80％收率)。[0374]1hnmr(500mhz,cdcl3)δ3.06(s,3h)4.28(s,2h)4.42(d,j＝5.64hz,2h)5.76(s,1h)6.03(s,1h)7.13-7.19(m,1h)7.22(t,j＝8.05hz,4h)7.30(d,j＝7.02hz,1h)7.32(s,1h)7.34-7.39(m,2h)8.63(br.s.,2h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)δ41.7,43.7,57.8,118.2,124.7,125.8,127.6,127.7,128.7,129.8,136.6,137.5,145.0,160.8,161.1,167.3。[0375]n-苄基-2-((苄基氨基)甲基)丙烯酰胺(1d)[0376][0377]在25℃向苄胺(10.7mg，0.1mmol)在无水dcm(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(13.9μl，0.1mmol)和n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)(25.4mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供22.5mg白色固体1d(80％收率)。[0378]1hnmr(500mhz,cdcl3)d3.84(s,2h),4.20(s,2h),4.46(d,j＝5.5hz,2h),5.86(s,1h),6.00(s,1h),6.98(br.s.,1h),7.28-7.39(m,6h),7.40-7.49(m,4h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d43.9,49.3,51.0,127.0,127.9,128.3,128.9,129.4,129.8,129.9,130.1,133.5,137.0,167.4。[0379]n-苄基-2-(苯氧基甲基)丙烯酰胺(1e)[0380][0381]在25℃向苯酚(9.4mg，0.1mmol)在无水dmf(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加k2co3(27.6mg，0.2mmol)。在搅拌持续5min之后，在25℃在n2气氛下添加n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)(25.4mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温在n2气氛下搅拌持续4h，并且用h2o(2ml)猝灭。将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供14.4mg白色固体1e(53.9％收率)。[0382]1hnmr(500mhz,cdcl3)d4.56(d,j＝5.64hz,2h)4.82(s,3h)5.74(s,1h)6.10(s,1h)6.67(br.s.,1h)6.92(d,j＝7.98hz,2h)7.00(t,j＝7.29hz,1h)7.26-7.29(m,1h)7.29-7.33(m,4h)7.33-7.39(m,2h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d43.7,67.9,114.9,121.6,123.1,127.6,127.7,128.7,129.6,137.9,139.2,157.7,166.3。[0383]n-苄基-2-((4-硝基苯氧基)甲基)丙烯酰胺(1f)[0384][0385]在25℃向4-硝基苯酚(13.9mg，0.1mmol)在无水dmf(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加k2co3(27.6mg，0.2mmol)。在搅拌持续5min之后，在25℃在n2气氛下添加n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)(25.4mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温在n2气氛下搅拌持续4h，并且用h2o(2ml)猝灭。将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供20.2mg白色固体1f(64.7％收率)。[0386]1hnmr(500mhz,cdcl3)d4.54(d,j＝5.8hz,2h),4.92(s,2h),5.76(s,1h),5.96(s,1h),6.46(br.s.,1h),7.00(d,j＝9.2hz,2h),7.29-7.40(m,5h),8.19(d,j＝9.2hz,2h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d43.7,67.7,114.8,121.2,125.9,127.7,128.8,137.6,139.0,141.9,162.9,166.1。[0387]n-苄基-2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酰胺(1g)[0388][0389]在25℃向7-羟基-2h-色烯-2-酮(16.2mg，0.1mmol)在无水dmf(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加k2co3(27.6mg，0.2mmol)。在搅拌持续5min之后，在25℃在n2气氛下添加n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)(25.4mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温在n2气氛下搅拌持续4h，并且用h2o(2ml)猝灭。将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供18.1mg的白色固体1g(54％收率)。[0390]1hnmr(500mhz,cdcl3)d4.54(d,j＝5.6hz,2h),4.88(s,2h),5.75(s,1h),6.00(s,h),6.24(d,j＝9.5hz,1h),6.58(br.s.,1h),6.83(d,j＝2.2hz,1h),6.85-6.88(m,1h),7.28-7.32(m,3h),7.34(d,j＝7.2hz,2h),7.37(d,j＝8.7hz,1h),7.62(d,j＝9.5hz,1h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d43.6,67.8,102.2,112.6,113.4,121.8,127.6,127.7,128.7,128.8,137.7,139.0,143.2,155.6,161.0,166.0。[0391]n-苄基-2-((苄氧基)甲基)丙烯酰胺(1h)[0392][0393]在0℃向n-苄基-2-(羟甲基)丙烯酰胺(1h)(19.1mg，0.1mmol)在无水dmf(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加nah(8mg(60％在矿物油中)，0.2mmol))。在搅拌持续5min之后，在0℃在n2气氛下添加苄基溴(13μl，0.11mmol)。将反应混合物在室温在n2气氛下搅拌持续4h，并且在0℃用h2o(2ml)猝灭。将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供18.4mg白色固体1h(65.4％收率)。[0394]1hnmr(500mhz,cdcl3)δ4.31(s,2h),4.46-4.58(m,4h),5.61(s,1h),6.30(d,j＝1.2hz,1h),7.18-7.25(m,2h),7.25-7.38(m,10h)。13cnmr(125mhz,cdcl3)δ43.6,70.5,72.0,125.7,127.4,127.8,128.0,128.0,128.6,128.7,137.0,138.1,138.6,166.3。[0395]2-(苄基氨基甲酰基)烯丙基苯甲酸酯(1i)[0396][0397]在25℃向苯甲酸(12.2mg，0.1mmol)在无水dcm(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(13.9μl，0.1mmol)和n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(1l)(25.4mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供19.4mg白色固体1i(65.7％收率)。[0398]1hnmr(500mhz,cdcl3)δ2.47(br.s.,1h),4.55(s,2h),5.12(s,2h),5.74(s,1h),6.05(s,1h),6.56(br.s.,1h),7.30(s,3h),7.43(t,j＝7.77hz,2h),7.58(t,j＝7.43hz,1h),7.99(d,j＝7.70hz,1h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)δ43.7,63.8,123.2,127.5,127.7,128.4,128.7,129.5,129.6,133.2,137.8,139.1,166.0。[0399]2-(苄基氨基甲酰基)烯丙基(4-硝基苯基)碳酸酯(1j)[0400][0401]在25℃向n-苄基-2-(羟甲基)丙烯酰胺(1h)(19.2mg，0.1mmol)在无水乙酸乙酯(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(80.4mg，0.4mmol)和4-二甲基氨基吡啶(25.4mg，0.4mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物用0.1nhcl(2ml)猝灭，并且将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供18.6mg白色固体1j(52.2％收率)。