菌株、组合物和使用方法与流程

本发明涉及新的乳酸菌菌株，其单独或组合可以用作益生菌。本发明还涉及包含单独或组合的菌株的药物组合物、补充剂组合物和用于个人护理的产品。特别地，本发明涉及该菌株用于预防或治疗念珠菌病的用途。

背景技术：

1、过去几十年来，真菌感染的发生率显著增加，这主要是由于抗微生物耐药性的上升以及有效抗真菌药物的数量有限，其仍然存在许多副作用。在被视为人类病原体的真菌中，念珠菌属的一些成员最常见的是从真菌感染中回收的(silva et al.2012)。广谱抗生素的使用、义齿性口炎、导管和肠外营养、免疫抑制的存在、黏膜屏障的破坏、和化疗和放疗的使用以及功能障碍的微生物组是侵袭性真菌感染发展的最重要的诱发因素之一。念珠菌属包含超过150种异质物种，但只有少数与人类念珠菌病有关，因为大约65％的念珠菌属物种无法在37℃的温度下生长以使它们能够作为人类的病原体或共生体而繁荣发展。该属由异质生物群组成，并且已知超过17种不同的念珠菌属物种是人类感染的病原因子；然而，超过90％的侵袭性感染是由念珠菌属物种引起的(pfaller,ma.&dj.diekema 2007)。

2、念珠菌属物种的致病性归因于某些毒力因子，诸如逃避宿主防御的能力、菌丝形成、粘附和生物膜形成(在宿主组织上或在医疗设备上)以及产生组织损伤性水解酶，诸如蛋白酶、磷脂酶和溶血素(silva et al 2012)。

3、生物膜是具有非凡的组织程度的生物群落，其中微生物形成结构化、协调性和功能性的群落，包埋在自我产生的细胞外基质中。生物膜的产生还与相关生物体的高水平抗菌素耐药性有关。念珠菌属物种形成耐药生物膜的能力是其导致人类疾病的重要因素，但人们也认识到，新的医疗实践(免疫抑制治疗、侵入性外科手术、广谱抗生素的使用以及由功能失调的微生物群引起的疾病)的更普遍提供也非常重要。

4、抗真菌药物通过杀死真菌细胞(例如影响细胞壁中的物质，导致细胞内容物泄漏和死亡)或通过阻止真菌细胞生长和繁殖来发挥活性。抗真菌药物有很多类别：多烯类，包括两性霉素、制霉菌素和匹马霉素；唑类，包括氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑、伏立康唑、泊沙康唑和罗沙康唑(rosaconazole)；棘球白素，诸如卡泊芬净和米卡芬净；和烯丙胺类，包括萘替芬、特比萘芬、吗啉药物、阿莫罗芬和灰黄霉素；以及引入了5-氟胞嘧啶的抗代谢抗真菌药物。这些药物的共同点是在产生耐药性、缺乏功效以及化合物的毒性方面具有越来越多的问题。

5、两性霉素b和氟康唑是最广泛用于治疗全身真菌感染的抗真菌剂。前者由于对人体具有高度毒性，其使用受到限制。后者经常用于治疗念珠菌感染，尽管许多念珠菌属物种表现出氟康唑耐药性。

6、念珠菌属物种能够定殖在宿主组织以及非生物表面，并在那里发展为多层生物膜结构。与念珠菌属物种的粘附能力相关的重要因素是其细胞壁上存在特定蛋白质，即黏附素。在光滑念珠菌(c.glabrata)中，一大类黏附素由epa(上皮黏附素)基因家族编码。epa蛋白的整体结构与白念珠菌(c.albicans)的als(凝集素样序列)蛋白的整体结构相似。als基因是与白念珠菌和其他念珠菌属物种致病机制相关的基因家族的一种实例。

7、生物膜形成能力可能赋予念珠菌属物种生态优势，通过允许它们逃避宿主免疫机制、抵抗抗真菌治疗并承受来自其他微生物的竞争压力，帮助它们作为人类共生体和病原体生存。生物膜的形成除了可能是这些物种生存的关键因素之外，还可能是念珠菌属物种特别适合组织定殖和留置医疗器械定殖的原因。

8、白念珠菌对宿主细胞或聚合物的粘附是成功定植以及发病机制和感染发展的重要且必要的第一步。白念珠菌能够直接或通过中间层粘附到例如丙烯酸类树脂义齿上，这是感染过程发展的第一步。与念珠菌对不同表面的粘附有关的几个因素，包括生物材料的表面结构、性质和组成、疏水性和粗糙度都会影响念珠菌的粘附。

