一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针及方法与流程

本发明涉及基因工程，具体涉及一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针及其构建方法和应用。

背景技术：

1、生物发光成像(bli)是基于荧光素酶-荧光素对反应产生的生物发光，具有特异性强、灵敏度高、极低的背景和极高的信噪比。萤火虫荧光素酶(fluc)是众多荧光素酶的一种，与其他天然荧光素酶相比具有高达560nm的波长，是一种常用的信号分子。

2、光声成像(pai)是一种基于生物组织中发色团的光吸收差异的纯光学成像高对比度和纯超声成像高穿透深度的新型无损成像方法，克服了传统医学成像手段的不足，提供了多尺度、多维度的光声图像信息。金纳米粒子(au nrs)可以有效地增强组织的特异性吸收，与常规的光吸收造影剂(如icg)相比高出约105倍。金纳米棒(au nrs)具有独特的光学性质、良好的生物相容性、易于控制的表面修饰，因而使其在生物成像、药物和基因传递、生物传感器和癌症治疗等领域具有广阔的应用前景。

3、叶酸(fa)是一种水溶性b族维生素，通过叶酸受体、还原的叶酸转运体和质子偶联的叶酸转运体转运到细胞内，细胞内的叶酸辅助因子在癌症生物学和自身免疫性疾病中起着核心作用。叶酸受体(fr)是一种由糖基磷脂酰基醇所连接的跨膜糖蛋白，通过内吞作用捕获和内化细胞外的fa。fr在卵巢癌、脑癌、肾癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌等癌症中高度表达。fa与高亲和力结合的fr是使用叶酸结合物进行选择性药物输送和显像剂的一个特别有前途的靶点。

4、不同的成像模式具有各自的优势，但同时也存在各自不同的缺点或局限性。为了提高成像优势，弥补局限性，多模态成像技术被广泛研究，期望未来在疾病的诊断和治疗方面提供更全面的信息。目前，对于放射性核素、核磁共振、超声等多模态成像探针的研究较多，但对于生物发光和光声成像的双模态成像探针还缺乏充分的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针及其构建方法，提供了一种双模态成像探针fa-fluc-au，利用fa特异性靶向在肿瘤细胞中高表达的fr，结合fluc的生物发光和aunrs的光声成像实现对叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针，该探针为fa-fluc-au，其由叶酸fa、萤火虫荧光素酶fluc和金纳米棒au nrs制备获得；其中，萤火虫荧光素酶fluc是由核苷酸序列如seq id no.1所示的编码基因外源表达所得；金纳米棒aunrs是通过晶种法合成所得。

3、进一步地，上述的fa-fluc-au是通过将aunrs与nhs-peg2000-sh混合反应，得到nhs-peg2000-au；再将nhs-peg2000-au与萤火虫荧光素酶fluc混合反应，得到fluc-peg2000-au；再将fluc-peg2000-au和fa-peg2000-sh混合反应，即得双模态成像探针fa-fluc-au。

4、本发明还提供了一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针的构建方法，包括以下步骤：

5、1)将aunrs与nhs-peg2000-sh混合进行反应，将反应后的反应液离心取沉淀物，在超纯水中分散得到nhs-peg2000-au；

6、2)将nhs-peg2000-au与fluc混合进行反应，生成fluc-peg2000-au；

7、3)将fluc-peg2000-au和fa-peg2000-sh混合进行反应，即得双模态成像探针fa-fluc-au。

8、进一步地，上述的金纳米棒aunrs通过晶种法合成，其合成方法包含：

9、将ctab与haucl4快速混匀后加入nabh4，静置得到金种子溶液；

10、依次混合ctab、haucl4、agno3和h2so4制得溶液，在所得溶液中再滴加l-抗坏血酸以配制生长溶液；

11、在所得的生长溶液中加入金种子溶液，静置过夜，以触发金纳米棒的生成；

12、离心静置过夜的溶液以去除多余ctab，即得金纳米棒aunrs，收获au nrs在超纯水中重新分散。

13、进一步地，上述的构建方法具体如下：

14、在制备金种子溶液中，ctab为0.1m、7.5ml的ctab，haucl4为0.01m、0.25ml的haucl4，nabh4为预冷的0.01m、0.6ml的nabh4，于27℃静置2h；