[0402]1hnmr(400mhz,cdcl3)d4.66(d,j＝5.5hz,2h)5.17(s,2h)5.89(s,1h)6.07(s,1h)6.41(br.s.,1h)7.29-7.54(m,7h)8.38(d,j＝9.2hz,2h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)d43.9,67.9,121.7,123.0,125.3,127.8,127.9,128.9,138.4,152.1,155.3,165.7。[0403]n-(丁-3-炔-1-基)-2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酰胺(2a)[0404][0405]在25℃向2-(((2-氧代-2h-色烯-7-基)氧基)甲基)丙烯酸(合成在实施例1中描述)(24.7mg，0.1mmol)在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(45.6mg，0.12mmol)、dipea(21.5μl，0.12mmol)和丁-3-炔-1-胺盐酸盐(12.6mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供16.14mg白色固体2a(54％收率)。[0406]1hnmr(400mhz,cdcl3)d2.01(t,j＝2.5hz,1h),2.48(td,j＝6.4,2.6hz,2h),3.52(q,j＝6.3hz,2h),4.86(s,2h),5.76(s,1h),6.03(s,1h),6.27(d,j＝9.5hz,1h),6.57(br.s.,1h),6.85-6.95(m,2h),7.40(d,j＝8.4hz,1h),7.64(d,j＝9.5hz,1h)；13cnmr(100mhz,cdcl3)d19.3,38.0,67.9,70.3,81.3,102.3,112.7,113.1,113.6,122.3,128.9,138.8,143.3,155.7,161.0,166.2。[0407]n-(丁-3-炔-1-基)-2-((甲基(苯基)氨基)甲基)丙烯酰胺(2b)[0408][0409]在25℃向n-甲基苯胺(10.3mg，0.1mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(6.9μl，0.1mmol)和2-(溴甲基)丙烯酸(16.1mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。[0410]在25℃向粗制羧酸在ch2cl2(1ml)中的溶液中添加hatu(45.6mg，0.12mmol)、dipea(21.5μl，0.12mmol)和丁-3-炔-1-胺盐酸盐(12.6mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供10.9mg白色固体2b(经2个步骤45.0％收率)。[0411]1hnmr(400mhz,cdcl3)d1.98(t,j＝2.6hz,1h),2.26-2.36(m,2h),3.18(s,3h),3.31(d,j＝6.2hz,2h),4.37(s,2h),6.15(s,1h),6.27(s,1h),6.86(br.s.,1h),7.40(d,j＝7.3hz,1h),7.43-7.51(m,2h),7.63(d,j＝7.9hz,2h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d19.1,38.2,43.0,57.9,70.3,81.0,120.0,127.2,128.0,130.0,135.3,159.4,167.1。[0412]2-(丁-3-炔-1-基氨基甲酰基)烯丙基苯甲酸酯(2c)[0413][0414]在25℃向苯甲酸(10.7mg，0.1mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(6.9μl，0.1mmol)和2-(溴甲基)丙烯酸(16.1mg，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2以获得粗制羧酸。[0415]在25℃向粗制羧酸在ch2cl2(0.5ml)中的溶液中添加(1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐(hatu)(45.6mg，0.12mmol)、二异丙基乙胺(dipea)(21.5μl，0.12mmol)和丁-3-炔-1-胺盐酸盐(12.6mg，0.12mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加水。将含水层用ch2cl2(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供9.8mg白色固体2c(37％收率)。[0416]1hnmr(500mhz,cdcl3)d1.92(t,j＝2.6hz,1h),2.47(td,j＝6.3,2.6hz,2h),3.52(q,j＝6.2hz,2h),5.11(s,2h),5.76(s,1h),6.07(s,1h),6.52(br.s.,1h),7.42-7.50(m,2h),7.55-7.64(m,1h),8.07(dd,j＝8.3,1.1hz,2h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d19.3,38.1,63.8,70.2,81.3,123.4,128.5,129.7,133.3,139.1,166.2。[0417](r)-3-(4-苯氧基苯基)-1-(哌啶-3-基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(伊布替尼)[0418][0419]在0℃在n2气氛下向丙烯酸(1.02ml，15mmol)在无水ch2cl2(50ml)中的搅拌的溶液中添加n-(3-二甲基氨基丙基)-n′‑乙基碳二亚胺盐酸盐(edc.hcl)(2.88g，15mmol)、n,n-二异丙基乙胺(2.60ml，15mmol)和胺(3.87g，10mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续4h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，添加h2o(30ml)。将有机层用ch2cl2(3×50ml)萃取，并且在真空中浓缩。使用etoac/石油醚作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化粗制产物，以给出作为白色固体的纯的伊布替尼(3.46g，收率＝78％)。[0420](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-(羟甲基)丙-2-烯-1-酮(3l)[0421][0422]在25℃向伊布替尼(440mg，1mmol)在1,4-二氧六环:h2o(3:1v/v，12ml)中的搅拌的溶液中添加1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷(dabco)(123.2mg，1.1mmol)、苯酚(21.8μl，0.25mmol)和多聚甲醛(600mg，20mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续3d。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩1,4-二氧六环，并且将含水层用etoac(3×30ml)萃取。将合并的有机层在真空中浓缩，并且粗制产物使用etoac/石油醚作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化，以给出作为白色固体的纯的醇(3l)(286.7mg，收率＝61％)。[0423]1hnmr(400mhz,dmso-d6)d1.54(br.s.,1h),1.93(br.s.,1h),1.99-2.22(m,2h),2.78-2.99(m,1h),3.08-3.22(m,1h),3.25-3.41(m,2h),3.43-3.69(m,2h),4.68(br.s.,2h),5.34(br.s.,1h),6.98-7.19(m,5h),7.38(t,j＝7.9hz,2h),7.57(d,j＝7.9hz,2h),8.17(s,1h)；13cnmr(100mhz,dmso-d6)d25.1,30.4,46.0,47.7,53.0,62.9,98.4,115.1,120.0,120.1,125.2,128.2,131.1,131.3,144.8,144.9,154.3,156.6,156.9,158.5,159.0,170.8。[0424](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-(溴甲基)丙-2-烯-1-酮(3m)[0425][0426]在0℃在n2气氛下向醇(3l)(235mg，0.5mmol)在ch2cl2(5ml)中的搅拌的溶液中添加pbr3(52.5μl，0.55mmol)和dmf(37.5μl，0.5mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1h，并且在0℃用h2o(5ml)猝灭。将含水层用ch2cl2(3×8ml)萃取，并且在真空中浓缩。使用etoac/石油醚作为洗脱剂通过硅胶柱色谱法纯化粗制产物，以给出作为白色固体的纯的溴化合物(427mg，收率＝80％)。