9、在念珠菌属中，所谓的毒力因子不仅包括粘附、菌丝形成和生物膜形成，还包括破坏宿主组织的能力，这可能是通过向局部环境释放水解酶来促进的。酶的一般分泌诸如蛋白酶、磷脂酶、脂肪酶和溶血素有助于酵母在巨噬细胞内生存和复制，从而能够破坏上皮。

10、磷脂酶(pl)将磷脂水解成脂肪酸，并且其产生会导致宿主细胞膜损伤，促进细胞损伤或暴露促进粘附的受体。已知念珠菌产生脂肪酶和磷脂酶，这显然会促进与宿主黏膜的更大更强的界面，破坏黏膜并支持对相关组织的有效入侵。此外，已知溶血素是促进播散性念珠菌病菌丝侵入的假定毒力因子。最近，一些作者报告说，许多念珠菌属物种，包括光滑念珠菌，表现出不同的产生α-或β-溶血素的能力(luo et al.2001)。

11、念珠菌属物种，包括光滑念珠菌，可以通过降解血红蛋白并从宿主细胞中提取元素铁进行代谢过程来在宿主中生长(negri m et al 2010)。已知溶血素是支持念珠菌属物种致病性的假定毒力因子，但对溶血活性的基因表达知之甚少。

12、抗真菌耐药性既是复杂的又是多方面的。它可以对化合物的反应是可诱导性的，也可以是由于长期暴露而导致的不可逆转的遗传变化。具体来说，这些包括靶分子的改变或甚至过度表达、通过外排泵的主动挤出、有限的扩散、耐受性和细胞密度，这些都是真菌用来对抗抗真菌治疗作用的特征机制。浮游细胞通常依靠不可逆的遗传变化来维持抗性表型，而生物膜细胞由于其物理存在和群体密度而能够持续存在，这提供了几乎可诱导的耐药表型，而与定义的遗传改变无关。因此，由于不同的特性，念珠菌本质上对常用的抗真菌药物的敏感性降低。

13、白念珠菌是二形共生真菌，定植于健康的人类皮肤、黏膜、口腔和生殖道。白念珠菌也是主要的机会性真菌病原体，导致疾病表现诸如播散性念珠菌病和慢性皮肤黏膜念珠菌病(cmc)。

14、念珠菌属物种属于口腔、皮肤、胃肠道和阴道的正常微生物区系，引起从皮肤黏膜过度生长到血流感染的多种临床表现。念珠菌属的物种一度被认为是非致病性的，但很快就成为许多人类疾病的罪魁祸首。年复一年，这些病理情况更加反复出现，治疗起来也更加困难，特别是当患者表现出任何水平的免疫抑制或具有功能失调的微生物组时，例如，随着微生物多样性的降低。这些困难源于念珠菌能够形成生物膜的表型以及其还对传统抗真菌疗法的高耐药性。念珠菌属中的致病真菌可引起浅表和严重的全身性疾病，并且现在被认为是医院获得性感染的主要病原体。许多念珠菌感染涉及植入装置诸如留置导管或人工心脏瓣膜上生物膜的形成。在导管材料上体外形成的白念珠菌生物膜由基质封闭的酵母菌和菌丝的微菌落组成，排列成双层结构。

15、这些生物膜对目前临床使用的一系列抗真菌剂具有耐药性，包括对两性霉素b和氟康唑，并且似乎存在多种耐药机制。

16、乳酸菌是人类肠道、口腔和阴道微生物菌群的一部分。乳酸菌通过产生酸和酸化例如阴道，通过其他抗微生物产品诸如过氧化氢h2o2、抗菌肽或生物表面活性剂，在保护人体免受感染方面发挥着重要作用。

17、许多局部、阴道、口服和全身药物可能会杀死乳酸菌。因此，用抗生素治疗感染可能会使身体面临重复获得感染或由耐药微生物引起的新感染(例如念珠菌病)的风险增加。

18、几十年来，抗真菌剂已经成功用于预防黏膜和侵袭性真菌感染。然而，由于药物副作用(恶心、呕吐和腹泻)和耐药菌株的出现，抗真菌预防尚未完全成功。与它们的浮游对应物相比，念珠菌的生物膜表型和阶段对所有这些抗真菌药物具有更强的耐药性。有限的效果和抗真菌药物耐药性的逐渐出现令人担忧，因此迫切需要替代疗法。

