用于检测BRAFV600基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其应用

本发明涉及生物。更具体地，涉及用于检测braf v600基因突变的引物探针组合物、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、braf基因位于人类染色体7q34，其功能编码区由2510对碱基组成，编码mapk通路中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该酶将信号从ras转导至mek1/2，从而参与调控细胞内多种生物学事件。braf基因突变在肿瘤患者中最常见的突变是第15号外显子上的v600e突变，braf v600k、v600r、v600d和v600m约占有10～20％。braf v600e突变可发生于多种肿瘤，如黑色素瘤、结直肠癌、甲状腺癌以及肺癌等。nccn指南推荐的lynch综合征的检测策略中，推荐在dna错配修复蛋白缺失的病例中进行braf基因突变检测。braf是甲状腺乳头状癌最为常见的基因突变，braf v600e突变可用于甲状腺乳头状癌的鉴别诊断。更重要的是，ⅱ期临床试验证明携带braf v600e突变的黑色素瘤患者对braf激酶抑制剂威罗菲尼的响应效率超过50％，6个月总体生存期为84％。因此，braf基因突变检测已成为多种肿瘤临床诊治必需的检测项目。现有的braf v600基因突变检测技术主要包括qpcr、arms、ddpcr、ngs等。ddpcr和ngs虽然能在临床上提供较好的价值，但因需要昂贵的仪器设备、繁琐的操作过程等不同的原因未能在临床上大规模推广使用。现在市面上针对braf v600突变检测的主要产品为arms-pcr，目前存在以下几个缺点：(1)对于单点突变检测需在引物3’端引入额外突变或者进行引物自我配对形成颈环结构，导致灵敏度降低，对于临床上肿瘤患者穿刺组织经常出现肿瘤细胞过少的情况，而对此类样本点突变的检测则要求更高灵敏度的技术避免试剂敏感性问题造成假阴性风险；(2)特异性较低，不能完全抑制野生型样本的扩增，结果判读需计算δct较复杂，不能满足临床要求。(3)只能检测braf v600e基因突变，虽然p.v600e突变是braf基因中最常见的突变，占所有v600密码子突变的80～90％，但其他不太常见的v600密码子突变包括：c.1798_1799delgtinsaa，p.v600k(5～12％)、c.17981799delgtinsag，p.v600r(～5％)、c.1799_1800deltginsat，p.v600d(～1％)、c.1798g>a，p.v600m(<1％)也占有10～20％，容易造成漏检。

2、因此，需要开发出一种新的用于检测braf v600基因突变的amrs-pcr检测体系，以解决上述问题。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供敏感性高、特异性好的用于检测braf v600基因突变的引物探针组合物。

2、本发明的另一个目的在于提供包含上述引物探针组合物的用于检测braf v600突变的试剂盒及其应用。

3、为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

4、本发明首先提供了一种用于检测braf v600基因突变的引物探针组合物，包括如seq id no.1和seq id no.2所示的正向引物v600m-f和v600e-f、如seq id no.3所示的反向引物v600r和如seq id no.4所示的检测探针v600p。

5、进一步，所述检测探针v600p的5’端标记荧光基团，所述荧光基团选自fam、joe、hex、vic、cy5、tet中一种，3’端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自tamra、mgb、bhq1中一种。

6、进一步，所述引物探针组合物还包括如seq id no.5所示的正向内标引物gf、如seq id no.6所示的反向内标引物gr和如seq id no.7所示的内标探针gp。

7、进一步，所述内标探针gp的5’端标记荧光基团，所述荧光基团选自fam、joe、hex、vic、cy5、tet中一种，3’端标记淬灭基团，所述淬灭基团选自tamra、mgb、bhq1中一种。

8、本发明进一步提供上述引物探针组合物在制备用于检测braf v600基因突变的试剂或试剂盒中的应用。

9、本发明还提供一种用于检测braf v600基因突变的试剂盒，包括上述用于检测braf v600基因突变的引物探针组合物。

10、进一步，所述试剂盒还包括完成amrs-pcr反应所需的其他试剂。这些试剂本领域技术人员可以根据需要进行购买或按照文献的方法进行配制。例如，所述试剂盒还包括arms专用taq酶，荧光定量pcr反应缓冲液，dntps，阴性对照，阳性对照中的部分或全部。

11、进一步，所述arms专用taq酶为snupp taq dna polymerase，购自上海小海龟生物科技有限公司；所述荧光定量pcr反应缓冲液为5×snupp taq buffer，所述阴性对照为无核酸水和/或293t细胞gdna，所述阳性对照为包含braf v600基因突变的重组质粒。

12、本发明进一步还提供了利用上述引物探针组合物或试剂盒检测braf v600突变的方法，该方法包括以下步骤：

13、(1)获取待测样本的基因组dna(gdna)；

14、(2)以基因组dna或阴性对照或阳性对照为模板利用上述引物探针组合物或试剂盒构建pcr扩增反应体系进行荧光定量pcr扩增反应并收集荧光信号观察扩增曲线；

15、(3)结果分析：

16、①阳性：当阴性对照无扩增曲线且阳性对照具有明显的扩增曲线，检测待测样本的扩增曲线有明显的指数增长期，说明待测样本存在braf v600基因突变；

17、②阴性：当阴性对照无扩增曲线且阳性对照具有明显的扩增曲线，检测待测样本无ct值且曲线无明显的指数增长期，说明待测样本不存在braf v600基因突变或待测样本突变率低于最低检测限。

18、进一步，所述pcr扩增反应体系的总体积为50ul，包括：5×snupp taq buffer10ul，浓度10um的v600m-f 1ul，浓度10um的v600e-f 1ul，浓度10um的v600r 0.5ul，浓度2um的gf 1ul，浓度2um的gr 1ul，浓度2um的gp 0.5ul，浓度5u/μl的snupp taq dnapolymerase 1ul，基因组dna或阴性对照或阳性对照10-50ng，余量的ddh2o。具体见下表：

19、

20、

21、进一步，所述pcr扩增反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，64℃退火25s，68℃延伸25s，循环10次；95℃变性15s，60℃退火20s，68℃延伸20s，循环35次。

22、进一步，所述braf v600基因突变包括braf v600e(v600e1、v600e2)、v600k、v600r、v600d(v600d1、v600d2)和v600m基因突变中一种或多种。

23、本发明的有益效果如下：

24、本发明通过对大量引物、探针和taq酶进行优化和筛选，最终获得了显著提高检测灵敏度和特异性的braf v600基因突变检测引物探针组合物及arms专用taq酶；利用本发明引物探针组合物及arms专用taq酶对待测样本进行检测，灵敏度高达0.01％，待测样本gdna仅需10ng，媲美ddpcr；且同时检测braf v600e1、v600e2、v600k、v600r、v600d1、v600d2和v600m基因突变；特异性高，能耐受500ng的野生型基因组；根据扩增曲线直接判断有无突变，无需计算δct，结果判读简单直接。

25、本发明检测braf v600基因突变方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用，为临床样本提供快速、准确的辅助用药指导；尤其对于临床上预后观察及微量病变样本的检测提供更加有利的手段。