[0427]1hnmr(500mhz,cd3od)d1.85(br.s.,1h),2.11(br.s.,1h),2.29(d,j＝12.8hz,1h),2.35-2.49(m,1h),3.43-3.60(m,1h),3.68-3.80(m,1h),3.80-3.90(m,1h),4.05-4.13(m,1h),4.25(br.s.,1h),4.29-4.37(m,1h),4.52(br.s.,2h),5.02(br.s.,1h),5.29-5.40(m,1h),5.68(br.s.,1h),7.13(d,j＝8.7hz,2h),7.16-7.26(m,3h),7.44(t,j＝8.0hz,2h),7.72(d,j＝8.5hz,2h),8.43(br.s.,1h)；13cnmr(125mhz,cd3od)d25.7,30.8,33.5,43.2,46.9,52.4,54.4,55.5,98.4,119.9,120.2,120.3,120.7,120.9,125.3,125.4,127.4,131.3,131.5,141.4,148.6,148.7,153.5,154.8,157.9,160.8,161.8,162.1,170.7。[0428](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-甲基丙-2-烯-1-酮(3a)[0429][0430]在25℃向ibr-h(38.7mg，0.1mmol)在无水dcm(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加et3n(13.9μl，0.1mmol)和甲基丙烯酸酐(15.4μl，0.1mmol)。将反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供36.1mg的白色固体3a(79.5％收率)。[0431]1hnmr(500mhz,cdcl3)d1.66-1.79(m,1h),1.98(s,3h),2.06(d,j＝14hz,1h),2.22-2.32(m,1h),2.38(d,j＝11hz,1h),3.24(br.s.,1h),3.54(br.s.,1h),4.03(br.s.,1h),4.69(br.s.,1h),4.91(br.s.,1h),5.12(s,1h),5.23(br.s.,1h),6.34(br.s.,1h),7.12(d,j＝8hz,2h),7.19(m,j＝8hz,2h),7.23(t,j＝7hz,1h),7.44(t,j＝8hz,2h),7.60(m,j＝8hz,2h),8.28(s,1h),11.55(br.s.,1h)；13cnmr(125mhz,cdcl3)d20.5,24.9,30.2,45.3,46.9,53.4,97.1,114.7,115.9,117.0,119.2,119.9,124.6,125.1,129.7,130.1,140.0,145.8,147.0,151.5,153.6,155.7,159.8,163.4,163.7,171.8。[0432](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-((二乙基氨基)甲基)丙-2-烯-1-酮(3b)：[0433][0434]在25℃向二乙氨基盐酸盐(5.9mg，0.055mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加dipea(19.1μl，0.11mmol)和溴化合物(3m)(26.5mg，0.05mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供化合物3b的白色固体(19.4mg，64％收率)。[0435][0436]1hnmr(500mhz,dmso-d6)d1.22(t,j＝7.08hz,6h16),1.71(br.s.,1h10a),1.95(d,j＝12.65hz,1h9a),2.10-2.22(m,1h10b),2.24-2.40(m,1h9b),2.96(br.s.,1h11a),3.13(br.s.,4h15),3.29(br.s.,1h11b),3.95(br.s.,2h14),4.19(br.s.,1h12a),4.32-4.49(br.s.,1h12b),4.80-4.91(m,1h8),5.80(br.s.,1h13a),5.87-6.04(m,1h13b),7.14(d,j＝8.25hz,2h3),7.17(d,j＝8.53hz,2h4),7.21(t,j＝7.70hz,1h1),7.45(t,j＝7.77hz,2h2),7.67(d,j＝8.39hz,2h5),8.35(br.s.,1h7),9.18(br.s.,1h6)；13cnmr(125mhz,dmso-d6)d8.8,8.9,9.1,11.5,29.7,29.9,44.0,47.0,47.1,54.0,97.7,115.5,117.9,119.4,119.5,124.4,127.8,127.9,130.6,130.6,144.5,153.9,156.7,157.8,158.5,158.8,167.9。[0437](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-(哌啶-1-基甲基)丙-2-烯-1-酮(3c)[0438][0439]在25℃向溴化合物(3m)(26.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加哌啶(5.43μl，0.055mmol)和n,n-二异丙基乙胺(dipea)(9.8μl，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供白色固体(18.8mg，70％收率)。[0440]1hnmr(500mhz,cd3od):d1.71-1.91(m,4h),1.97(m,2h),2.11(br.s.,1h),2.25-2.34(m,1h),2.43(br.s.,1h),2.82-3.00(m,2h),3.44-3.65(m,3h),3.73(br.s.,1h),3.85(br.s.,1h),3.88-4.07(m,2h),4.32(br.s.,1h),4.49(br.s.,1h),5.05(br.s.,1h),5.85(s,1h),5.94(br.s.,1h),7.13(d,j＝7.8hz,2h),7.19(d,j＝8.7hz,2h),7.21-7.25(m,1h),7.44(t,j＝8.0hz,2h),7.71(d,j＝8.5hz,2h),8.42(s,1h)；13cnmr(125mhz,cd3od)d22.8,24.3,25.5,30.8,34.2,43.3,47.0,52.3,54.2,54.6,60.7,98.5,120.2,120.9,125.5,127.5,128.9,131.3,131.5,133.3,148.3,153.7,155.3,157.8,160.8,162.6,162.9,170.0。[0441](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-((甲基(苯基)氨基)甲基)丙-2-烯-1-酮(3d)[0442][0443]在25℃向溴化合物(3m)(26.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加n-甲基苯胺(5.95μl，0.055mmol)和dipea(9.8μl，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供化合物3d的白色固体(19.8mg，71％收率)。[0444]1hnmr(500mhz,cd3od)d1.49(br.s.,1h),1.98(br.s.,1h),2.19(br.s.,1h),2.24(br.s.,1h),2.31(br.s.,1h),3.02(br.s.,3h),3.66(dd,j＝13.1,9.4hz,1h),3.82(br.s.,1h),4.08-4.18(m,1h),4.19-4.29(m,1h),4.39(br.s.,1h),5.24-5.34(m,1h),5.41(br.s.,1h),6.79(br.s.,1h),6.83-6.93(m,1h),7.10(d,j＝7.3hz,2h),7.14-7.28(m,4h),7.42(t,j＝7.9hz,2h),7.69(d,j＝8.3hz,2h),8.37-8.46(m,1h)；13cnmr(125mhz,cd3od)d25.4,30.8,40.1,46.9,52.3,54.4,57.8,98.5,114.8,120.4,121.0,124.1,125.6,127.4,130.6,131.6,132.6,141.7,148.3,148.6,149.8,153.5,158.0,161.0,172.2。[0445](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-((苄基氨基)甲基)丙-2-烯-1-酮(3e)：[0446][0447]在25℃向溴化合物(3m)(26.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加苄胺(6.0μl，0.055mmol)和dipea(9.8μl，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供化合物3e的白色固体(18.7mg，67％收率)。[0448]1hnmr(500mhz,cd3od):d1.77(br.s.,1h),2.08(br.s.,1h),2.27(m,1h),2.39(br.s.,1h),3.44-3.68(br.s.,1h),3.76-3.87(m,2h),4.20(br.s.,2h),4.32(br.s.,1h),4.48(br.s.,1h),4.99(br.s.,1h),5.78(br.s.,1h),5.86(br.s.,1h),7.09(d,j＝7.8hz,2h),7.14-7.22(m,3h),7.39(s,2h),7.45-7.54(m,5h),7.69(d,j＝8.5hz,2h),8.35(br.s.,1h)；13cnmr(125mhz,cd3od)d25.6,30.9,43.3,47.0,50.8,52.0,54.0,98.8,119.2,120.1,120.9,125.4,126.5,127.9,130.6,131.0,131.2,131.3,131.4,132.4,134.6,140.6,147.7,151.4,154.2,157.9,160.7,162.8,170.2。