15、在制备生长溶液中，ctab为0.1m、100ml的ctab，haucl4为0.01m、5ml的haucl4，agno3为0.01m、0.8ml的agno3，h2so4为0.5m、0.8ml的h2so4，l-抗坏血酸为0.1m、0.8ml的l-抗坏血酸；

16、在上述生长溶液中加入的金种子溶液为0.24ml，并于27℃静置过夜；

17、上述的离心的条件为：12000rpm离心10min。

18、进一步地，上述的构建方法具体如下：

19、上述步骤1)中的反应为室温下避光搅拌；

20、上述步骤2)中的反应为冰浴搅拌；

21、上述步骤3)中的反应为冰浴搅拌。

22、进一步地，上述的构建方法具体如下：

23、上述步骤1)中的反应为室温下避光搅拌12h；

24、上述步骤2)中的反应为冰浴搅拌24h；

25、上述步骤3)中的反应为冰浴搅拌24h。

26、本发明提供的检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针可用于非诊断中对叶酸受体高表达肿瘤细胞实时、无创的监测。

27、本发明的双模态成像探针fa-fluc-au，解决了生物发光和光声成像的双模态成像等问题，能够很好地在生物体内表达，实现了叶酸受体高表达肿瘤细胞的实时检测，具有以下优点：

28、(1)本发明提供的生物发光成像和光声成像这两种成像模式的探针，在非疾病诊断中为以叶酸受体高表达肿瘤细胞提供了一种实时、无创的可视化监测工具。

29、(2)fr在卵巢癌、脑癌、肾癌、肺癌、结肠癌和鼻咽癌等癌症中高度表达，在正常细胞中几乎不表达。与fa高亲和力结合的fr是使用叶酸结合物进行选择性药物输送和显像剂的一个特别有前途的靶点。

技术特征：

1.一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针，其特征在于，该探针为fa-fluc-au，其由叶酸fa、萤火虫荧光素酶fluc和金纳米棒au nrs制备获得；其中，所述的萤火虫荧光素酶fluc，其是由核苷酸序列如seqid no.1所示的编码基因外源表达所得；所述的金纳米棒au nrs是通过晶种法合成所得。

2.根据权利要求1所述的双模态成像探针，其特征在于，所述的fa-fluc-au是通过将aunrs与nhs-peg2000-sh混合反应，得到nhs-peg2000-au；再将所述nhs-peg2000-au与萤火虫荧光素酶fluc混合反应，得到fluc-peg2000-au；再将所述fluc-peg2000-au和fa-peg2000-sh混合反应，即得双模态成像探针fa-fluc-au。

3.如权利要求1所述的一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的金纳米棒au nrs通过晶种法合成，其合成方法包含：

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，具体如下：

6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，具体如下：

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，具体如下：

8.如权利要求1所述的检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针在非疾病诊断中对叶酸受体高表达肿瘤细胞实时、无创的监测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针及方法，涉及基因工程技术领域。该探针为FA‑Fluc‑Au，其由叶酸FA、萤火虫荧光素酶Fluc和金纳米棒AuNRs制备所得；其中，叶酸FA是一种水溶性B族维生素，与肿瘤细胞表面高度表达的叶酸受体FR高亲和力结合；萤火虫荧光素酶Fluc是由核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的编码基因外源表达所得；AuNRs是采用晶种法合成的。本发明的叶酸受体高表达肿瘤细胞的双模态成像探针可以实时监测肿瘤细胞的变化情况，对叶酸受体高表达肿瘤细胞提供了一种实时、无创的监测工具。

技术研发人员：王福,蒋依依
受保护的技术使用者：王福
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14