一种检测细胞凋亡的双模态成像探针及其构建方法和应用与流程

本发明涉及基因工程，具体涉及一种检测细胞凋亡的双模态成像探针及其构建方法和应用。

背景技术：

1、生物发光成像(bli)是基于荧光素酶-荧光素对反应产生的生物发光，具有特异性强、灵敏度高、极低的背景和极高的信噪比。萤火虫荧光素酶(fluc)是众多荧光素酶的一种，与其他天然荧光素酶相比具有高达560nm的波长，是一种常用的信号分子。

2、光声成像(pai)是一种基于生物组织中发色团的光吸收差异的纯光学成像高对比度和纯超声成像高穿透深度的新型无损成像方法，克服了传统医学成像手段的不足，提供了多尺度、多维度的光声图像信息。金纳米粒子(au nps)可以有效地增强组织的特异性吸收，与常规的光吸收造影剂(如icg)相比高出约105倍。金纳米棒(aunrs)具有独特的光学性质、良好的生物相容性、易于控制的表面修饰，因而使其在生物成像、药物和基因传递、生物传感器和癌症治疗等领域具有广阔的应用前景。

3、细胞凋亡是细胞死亡的一种重要形式，广泛存在于多种生理和病理过程中。磷脂酰乙醇胺(pe)是第二丰富的磷脂，约占所有磷脂的20％。在正常细胞中，pe主要存在于细胞膜的内叶中。在细胞凋亡早期，胞膜内的pe会翻转到细胞膜外表面，与pe的头部基团以1:1高亲和力结合，是一种潜在的pe分子探针。耐久霉素(duramycin)是一个由19个氨基酸组成的具有明确三维结合结构的多肽，其氨基酸序列如seq id no.1所示，是一种高度翻译后修饰的多肽，与pe结合，实现对凋亡细胞的无创、可视化监测。

4、不同的成像模式具有各自的优势，但同时也存在各自不同的缺点或局限性。为了提高成像优势，弥补局限性，多模态成像技术被广泛研究，期望未来在疾病的诊断和治疗方面提供更全面的信息。目前，对于放射性核素、核磁共振、超声等多模态成像探针的研究较多，但对于生物发光和光声成像的双模态成像探针还缺乏充分的研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测细胞凋亡的双模态成像探针及其构建方法和应用，提供了一种duramycin-fluc-au双模态成像探针，利用duramycin特异性靶向在凋亡早期细胞膜上外翻的pe，结合fluc的生物发光和aunrs的光声成像实现对凋亡细胞的双模态成像检测。

2、为了达到上述目的，本发明提供了一种检测细胞凋亡的双模态成像探针，该探针为duramycin-fluc-au，其由多肽duramycin、萤火虫荧光素酶fluc和金纳米棒au nrs制备获得；其中，多肽duramycin的氨基酸序列如seq id no.1所示；萤火虫荧光素酶fluc是由核苷酸序列如seq id no.2所示的编码基因外源表达所得；金纳米棒aunrs是通过晶种法合成所得。

3、进一步地，本发明提供的双模态成像探针duramycin-fluc-au是通过将多肽duramycin、nhs-peg2000-sh和三乙胺混合反应，得到duramycin-peg2000-sh；将au nrs与nhs-peg2000-sh混合反应，得到nhs-peg2000-au；再将nhs-peg2000-au与fluc混合反应，得到fluc-peg2000-au；再将fluc-peg2000-au和duramycin-peg2000-sh混合反应，即得双模态成像探针duramycin-fluc-au。

4、本发明还提供了一种检测细胞凋亡的双模态成像探针的构建方法，包含：

5、将多肽duramycin、nhs-peg2000-sh和三乙胺混合进行反应，将反应后的反应液进行透析，得到duramycin-peg2000-sh；

6、将au nrs与nhs-peg2000-sh混合进行反应，将反应后的反应物离心，将离心所得的沉淀物在超纯水中分散得到nhs-peg2000-au；

7、将nhs-peg2000-au与fluc混合进行反应，生成fluc-peg2000-au；

8、将fluc-peg2000-au和duramycin-peg2000-sh混合进行反应，得到双模态成像探针duramycin-fluc-au。

9、进一步地，上述的金纳米棒aunrs通过晶种法合成，其合成方法包含：

10、将ctab与haucl4快速混匀后加入nabh4，静置得到金种子溶液；

11、依次混合ctab、haucl4、agno3和h2so4制得溶液，在所得溶液中再滴加l-抗坏血酸以配制生长溶液；

12、在所得的生长溶液中加入金种子溶液，静置过夜，以触发金纳米棒的生成；

13、离心静置过夜的溶液以去除多余ctab，即得金纳米棒aunrs，收获au nrs在超纯水中重新分散。

14、进一步地，上述的构建方法具体如下：

15、在制备金种子溶液中，ctab为0.1m、7.5ml的ctab，haucl4为0.01m、0.25ml的haucl4，nabh4为预冷的0.01m、0.6ml的nabh4，于27℃静置2h；

16、在制备生长溶液中，ctab为0.1m、100ml的ctab，haucl4为0.01m、5ml的haucl4，agno3为0.01m、0.8ml的agno3，h2so4为0.5m、0.8ml的h2so4，l-抗坏血酸为0.1m、0.8ml的l-抗坏血酸；

17、在上述生长溶液中加入的金种子溶液为0.24ml，并于27℃静置过夜；

18、上述的离心的条件为：12000rpm离心10min。

19、本发明还提供了一种duramycin-fluc-au的构建方法，包含如下：

20、将多肽duramycin、nhs-peg2000-sh和三乙胺混合进行室温反应，将反应后的反应液在超纯水中进行透析，得到duramycin-peg2000-sh；

21、将aunrs与nhs-peg2000-sh混合进行室温反应，将反应后的反应物于12000rpm离心30min，将离心所得的沉淀物在超纯水中分散得到nhs-peg2000-au；

22、将nhs-peg2000-au与fluc混合进行冰浴搅拌，生成fluc-peg2000-au；

23、将fluc-peg2000-au和duramycin-peg2000-sh混合进行冰浴搅拌，得到双模态成像探针duramycin-fluc-au。

24、本发明提供的检测细胞凋亡的双模态成像探针可应用于非疾病诊断中以细胞凋亡为主要特征的检测中，通过凋亡细胞的生物发光和光声成像实现凋亡的可视化监测。

25、本发明的检测细胞凋亡的双模态成像探针duramycin-fluc-au及其构建方法，能够很好地在生物体内表达，实现了对凋亡细胞生物发光和光声成像的双模态成像，具有以下优点：

26、(1)本发明提供的生物发光成像和光声成像这两种成像模式的探针，在非疾病诊断中为以细胞凋亡为主要特征的一种实时、无创的可视化监测工具。

27、(2)磷脂酰乙醇胺(pe)是第二丰富的磷脂，而duramycin是一种高度翻译后修饰的多肽，与pe结合。在细胞凋亡早期，胞膜内的pe会翻转到细胞膜外表面，与pe的头部基团高亲和力结合，是一种潜在的pe分子探针。