[0449](r)-1-(2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羰基)烯丙基)-4-(二甲基氨基)吡啶-1-鎓(3f)：[0450][0451]在25℃向溴化合物(3m)(26.5mg，0.05mmol)在无水dcm(1ml)中的搅拌的溶液中添加n,n-二甲基氨基吡啶(6.7mg，0.055mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1小时。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供化合物3f的白色固体(15.8mg，55％收率)。[0452]1hnmr(500mhz,cd3od):d1.61(m,1h),2.03(br.s.,1h),2.22(m,1h),2.34(br.s.,1h),3.26(s,6h),3.40(br.s.,1h),3.69(br.s.,1h),3.93(br.s.,1h),4.34(br.s.,2h),4.98(br.s.,2h),5.61(br.s.,2h),7.01(d,j＝7.6hz,3h),7.09(m,j＝8.1hz,2h),7.13-7.24(m,3h),7.41(t,j＝7.8hz,2h),7.68(m,j＝8.5hz,2h),8.06-8.21(m,2h),8.39(s,1h)；13cnmr(125mhz,cd3od)d24.0,29.3,32.7,39.0,41.6,45.4,52.5,59.1,97.1,107.6,115.4,117.7,118.6,119.2,120.8,123.9,126.3,129.7,137.7,141.9,156.4,156.7,159.1,160.8,161.1,161.3,161.6,167.8。[0453](r)-2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羰基)烯丙基乙酸酯(3g)[0454][0455]在25℃向醇(3l)(22mg，0.05mmol)在无水dcm(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加乙酰氯(4.25μl，0.06mmol)和dipea(10.6μl，0.06mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续1h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，在真空中浓缩ch2cl2。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供白色固体3g(16.3mg，64％收率)。[0456]1hnmr(400mhz,cd3od):d1.85(d,j＝10.3hz,1h),2.17(br.s.,4h),2.27-2.42(m,1h),2.50(d,j＝9.2hz,1h),3.58(br.s.,1h),3.84(br.s.,1h),4.08(br.s.,1h),4.40(br.s.,1h),4.49(br.s.,1h),4.84(br.s.,2h),5.08(br.s.,1h),5.48(br.s.,1h),5.59(br.s.,1h),5.65(br.s.,1h),7.15-7.34(m,5h),7.44-7.59(m,2h),7.79(d,j＝8.6hz,2h),8.50(s,1h)；13cnmr(100mhz,cd3od)d20.8,24.0,30.8,43.0,46.8,54.2,65.9,98.5,119.1,119.8,120.2,120.4,120.9,127.4,129.9,131.0,131.2,131.3,131.5,140.9,148.4,153.6,155.8,157.9,158.5,159.7,160.8,170.9,172.4。[0457](r)-2-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-羰基)烯丙基乙酸酯(3h)[0458][0459]在0℃向醇(3l)(23.5mg，0.05mmol)在乙酸乙酯(0.5ml)中的搅拌的溶液中添加4-硝基苯基氯甲酸酯(40.8mg，0.2mmol)和4-二甲基氨基吡啶(24.4mg，0.2mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续2h。在反应完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物用0.1nhcl(2ml)猝灭，并且将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层在真空中浓缩并且溶解在meoh(0.5ml)中。允许反应在室温进一步搅拌持续1小时。在反应完成之后，将甲醇浓缩，并且粗制产物使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化，以提供白色固体3h(13.4mg，51％收率)。[0460]1hnmr(400mhz,cd3od):d1.80-1.91(m,1h),2.15-2.23(m,1h),2.33-2.40(m,1h),2.50(br.s.,1h),3.56(br.s.,1h),3.87(br.s.,3h),3.99-4.17(m,1h),4.46-4.60(m,1h),4.87(d,j＝12.1hz,2h),5.04-5.15(m,1h),5.51(br.s.,1h),5.68(br.s.,1h),7.12-7.37(m,5h),7.48-7.56(m,2h),7.79(d,j＝8.6hz,2h),8.50(s,1h)；13cnmr(100mhz,cd3od)d25.4,28.9,30.8,46.8,54.2,55.7,69.2,119.6,120.2,120.8,125.4,127.5,130.2,131.3,131.5,133.2,140.5,148.4,149.0,157.0,157.9,160.8,170.7。[0461](r)-1-(3-(4-氨基-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)哌啶-1-基)-2-(苯氧基甲基)丙-2-烯-1-酮(3i)[0462][0463]在25℃在n2气氛下，向溴化合物(3m)(26.5mg，0.05mmol)在干燥dmf(1ml)中的搅拌的溶液中添加苯酚(4.7μl，0.055mmol)和k2co3(15.2mg，0.11mmol)。允许反应混合物在室温搅拌持续4h。在完成之后(如通过lc-ms监测的)，将反应混合物用h2o(2ml)猝灭。将含水层用etoac(3×3ml)萃取。将有机层用盐水洗涤并且在真空中浓缩。使用水:acn(0.1％甲酸)溶剂梯度通过高压液相色谱法(hplc)纯化粗制产物，以提供白色固体(收率16.6mg，61％)。[0464]1hnmr(400mhz,cd3od)d1.84(br.s.,1h),2.33-2.41(m,1h),2.46(d,j＝11.4hz,1h),3.00(br.s.,1h),3.25-3.48(m,1h),3.68(br.s.,1h),3.86(br.s.,1h),4.66-4.84(m,2h),4.88(br.s.,1h),4.99-5.11(m,1h),5.48(br.s.,1h),5.72(br.s.,1h),6.47(br.s.,1h),6.96-7.12(m,2h),7.21(m,j＝7.7hz,2h),7.27(d,j＝8.1hz,1h),7.32-7.43(m,3h),7.46-7.59(m,2h),7.67(m,j＝8.4hz,2h),8.40(br.s.,1h),10.56(br.s.,1h)；13cnmr(100mhz,cd3od):d24.6,30.2,45.6,47.3,53.3,68.8,96.9,114.6,118.1,119.2,120.0,121.4,124.7,129.5,129.7,130.2,139.7,145.0,147.2,151.4,153.0,155.5,158.1,160.0,169.7。[0465]实施例3[0466]α-甲基丙烯酰胺化合物的反应性[0467]为了研究α取代的甲基丙烯酰胺的反应性和离去能力，多种α取代的n-苄基-甲基丙烯酰胺的9种模型化合物的组(1b-1j；表1)已经由对应的n-苄基-2-(溴甲基)丙烯酰胺(实施例2)以及未被取代的丙烯酰胺(bna)和甲基丙烯酰胺(1a)合成。将这些亲电体与作为模型硫醇(modelthiol)的还原型谷胱甘肽(gsh)反应，并且经由液相色谱法/质谱法(lc/ms)随时间监测反应。作为实例，在0.5h和48h之后1g(其具有香豆素作为取代基)的反应的分析(图4a)清楚地指示取代产物的形成、7-羟基香豆素的形成和起始材料的减少。经由所有模型化合物的lc/ms定量产物形成，并且评估了反应速率(5mmgsh；100μm丙烯酰胺；37℃；表1，图4a)。[0468]被取代的甲基丙烯酰胺比未被取代的丙烯酰胺更具反应性。离去基团的pka(在胺的情况下为pkb)23–25和模型化合物与gsh反应的t1/2之间存在清楚的相关性(图4b)。[0469]化合物1g，其本身不是荧光的，在与gsh反应时释放香豆素作为离去基团，因此允许我们通过开启的荧光读数(readout)来跟踪反应。事实上，反应的荧光监测(5mmgsh，100μm1g，ph8；图4c)示出了与通过lc/ms获得的速率类似的速率。为了理解gsh浓度对1g的荧光的影响，以不同的gsh浓度跟踪荧光读数(图4c)。荧光随着gsh浓度的变化而增加，并且在1mm的gsh时达到其最大值。