19、鉴于目前可用的抗微生物化合物的限制，使用益生菌微生物对抗念珠菌病是治疗或预防念珠菌感染的有吸引力的替代疗法。

20、用于阴道内或口服使用的乳酸菌以益生菌制剂的形式在健康食品商店或乳制品中销售已有超过50年的历史。这些产品包括含有冻干乳酸菌属的物种的阴道栓剂。这些产品在治疗感染方面基本上没有效果，因为这些产品无法使外源性乳杆菌定植于阴道或胃肠道，无法防止病原体生物膜形成，或者缺乏体内抗菌活性。通常，传统益生菌用于维持健康的肠道菌丛，但不知道其有任何靶向或特定的抗菌机制。

21、市售乳杆菌属已被证明不能防止病原体生物膜的形成，市售乳酸菌也没有针对持续性念珠菌感染的抗微生物活性。大多数市售益生菌菌株并不是根据其抗菌活性进行系统选择，而是根据其扩大规模的能力进行选择(kwak,y-k.et al.2017)。

22、念珠菌属的物种形成生物膜的能力导致了念珠菌病典型的高复发率，并且不幸的是，这使得重复的抗真菌治疗不可避免。因此，能够预防、抑制或减少由念珠菌属的物种发展生物膜的乳酸菌将是有利的。

23、此外，需要用于治疗感染的乳酸菌，其中乳酸菌保持了在共培养物中的抗微生物活性、在念珠菌属的物种存在下酸化和防止生物膜形成的能力。

24、本发明提供了新的益生菌菌株和组合物，其靶向念珠菌的至少一种毒力机制，包括确定为生长抑制、生物膜附着或形成的抑制或阻止念珠菌分泌毒力因子(如磷脂酶、蛋白酶和溶血因子)的能力的抗微生物活性。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的涉及新的乳酸菌以及包含所述新的乳酸菌的组合物、局部组合物、阴道组合物、眼组合物、耳组合物或口腔组合物，以及它们预防或治疗念珠菌病和念珠菌感染的能力。

2、特别地，本发明的目的是提供新的乳酸菌菌株和包含该新的乳酸菌菌株的组合物，其解决了现有技术中生物膜形成、特别是念珠菌病原体的生物膜形成的问题，从而预防感染。

3、因此，本发明的一个方面涉及一种组合物，包含保藏在登录号dsm 33730下的戊糖片球菌(pediococcus pentosaceus)lb606r；保藏在登录号dsm 33731下的植物乳植杆菌(lactiplantibacillus plantarum)lb679r；或其组合。

4、本发明的另一个方面涉及选自保藏在保藏登录号dsm 33730下的戊糖片球菌lb606r的分离的细菌菌株；和/或选自保藏在保藏登录号dsm 33731下的植物乳植杆菌lb679r的一种或多种细菌菌株。

5、本发明的又一个方面涉及一种组合物，其包含选自一种或多种片球菌属(pediococcus)菌株的一种或多种细菌菌株；和/或选自一种或多种乳植杆菌属(lactiplantibacillus)菌株的一种或多种细菌菌株，用于用作药物的用途。

6、本发明的又一个方面涉及一种组合物，其包含选自一种或多种片球菌属菌株的一种或多种细菌菌株；和/或选自一种或多种乳植杆菌属菌株的一种或多种细菌菌株，用于预防和/或治疗疗人或动物的念珠菌病的用途。

7、本发明的又一个方面涉及一种组合物，其包含选自一种或多种片球菌属菌株的一种或多种细菌菌株；和/或选自一种或多种乳植杆菌属菌株的一种或多种细菌菌株，用于预防、抑制或治疗生物膜形成的用途。

8、本发明的又一个方面涉及一种用于防止环境中生物膜形成的方法，其中所述生物膜包含念珠菌属物种，所述方法包括以下步骤：向所述环境施用有效量的具有抗微生物活性的乳酸菌，其中所述环境是家庭、工作场所、实验室、工业环境、医院环境、水生环境、医疗器械、牙科器械、上皮细胞、黏膜、动物体或人体。

9、本发明的另一方面涉及食品或饲料成分以及个人卫生产品，其包含根据权利要求1-6所述的组合物。