gsh浓度的进一步增加降低了荧光，这可能是由于缓冲液的酸化。观察到在高gsh浓度作为对照的7-羟基香豆素的荧光的降低(图5)。此外，当1g的反应通过lc/ms以不同浓度的gsh(0.5mm、1mm和5mm)监测时，在所有三种情况下都观察到类似的7-羟基香豆素的释放速率(图6)，指示荧光信号的减少主要是由于在低ph固有7-羟基香豆素荧光的减少。事实上，固定反应物的浓度(5mmgsh；100μm1g)和改变ph示出了荧光信号随着ph变化而变化的线性效应(图7)，其中在较高ph值反应速率增加(图4d)并且荧光最大。[0470]表1.α-甲基丙烯酰胺的多种杂取代在对gsh的反应性方面跨越2.5个数量级。[0471][0472][0473]被取代的α-甲基丙烯酰胺与gsh的反应可以产生取代产物或加成产物。[0474]a模型被取代的α-甲基丙烯酰胺[0475]b对gsh的反应性(t1/2)和反应类型经由lc/ms进行评估(图4a)。[0476]实施例4[0477]被取代的α-甲基丙烯酰胺的蛋白质组反应性[0478]为了评估这种新的亲电体的蛋白质组反应性，合成了三种模型炔烃(实施例2)，这三种模型炔烃带有被香豆素、n-甲基苯胺或苯甲酸取代的α-甲基丙烯酰胺(2a-2c；图8a)。香豆素衍生的炔烃2a在gsh触发的荧光测定中示出与1g类似的反应性(图9)。将mino细胞用dmso、ia-炔烃或2a-2c处理持续2小时。将细胞裂解，用tamra(四甲基罗丹明)-叠氮化物经由铜催化的“点击化学”标记炔烃，并且经由凝胶内荧光对加合物进行成像(图8b)。化合物2a示出比2b略高的反应性，类似于1g和1c的情况下的gsh结果。然而，2c在该实验中似乎完全无活性，尽管1i在gsh实验中示出较高的反应性。这可能是水解酯的细胞酯酶的结果，留下不反应的被取代的丙烯酰胺26。所有丙烯酰胺的反应性都显著低于ia-炔烃。[0479]实施例5[0480]不可逆激酶抑制剂[0481]为了在不可逆共价抑制剂的背景下评估这种化学，选择伊布替尼作为模型化合物。伊布替尼是布鲁顿酪氨酸激酶(btk)的不可逆抑制剂，并且被fda批准用于若干种b细胞致癌恶性肿瘤27。从母体伊布替尼开始，使用morita-baylis-hillmann反应来官能化丙烯酰胺，并且合成了多种基于伊布替尼的甲基丙烯酰胺衍生物，它们具有不同的离去基团，包括酚、酸、碳酸酯、胺和季铵盐(3a-3j；实施例2，图10a)。所有这些化合物都能够示出重组btk激酶结构域的共价结合，如通过完整蛋白质质谱法评估的(图10b；表2)。[0482]表2：伊布替尼的α取代的衍生物的性质。[0483][0484][0485]a伊布替尼的被取代的α-甲基丙烯酰胺类似物。[0486]b对gsh的反应性(t1/2)和反应类型经由lc/ms进行评估。[0487]与模型化合物类似，酚、酸、碳酸酯和苯胺衍生物(3j、3g、3h和3d)在30分钟内通过取代机制示出100％标记。在孵育2小时之后，碱性胺衍生物诸如3b和3f示出混合结合，约35％通过取代结合，以及65％通过michael加成结合。最后，3c和3e仅通过加成标记，没有取代产物。[0488]检查了btk标记率，其现在可能取决于调节的固有硫醇反应性，以及潜在修饰的可逆蛋白质识别。无论观察到的反应机制如何，大多数化合物与伊布替尼相当，小于2倍高或2倍低(图10b)。两种标记btk最慢的化合物3i和3d，分别对应于两种最慢的模型化合物1e和1c。再次，仅通过加成机制反应的胺修饰，诸如3e和3c，是反应最快的，t1/2比伊布替尼快50％(图10b)。[0489]为了理解这些化合物作为抑制剂的潜力，对所有针对btk的伊布替尼衍生物进行了体外激酶活性测定。这些化合物的ic50(图10c)密切反映了btk动力学标记实验。一些酯、碳酸酯和碱性胺取代的抑制剂诸如3c、3g、3h和3e示出《100pm范围内的ic50，优于伊布替尼(ic50＝288pm)。其他化合物以在100pm-12nm范围内的ic50抑制btk(图10c)。[0490]此外，已经进行了对所有伊布替尼衍生物的基于gsh的反应性测定(图10d)。[0491]为了评估这种化学与细胞条件的相容性，对伊布替尼以及我们的四种新抑制剂对原代小鼠b细胞中的b细胞受体信号传导抑制进行了评价。将b细胞用不同浓度的抑制剂孵育(24h；37℃)，用抗igm处理，并且通过流式细胞术检测cd86表达来评估活化。所有四种具有被取代的甲基丙烯酰胺的抑制剂(3c、3e、3g和3h)示出与伊布替尼类似的活性，指示细胞参与以及对细胞条件的稳定性。[0492]实施例6[0493]不可逆抑制剂的官能化的共价配体导向释放(coldr)化学[0494]作为靶蛋白质的选择性结合的功能而释放特定离去基团的事实可以用于官能化不可逆抑制剂，例如作为开启荧光探针。为了评估这种方法的适用性和普遍性，选择了丙烯酰胺抑制剂可用于的三种治疗靶：btk、egfr和k-rasg12c作为模型系统。最初，3j(图11a)用btk处理，测量释放的香豆素荧光，并且经由lc/ms验证标记(图11d，图11g)。在几秒钟内添加btk后，3j在435nm处的荧光强度增加了30倍，在10分钟内达到饱和。为了验证荧光的增加是由于与btk结合之后香豆素的释放，进行了btk的实验重复，btk与伊布替尼的非共价类似物(ibr-h)一起预孵育。在该实验中，荧光的增加显著更慢，这是由于ibr-h逐渐被3j置换。通过使用20:1当量的蛋白质:探针，反应速率降低(图12)。荧光对应于与btk的相互作用而增加，因为将3j与bsa一起孵育不导致增加的荧光(图13a)。释放也可以通过用碘乙酰胺炔烃预孵育btk来抑制(iaa；图13b)。[0495]类似地，将4b(图11b，实施例1；用香豆素官能化的阿法替尼衍生物)和5a(图11c，实施例1；用香豆素官能化的amg-510衍生物)分别用egfr和k-rasg12c处理并且测量释放的香豆素荧光(图11e，图11f)。在两种情况下都观察到荧光强度的显著增加，与btk相比动力学较慢。荧光测量结束时的lc/ms测量示出蛋白质的分子量的变化与不具有释放的香豆素的标记的化合物的尺寸相关(图11g-图11i)。在egfr激酶活性测定中，虽然4b比未被取代的4a效能稍低(图14)，但它仍然示出了令人印象深刻的针对egfr的ic50＝3.3nm。[0496]最近，报导了用于酶、反应性氧物质和其他分析物的感测和成像的基于亚金刚烷基-二氧杂环丁烷的化学发光开启探针28-32。这些探针在被分析物活化时，释放苯酚酯-二氧杂环丁烷中间体，该中间体随后随着可见光谱中光子的发射而分解(图3)。事实上，这些探针示出高灵敏度和信号背景比。因此，合成了用于由btk活化的伊布替尼衍生的化学发光探针(图3)。在不存在和存在btk的情况下，测量了探针3k(图15a，实施例1)在被btk(2μm)活化时的化学发光光发射概况(图15b)。在存在btk的情况下的动力学概况是化学发光探针的典型特征，其中初始信号在20分钟内增加到最大值，随后缓慢降低。btk显著增强了3k的化学发光，比不存在btk的情况下由探针3k发射的总光子计数高约90倍。btk与ibr-h一起的预孵育示出检测到的发光的显著降低，指示该探针可以用于测量btk结合。[0497]探针3k的发射概况(图15a)是在不存在和存在btk(2μm；图15b)的情况下测量的。在存在btk的情况下的动力学概况是化学发光探针的典型特征，其中初始信号在20分钟内增加到最大值，随后缓慢降低。btk将3k的化学发光显著增强至比不存在btk的情况下由探针3k发射的总光子计数高90倍。btk与ibr-h一起的预孵育示出检测到的发光的显著降低，指示该探针可以用于测量btk结合。[0498]为了证明这样的化合物的可能的用途，进行了～4,000种生物活性化合物的高通量筛选。总的来说，488种化合物(13％)示出对btk的一定抑制，其中216种(6％)抑制了信号的至少70％。216种强命中(hit)化合物中有121种是已知的激酶抑制剂，并且库中12种已知btk抑制剂中有11种被鉴定为强命中(图15c)。[0499]实施例7[0500]用于释放活性细胞毒性药物的coldr化学[0501]在使用coldr化学进行荧光和化学发光开启之后，研究了毒素开启的释放。一些药物和化学治疗剂在特定位置被取代时是无活性的。实例包括多柔比星的胺取代和喜树碱的羟基取代。在这些情况下，如果化学治疗药物(呈其无活性形式)以使得其将在与蛋白质共价反应之后释放的方式通过coldr化学附接至蛋白质结合配体，则只有在释放后其才将变得具有毒性。附接至喜树碱(6b和6c)和多柔比星(6a)的伊布替尼通过用于coldr化学的甲基丙烯酰胺合成(图16)。[0502]将这些化合物用还原型谷胱甘肽(gsh)处理以检查它们的释放能力。当然，所有三种化合物都释放了对应的毒素，这通过lc-ms分析来鉴定。此外，当将这些化合物与btk激酶结构域一起孵育时，通过发现对应于btk+化合物的m/z以及接头和毒素的释放来鉴定毒素的释放(图16b)。[0503]为了使这种释放化学更普遍，合成了化学治疗剂的阿法替尼衍生物(6d6e、6f、6g、6h)。这些化合物与gsh反应的lc-ms分析表明，它们可以用于coldr化学。此外，这些化合物针对egfr的体外激酶测定表明，它们表现出纳米摩尔(1nm)效能(图16c)。这指示用化学治疗基序修饰阿法替尼不干扰egfr结合。[0504]实施例8[0505]蛋白质上功能标签的特异性标记的逆向coldr化学[0506]蛋白质的位点选择性标记在理解细胞机制和基于活性的感测方法中起重要作用。特别地，蛋白质的配体导向位点选择性标记增加了它们对感兴趣的蛋白质(poi)的选择性。文献中已经报导了许多这样的方法。这种方法的关键缺点是在标记探针之后，配体占据活性口袋并且使poi失活。在过去的十年中，hamachi等人(45)已经开发了许多配体导向的化学，其中配体在与poi上的亲核残基进行共价键形成之后离开。这些方法保持蛋白质在细胞环境中具有活性，以监测细胞机制。在这种情况下，开发了蛋白质的基于coldr化学的位点选择性标记，并且使poi保持其活性形式。以前，coldr化学用于释放基于活性的探针。本文中，使用了在共价键形成之后释放配体的类似的化学(图2)。[0507]合成了ibr取代的甲基丙烯酰胺(图17a)，包含炔烃探针、fam和无cu点击探针(图17a)。这些化合物示出100％标记(2μm)至btk(2μm)，其中ibr在1min内消除。通过lc-ms分析鉴定了btk上的炔烃和fam标签，这示出m/z对应于具有标签的btk(图17b)。此外，化合物7e(其具有荧光素)，在与btk一起孵育之后，在荧光凝胶中运行，并且观察到对应质量范围的带。[0508]为了评估这种化学与细胞条件的相容性，在原代小鼠b细胞中通过这些化合物中的两种7e和7f评价了b细胞受体信号传导抑制。将b细胞与不同浓度的抑制剂一起孵育(24h；37℃)，用抗igm处理，并且通过流式细胞术检测cd86表达来评估活化。两种化合物都没有示出活性，指示化合物的两种细胞附接而不影响其活性(图17c)。[0509]实施例9[0510]磷酸化/降解诱导逆向coldr标签[0511]制备了btk的天然磷酸化，甚至是在用炔烃磷酸化的嵌合分子标记之后(phic-pmid:32787262)。这些分子通常具有激酶的结合剂，该结合剂连接至可以对其进行磷酸化的另一种感兴趣的蛋白质的配体。在这种情况下，合成了与配体如克唑替尼(alk抑制剂)和阿法替尼连接的ibr-h取代的甲基丙烯酰胺(图16a，egfr抑制剂)。据推测，化合物8a和8b共价地标记btk，消除了ibr，并且可逆地与alk结合。btk和alk的接近可以通过btk诱导alk中的酪氨酸磷酸化。类似地，8c和8d可以通过btk诱导egfr中的酪氨酸磷酸化。当孵育btk时，所有四种化合物在30min内标记btk，消除ibr(图18b)。[0512]nedd4是一种e3泛素-蛋白质连接酶，具有选择特定蛋白质用于与泛素缀合的作用，并且具有基于丙烯酸酯的共价抑制剂。提出使用coldr化学用另一种蛋白质配体标记nedd4，其中nedd4抑制剂在标记之后离开并且保持nedd4活性。进行炔烃附接的nedd4抑制剂(8e，8f)的合成，以检查nedd4的参与并且将其抑制剂能力留在细胞中(图18a)。多种蛋白质结合部分与所述炔烃的偶联将使这些poi能够降解。[0513]实施例10[0514]btk活性位点半胱氨酸的配体导向位点选择性标记[0515]为了测试活细胞中配体导向化学的参与，在mino细胞中测试了化合物7a、7f和7e。化合物(7a)、(7d)和(7f)以100nm浓度与细胞中的btk结合。虽然(7e)为一种加荧光素标签的化合物，不具有细胞渗透性，但以100nm在裂解物中标记btk。[0516]为了评估在细胞中用炔烃标签标记之后btk的活性，进行了btk磷酸化测定。发现btk是活性的和磷酸化的。通过离去配体来标记炔烃探针(7d)和(7f)两者保持了激酶对磷酸化的活性(图20a)。此外，使用coldr化学以检查使用(7f)的btk的半衰期。(7f)的btk标记的炔烃的半衰期被鉴定为11.5h，而用环己酰亚胺测定的btk的半衰期是19.6h(图20b)。[0517]实施例11[0518]btk的位点特异性标记探针[0519]布鲁顿酪氨酸激酶(btk)，一种确立的b细胞恶性肿瘤的药物靶，被选择为配体导向位点选择性标记的模型蛋白质。伊布替尼，其是一种高度有效的btk共价抑制剂，在其atp结合口袋处结合，用作配体以指导btk的非催化半胱氨酸481的选择性标记(47)。伊布替尼的胺前体(ibr-h；图17a)包含哌啶部分，其可以作为杂取代基安装在α-甲基丙烯酰胺上，并且由此用作离去基团(48)。被取代的甲基丙烯酰胺伊布替尼类似物(图17a)，其包含多种功能性探针诸如‘点击’化学手柄：炔烃(7d)和二苯并环辛炔(7f)，荧光染料(7m、7n、7e)，疏水性标签(7r，7s)，以及天然氨基酸侧链的衍生物(7c、7k、7o、7g)。这些探针的合成在实施例1和图21中描述。[0520]为了评估不可逆标记并验证所提出的配体释放机制，使探针/化合物(2μm)与重组btk(2μm)一起孵育，并且经由完整蛋白质液相色谱法/质谱法(lc/ms)监测反应。例如，与7n的反应的分析(图22b)验证了质量的变化对应于用bodipy标记btk和ibr-h的释放(图22c)。在ph8，25℃，所有测试的探针在10min-120min内将btk标记至100％(图22d)，其中加合物质量对应于不具有配体的探针。[0521]为了验证位点特异性，将btk与dmso或7d一起孵育，随后进行胰蛋白酶消化，并且通过lc/ms/ms进行胰蛋白酶肽的分析。通过对7d修饰的胰蛋白酶肽(残基467-487)的ms/ms鉴定，以及通过与7d反应后碘乙酰胺标记的467-487肽的耗尽，cys481被鉴定为修饰位点。[0522]为了评估标记的动力学参数，用不同浓度的7d进行了btk(200nm)的时间依赖性孵育实验(300nm-2000nm，20mmtris，ph8，14℃)，在这些条件下得到k无活性＝2.78×10-2s-1和ki＝3.0×10-7m。这些值与先前报导的伊布替尼的值类似54(k无活性＝2.70×10-2s-1；ki＝5.42×10-8m；k无活性/ki＝4.98×105)，其中1b的可逆结合组分弱约5倍并且k无活性是类似的。[0523]为了验证btk的结合位点在通过7d标记后仍然是空的，进行了表面等离子体共振(spr)实验。通过长peg接头将伊布替尼的可逆类似物缀合至spr芯片(9e；图29a-图29d)。然后我们在芯片上以不同的浓度使游离btk(图29b)、7d标记的btk(不可逆标记后，我们经由透析去除过量的7d和ibr-h，参见方法；图29c)或伊布替尼标记的btk(图29d)流动。游离btk(kd＝15nm)和btk-7d(kd＝18nm)以高亲和力结合9e(图29e)，而btk-伊布替尼不示出任何结合。这指示用coldr探针标记btk不影响其他可逆配体的结合。[0524]在存在还原型谷胱甘肽(gsh)的情况下评估用coldr探针标记的btk的稳定性。将btk(2μm)与7n(2μm；30min；ph8；25℃)一起孵育。btk-7n缀合物然后与gsh(1mm或5mm；18h；ph8；25℃)一起进一步孵育。在18h之后，没有观察到探针从btk分离或gsh的添加，指示这种修饰对类似于细胞环境的条件的稳定性。[0525]溶剂化变色荧光团具有对局部微环境性质敏感的发射性质，这用于研究蛋白质结构动力学和检测蛋白质结合相互作用49。最近的研究表明，即使将溶剂化变色荧光团定位到非特异性蛋白质表面也可以导致“开启”荧光55，56。然而，结合的配体的存在可以对蛋白质的结构施加显著的结构变化。化合物7m，其具有环境敏感的荧光探针，允许开发呈其apo形式的btk的开启荧光探针。[0526]7m具有其本身可忽略不计的荧光(ex/em＝550nm/620nm；图22e)。然而，当添加btk(ph8，37℃)时，7m在550nm处的荧光强度在几秒内增加80倍，在5min内达到饱和(图22e)。与图22d中报导的结果相比，这样的快速标记可能是进行该实验的较高温度的结果。荧光测量后的完整蛋白质lc/ms示出了不含伊布替尼识别元件的荧光团的预期的加合物质量，验证了共价结合和所提出的机制(图22f)。与伊布替尼或伊布替尼的非共价类似物(ibr-h)一起的预孵育消除了荧光，指示它需要在btk的活性位点处结合。此外，这些对照反应的lc/ms色谱图示出在竞争者存在的情况下，没有7m的标记(图22f)。为了评估探针的选择性，将其与可选择的共价靶k-rasg12c一起孵育，这不引发荧光(图22e)。通过在30℃用btk(1μm)降低反应物7m(50nm)的浓度，可以评估荧光产生的初始速率。[0527]测试7m以检测btk的活性位点内的结合事件。在用7m标记btk之后，将加合物与ibr-h或伊布替尼一起孵育。这导致荧光减少2-3倍，以及发射从620nm显著红移至650nm(图28a、图28b)。这些结果指示，btk在被标记之后保留了与活性位点中的配体结合的能力。荧光的变化可能是由于结合之后btk的构象变化或荧光探针的定位变化，导致改变的化学环境。用7n和7e预标记的btk也观察到光谱变化(图28d和图28e)。[0528]在少量筛选(screen)的btk活性位点结合剂中跟踪这些光谱变化。将若干种btk活性位点结合剂与7m标记的btk一起孵育并且记录荧光光谱。有趣的是，许多化合物将荧光光谱峰从620移至650和/或猝灭了荧光。若干种作用最明显的化合物是激酶抑制剂。[0529]实施例12[0530]btk探针的固有硫醇反应性[0531]为了探索这些btk标记探针的固有硫醇反应性，使它们(7c、7d、7k、7f、7e、7m、7n、7o、7q、7r、7s)与作为模型硫醇的还原型谷胱甘肽(gsh；5mm；ph8的pbs缓冲液)反应，并且经由lc/ms(图23a)随时间监测反应。作为实例，对在0h和8h之后化合物7n的反应的分析(图23b)清楚地指示了取代产物的形成、ibr-h的释放和起始材料的减少。ibr-h释放的速率、gsh加合物形成的速率和化合物7n耗尽的速率是相同的(图23d)，表明配体(ibr-h)的释放伴随着与gsh的反应。此外，为了比较这些探针与伊布替尼的反应性，测量了所有化合物的gsh消耗(t1/2)(图23c和图23e)。几乎所有的探针都示出在伊布替尼的两倍范围内的反应性。其中大部分的反应性略高于伊布替尼，除了7m和7v的反应性分别低约两倍之外。基于酯的7c显著更具反应性(t1/2《10min)。比较在丙烯酰胺胺的性质方面不同的化合物7d、7u、7v是有趣的。简单伯胺和苯胺示出中等的对gsh的反应性(t1/2＝30min-4h)，而具有哌啶部分的7v示出t1/2》100h。这种反应性的变化可能有助于调节这些探针的选择性。应注意对gsh反应性最小的7m和7v也示出较低的btk标记(图22d)。在gsh反应条件下，没有一种化合物示出分解。[0532]实施例13[0533]coldr标记在蛋白质靶中是通用的[0534]为了示出这种方法的普遍性，使用了btk的另一种配体：依沃卢替尼，以及共价抑制剂可用的另外两种治疗靶：k-rasg12c和sars-cov-2木瓜蛋白酶样蛋白酶(plpro)作为模型系统。基于依沃卢替尼的炔烃探针(7g；图24a)，用于靶向k-rasg12c的基于amg-510的炔烃探针(7h；图24b)和基于共价配体的用于plpro的丙烯酸乙酯标记配体被合成并且在先前被鉴定(7t；图24c)。将探针与它们的靶一起孵育(btk：2μm，10min，25℃；krasg12c：10μm，16h，37℃；plpro：2μm，16h，37℃；所有反应在ph＝8进行)。所有三种探针都能够达到其靶的100％单一标记，如通过lc/ms评估的(图24d-图24f)，其中加合物质量对应于炔烃(btk和krasg12c)或丙烯酸乙酯(plpro)。应注意，在plpro的情况下，由于半胱氨酸靶是催化残基，预期这种修饰也抑制酶。[0535]实施例14[0536]细胞中btk的配体导向位点选择性标记[0537]除了通过本文描述的探针体外标记btk之外，还测试了它们在细胞中的参与和蛋白质组选择性。将minob细胞用包含不同标签的多种探针孵育，所述标签诸如炔烃(7d、7u、7v)、二苯并环辛炔(7f)以及荧光染料荧光素(7e)、尼罗红(7m)和bodipy(7n)，并且使用凝胶内荧光(在tamra-n3向炔烃标签的cuaac后)对它们的标记概况成像。探针7d和7n甚至在10nm的浓度也示出稳健的标记(图25a)，而7v以更高选择性标记btk(图25c)。7f和7m以100nm的浓度标记btk(图25a)并且7e未在活细胞中标记btk。带负电荷的荧光团诸如荧光素具有已知的渗透性问题。事实上，在裂解物中7e能够以100nm的浓度标记btk(图25)。为了评估细胞标记的动力学，我们追踪了通过7f的时间依赖性标记，其示出在30min-60min内btk的稳健的标记(图25b)。[0538]为了验证探针的分子靶，进行了竞争实验，其中在用探针标记之前，将细胞用伊布替尼预孵育(图25c)。该实验证实了btk标记，因为伊布替尼完全竞争了～70kda处的条带的标记，以及一些脱靶。有趣的是注意到，一些脱靶没有被伊布替尼竞争，指示这些是我们的探针特有的新脱靶(图25c)。为了鉴定这些探针的脱靶，我们使用7d在mino细胞中进行了拉下蛋白质组学实验(pull-downproteomicsexperiment)(图25d)。将细胞用dmso、7d(100nm)处理，或用伊布替尼预处理，并且然后用7d处理。生物素经由cuaac与炔烃缀合，并且亲和素珠用于富集。blk、mcat和adk被发现为探针7d的脱靶(图25d)。adk(40.5kda)和mcat(也被称为slc25a20；33kda)对应于凝胶中看到的两个条带(图25c)，这两个条带不被伊布替尼竞争。两者都是细胞中丰富的蛋白质，这可以解释探针结合。总的来说，在较低浓度，所有探针都很少检测到脱靶。[0539]实施例15[0540]btk标记保留其酶活性[0541]为了检查这些探针修饰btk对其活性的影响，在mino细胞和原代b细胞两者中进行了活性测定。将mino细胞用探针7d、7f、7m和7n孵育(1h)以允许标记，随后使用抗人igm进行btk活化。btk的自磷酸化后进行蛋白质印迹以评估其活性。虽然伊布替尼完全消除了btk自磷酸化，但btk在用所有四种探针标记之后保持活性。7f、7m和7n特别地没有影响活性(图25e)。这种效果与细胞的洗涤无关，细胞的洗涤消除了btk可逆抑制剂ibr-h的抑制，但没有消除伊布替尼的抑制(图25e)。此外，为了确保活性不是来自未标记的btk，将mino细胞用高浓度的7d、7f、7m和7n(1μm)处理持续2小时，并且然后用100nm伊布替尼孵育持续45min，然后用igm活化。虽然单独的伊布替尼完全抑制btk的活性，但我们发现所有coldr探针都可以挽救这种抑制。化合物7n和7m在伊布替尼孵育后确实示出磷酸化的一定减少，指示细胞中不完全的btk标记。当7m的浓度增加时(5μm；4h孵育)，添加伊布替尼不再降低活性。btk的活性保持的事实表明标记的级分保持活性(图25f)。此外，测量了这些探针对原代小鼠b细胞中b细胞受体(bcr)信号传导的影响。将小鼠脾细胞分离，并且用剂量反应的伊布替尼、7d和7f处理持续24h，并且通过追踪cd86的表达来测量响应于抗igm刺激的b细胞活化。与伊布替尼相比，两种探针都不抑制b细胞的活化，表明它们不仅保留了btk自磷酸化，而且不干扰其下游信号传导(图25g)。[0542]实施例16[0543]使用coldr探针的btk半衰期确定[0544]如实施例15中呈现的，通过7f标记不抑制btk的天然磷酸化及其下游信号传导，该探针用于测量btk在天然细胞环境中的半衰期。为此目的，将mino细胞用7f孵育持续1小时以标记btk，随后洗涤以确保新合成的btk将不被标记。然后细胞在不同的时间点收获，裂解，并且通过添加tamra-叠氮化物使用无cu反应“点击”。btk丰度通过凝胶内荧光追踪，这允许定量和半衰期确定(图26a)。用7f测量的btk的平均半衰期是10.2±2.0小时，这与用传统的环己酰亚胺(chx)测定测量的其半衰期类似(图26b、图26c、图26d)，但不需要抗体、蛋白质印迹，并且重要的是不干扰细胞翻译机制。[0545]应注意，7f信号的丢失是由于btk蛋白水平的降低，而不是例如探针分解，因为若干个7f脱靶表现出长得多的半衰期，指示探针在这些时间范围内是稳定的。[0546]实施例17[0547]btk加标签不干扰protac结合和三元复合物形成[0548]蛋白水解靶向嵌合体(protac)是诱导细胞蛋白质的选择性降解的一种流行方式。已表明，用炔烃使btk加标签允许追踪其在细胞中的自然降解。诱导的靶向降解随后是btkprotac。为此，我们将mino细胞用荧光探针7n(100nm)孵育持续1h，然后洗涤细胞并且将其用非共价btkprotac9d46(图31b)孵育持续2h，并且使用凝胶内荧光(图26e和图31c)和蛋白质印迹(图31d)两者测量btk降解。有趣的是，通过凝胶荧光定量的btk的降解(在1μm75％，在0.5μm55％)与通过蛋白质印迹的定量(在1μm71％，在0.5μm55％)非常对应。这表明protac介导的降解可以通过用coldr荧光标签预标记靶使用凝胶内荧光来追踪。重要的是，在不存在7n的情况下，protac9d在0.5μm和1μm降解65％的蛋白质。两者都类似于在存在荧光标签的情况下通过9d的降解。在存在和不存在7n的情况下，在较低浓度的9d(50nm和100nm)几乎没有观察到降解(图31e和图31f)。总之，该数据表明荧光标签不干扰非共价protac的结合，也不干扰与crbne3连接酶形成三元复合物。[0549]实施例18[0550]coldr化学允许安装降解手柄[0551]已知小分子结合剂在热力学上稳定它们的靶蛋白质，这也可以转化为对降解的改善的细胞稳定性。[0552]设计了三种coldrprotac，它们利用ibr-h作为离去基团，通过peg接头将crbn结合剂(沙利度胺/来那度胺)安装到btk上(图30b)。这些化合物的合成是通过将沙利度胺/来那度胺peg胺与ibr-羧酸偶联(图21)。我们首先评估了通过这些protac的btk标记(2μmbtk，2μmprotac；ph8，25℃)。所有三种protac在30min内标记btk超过80％(图30c)。然后我们评估了它们是否可以诱导mino细胞中的btk降解。9c证明是最好的降解剂，dc50＜100nm(根据多项式拟合为11.4nm；图30d，图30e)。为了验证9c的降解机制，在用protac孵育之前，我们用伊布替尼或沙利度胺-oh预处理mino细胞。两者都能够挽救降解，表明降解是通过与btk和crbn结合来介导的(图30f)。[0553]最后，通过定量无标记蛋白质组学评估9c的蛋白质组选择性(图30g)。在dmso和9c处理的样品中鉴定和定量的蛋白质中，只有三种蛋白质消耗超过50％，p值《0.01。最突出的靶是btk，它被消耗超过16倍。我们观察到的突出的脱靶是csk，csk是一种伊布替尼的非共价脱靶，其被消耗略大于50％。然而，csk的消耗相对于其他完全非共价结合其靶的btkprotac观察到的值是小的，指示共价结合在靶募集中起重要的作用。第二个主要脱靶erf3a(也被称为gspt1)是imid-crbn结合剂的已知靶。没有一个7d富集的脱靶(图25d)被检测为9c的降解靶。仅在一组样品中鉴定和定量了非常少的蛋白质，排除了它们的定量。在dmso处理的样品中观察到三种蛋白质，但在9c处理的样品中没有检测到，其中突出的是伊布替尼脱靶blk。[0554]虽然本文已经说明和描述了某些特征及其用途，但本领域普通技术人员现在将想到许多修改、替换、变化和等效物。因此，应理解，所附的权利要求意图覆盖落在本文公开内容的真实精神内的所有这样的修改和变化。[0555]参考文献：[0556]1.grifrin，b.a.；adams，s.r.；tsien，r.y.specificcovalentlabelingofrecombinantproteinmoleculesinsidelivecells.science1998，281(5374)，269-272.[0557]2.xue，l.；karpenko，i.a.；hiblot，j.；johnsson，k.imagingandmanipulatingproteinsinlivecellsthroughcovalentlaheling.nat.chem.biol.2015，ii(12)，917-923.[0558]3.nischan，n.；hackenberger，c.p.r.site-specificpegylationofproteins：recentdevelopments.j.org.chem.2014，79(22)，10727-10733.[0559]4.tsai，y.-h.；essig，s.；james，j.r.；lang，k.；chin，j.w.selective，rapidandopticallyswitchableregulationofproteinfunetioninlivemammaliancells.nat.chem，2015，7(7)，554-561.[0560]5.yang，s.-t.；lim，s.i.；kiessling，v.；kwon，i.；tamm，l.k.site-specificfluorescentlabelingtovisualizemembranetranslocationofamyristoylswitchprotein.sci.rep.2016，6，32866.[0561]6.zimmer，m.greenfluorescentprotein(gfp)：applications，structure，andrelatedphotophysicalbehavior.chem.rev.2002，102(3)，759-781.[0562]7.los，g.v.；encell，l.p.；mcdougall，m.g.；hartzell，d.d.；karassina，n.；zimprich，c.；wood，m.g.；learish，r.；ohana，r.f.；urh，m.；simpson，d.；mendez，j.；zimmerman，k.；otto，p.；vidugiris，g.；zhu，j.；darzins，a.；klaubert，d.h.；bulleit，r.f.；wood，k.v.halotag：anovelproteinlabclingtechnologyforcellimagingandproteinanalysis.acschem.biol.2008，3(6)，373-382.[0563]8.zeng，m.；xiong，y.；safaee，n.；nowak，r.p.；donovan，k.a.；yuan，c.j.；nabet，b.；gero，t.w.；feru，f.；li，l.；gondi，s.；ombelets，l.j.；quan，c.；p.a.；kostic，m.；scott，d.a.；westover，k.d.；fischer，e.s.；gray，n.s.exploringtargeteddegradationstrategyforoncogenickrasg12c.cellchembiol2020，27(1)，19-31.e6.[0564]9.meyer，t.；begitt，a.；vinkemeier，u，greenfluorescentprotein-taggingreducesthenucleocytoplasmicshuttlingspecificallyofunphosphorylatedstat1.febsj.2007，274(3)，815-826.[0565]10.barth，s.；glick，d.；macleod，k.f.autophagy：assaysandartifacts.j.pathol.2010，221(2)，117-124.[0566]11.lang，k.；chin，j.w.cellularincorporationofunnaturalaminoacidsandbioorthogonallabelingofproteins.chem.rev.2014，114(9)，4764-4806.[0567]12.sletten，e.m.；bertozzi，c.r.bioorthogonalchemistry：fishingforselectivityinaseaoffunctionality.angew.chem.int.edengl，2009，48(38)，6974-6998.[0568]13.spicer，c.d.；davis，b.g.sclectivechcmicalprotcinmodification.nat.commun.2014，5，4740.[0569]14.zhang，c.；welbom，m.；zhu，t.；yang，n.j.；santos，m.s.；vanvoorhis，t.；pentelute，b.l.π-clamp-mediatedcysteineconjugation.nat.chem.2016，8(2)，120-128.[0570]15.macdonald，j.i.；munch，h.k.；moore，t.；francis，m.b.one-stepsite-specificmodificationofnativeproteinswith2-pyridinecarboxyaldehydes.nat.chem.biol.2015，11(5)，326-331.[0571]16.boutureira，o.；bernardes，g.j.l.advancesinchemicalproteinmodification.chem.rev.2015，115(5)，2174-2195.[0572]17.matos，m.j.；oliveira，b.l.；martíncz-sáácz，n.；guerrciro，a.；cal，p.m.s.d.；bertoldo，j.；maneiro，m.；perkins，e.；howard，j.；deery，m.j.；chalker，j.m.；corzana，f.；jiménez-osés，g.；bernardes，g.j.l.chemo-andregioselectivelysinemodificationonnativeproteins.j.am.chem.soc.2018，140(11)，4004-4017.[0573]18.adusumalli，s.r.；rawale，d.g.；singh，u.；tripathi，p.；paul，r.；kalra，n.；mishra，r.k.；shukla，s.；rai，v.single-sitelabelingofnativeproteinsenabledbyachemoselectiveandsite-selectivechemicaltechnology.j.am.chem.soc.2018，140(44)，15114-15123.[0574]19.purushottam，l.；adusumalli，s.r.；singh，u.；unnikrishnan，v.b.；rawale，d.g.；gujrati，m.；mishra，r.k.；rai，v.single-siteglycine-specificlabelingofproteins.nat.commun.2019，10(1)，2539.[0575]20.chen，g.；heim，a.；riether，d.；yee，d.；milgrom，y.；gawinowicz，m.a.；sames，d.reactivityoffunctionalgroupsontheproteinsufface：developmentofepoxideprobesforproteinlabeling.j.am.chem.soc.2003，125(27)，8130-8133.[0576]21.amaike，k.；tamura，t.；hamachi，i.recognition-drivenchemicallabelingofendogenousproteinsinmulti-molecularcrowdinginlivecells.chem.commun.2017，53(88)，11972-11983.[0577]22.chen，j.；wang，x.；he，f.；pan，z.developmentofasclectivelabelingprobeforbruton’styrosinekinasequantificationinlivecells.bioconjug.chem.2018，29(5)，1640-1645.[0578]23.zhang，q.；liu，h.；pan，z.ageneralapproachforthedevelopmentoffluorogenicprobessuitableforno-washimagingofkinasesinlivecells.chem.commun.2014，50(97)，15319-15322.[0579]24.zhao，z.&bourne，p.e.progresswithcovalentsmall-moleculekinaseinhibitors.drugdiscov.today23，727-735(2018).[0580]25.liu，q.etal.developingirreversibleinhibitorsoftheprteinkinaseeysteinome.chemistryandbiology20，146-159(2013).[0581]26.baillie，t.a.targetedcovalentinhibitorsfordrugdesign.angew.chem.int.edengl.55，13408-13421(2016).[0582]27.singh，j.，petter，r.c.，baillie，t.a.&whitty，a.theresurgenceofcovalentdrugs.nat.rev.drugdiscov.10，307-317(2011).[0583]28.shannon，d.a.&weerapana，e.covalentproteinmodification：thecurrentlandscapeofresidue-specificelectrophiles.curr.opin.chem.biol.24，18-26(2015).[0584]29.chen，d.，guo，d.，yan，z.&zhao，y.allenamideasahioisostereofacrylamideinthedesignandsynthesisoftargctcdcovalcntinhibitors.medchemcomm9，244-253(2018).[0585]30.mons，e.etal.thealkynemoietyasalatentelectrophileinirreversiblecovalentsmallmoleculeinhibitorsofcathepsink.j.am.chem.soc.141，3507-3514(2019).expressionlevelsofcellsurfaceproteinswithaturn-onfluorescentmolecularprobe.chem.commun.2021，57(15)，1875-1878.[0611]56.unger-angel，l.；rout，b.；ilani，t.；eisenstein，m.；motiei，l.；margulies，d.proteinrecognitionbybivalent，“turn-on”fluorescentmolecularprobes.chem.sci.2015，6(10)，5419-5425.。当前第1页12当前第1页12