用于建立和维持早期胚胎样细胞的培养基和方法与流程

本发明涉及用于建立和维持哺乳动物早期胚胎样细胞的培养基和方法。

背景技术：

1、哺乳动物胚胎发生是导致胚胎发育的细胞分裂和分化的复杂过程。精子与卵母细胞的成功受精会触发胚胎发生的开始。这个被严格控制的过程从一个受精卵中产生了数十亿个具有不同功能和形态的细胞。所有有性繁殖生物体的巨大的细胞复杂性都始于胚胎发生。一开始，单个受精卵会分裂形成2个细胞。然后这2个细胞会继续分裂形成4细胞、8细胞和16细胞。在进一步扩增后，胚胎变成由两个区域组成的囊胚(blastocyst)，这两个区域分别称为内细胞团(icm)和滋养外胚层(te)，直到这个阶段，胚胎发育被称为植入前(preimplantation，在子宫壁)阶段。在植入(post-implantation)后的发育阶段，icm细胞将产生羊膜和所有胎儿组织，而te细胞将产生胎盘。所有这些发育阶段都已在小鼠中得到了很好的表征，因为我们可以容易地在无伦理问题的情况下从小鼠胚胎中获取这些细胞。evans和kaufman的开创性工作表明，可以从小鼠囊胚的icm中提取细胞，然后在适当的培养条件下在体外无限期地培养这些细胞(evans and kaufman,1981)。这些细胞被称为胚胎干细胞(esc)，是小鼠囊胚的icm内的细胞的代表。小鼠esc是多能的，但不是全能的，这意味着它们只能分化成胚胎的全部三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)，因此可以产生对应于所有胎儿组织的细胞。相反，全能性是细胞形成包括胚胎细胞和胚胎外细胞的整个生物体的能力，而不仅仅是多能细胞情况下产生胎儿组织。在小鼠早期胚胎中，早于4细胞阶段的细胞是全能性的，而在人中，全能性至少持续到8细胞(8c)阶段(hu,2019)。在evans和kaufman的发现的17年后，thomson及其同事能够从人icm产生人esc(thomson et al.,1998)。

2、由于人psc在疾病建模和再生医学方面的巨大潜力，因此进行了大量研究以寻找这些细胞的替代来源，而无需破坏人胚胎。2006年，takahashi和yamanaka发现了一种从已经分化的细胞产生诱导psc(induced psc,ipsc)的方法，而无需考虑伦理问题(takahashiand yamanaka,2006)。esc和ipsc非常相似，在本文统称为psc。

3、尽管小鼠esc和人esc均来源于植入前囊胚的icm，但它们表现出不同的特征。在传统条件下培养的人psc显示出多能性的始发态(primed)状态，类似于源自植入后外胚层的小鼠外胚层干细胞(episc)(brons et al.,2007；tesar et al.,2007)。始发态人psc显示扁平集落形态，作为单细胞传代后存活率低，需要成纤维细胞生长因子2(fgf2)和转化生长因子-β1(tgfβ1)/activin a/nodal信号转导(signaling)，并且无法促进人-小鼠种间嵌合体形成。相比之下，小鼠esc处于更接近植入前icm的原始态状态，其特征是圆顶形集落、单细胞克隆的形成增加、依赖于janus激酶/信号转导及转录激活因子3(jak/stat3)的信号转导、植入前icm样转录谱和嵌合的能力(nichols and smith,2011；ying et al.,2008)。此外，小鼠esc比episc具有更大的分化潜能(honda et al.,2013)。此外，近年来有报道称，小鼠esc培养物中的一小部分(约0.5％)2细胞胚胎样细胞(2clc)显示出类似于2细胞(2c)阶段小鼠胚胎的转录谱(macfarlan et al.,2012)。这非常重要，因为2c细胞是全能的。

4、最近，已经公开了多种方法来衍生和维持人和非人灵长类psc的改变的状态(gafni et al.,2013；takashima et al.,2014；theunissen et al.,2014)，其表现出人原始态(植入前样)特征。这些细胞与小鼠胚胎干细胞在形态和分子上有一些相似之处。然而，这些报道的人原始态psc是否真的与植入前icm相似仍在争论中。此外，目前的每一种方法都有特定的缺点，例如冗长、产生不同水平的原始态特异性基因、用于原始态诱导的转基因依赖性、基因组不稳定、印记丢失、无法进行多谱系分化以及低效或没有适当的嵌合体形成能力。

5、psc具有用于再生医学中的细胞治疗以及通过患者特异性疾病建模来研究疾病的巨大潜力(shi et al.,2017)。目前，研究人员正在使用始发态psc作为这些研究的源材料。原始态细胞开始发挥作用的一个领域是种间嵌合体的产生。这些实验涉及将一个物种的psc注射到另一个物种的发育的胚胎中，然后测量对生物体有促成作用的细胞百分比。然而，目前对嵌合体的促成作用非常低(<0.01％)。我们相信在转录和表观遗传学上更接近早期胚胎的psc在整体上会改善嵌合体的促成作用和psc的实际功能。

6、psc的另一个令人兴奋的研究领域是类囊胚(blastoid)形成。类囊胚是囊胚样结构，目前通过esc和te细胞的强制聚集在体外形成(shahbazi and zernicka-goetz,2018)。这些早期胚胎的体外模型将为发育过程提供新的思路，并可用于对影响胚胎发生的疾病建模。然而，目前最先进的模型需要混合几种类型的细胞，而不是所有细胞都来自单个细胞和自组织，并且类囊胚的行为不能像真正的囊胚一样，例如，它们不能正确形成原肠胚(li etal.,2019)。我们相信，使用在转录和表观遗传学上更接近早期胚胎的细胞将改善这一过程，并能够导致真实类囊胚的形成。

7、发育中细胞命运转变的主要控制者是表观遗传。这意味着操纵表观基因组，我们就应该能够产生匹配任何发育阶段的细胞。这种探索的最好实例之一是从体细胞产生ipsc。在这里，转录因子的瞬时表达或化合物足以将完全分化的细胞转变为psc(hou etal.,2013；takahashi and yamanaka,2006)。其他实例包括上述使用表观遗传通路的小分子抑制剂和细胞因子将始发态状态psc转化成原始态状态。表观基因组的关键组成部分之一是dna甲基化，其在基因调控中起着核心作用。早期胚胎发生中细胞的总体dna甲基化含量是高度动态的。已知植入前囊胚的dna甲基化程度远低于植入后胚胎，并且有趣的是，也低于8c胚胎(zhu et al.,2018)。因此，将始发态psc逆转到icm样状态需要显著降低整体dna甲基化水平，而相应地，要捕获8c样阶段则需要更可控的降低。此外，鉴于印记控制区域(icr)应保持半甲基化，在逆转过程中需要对dna甲基化景观(landscape)进行正确重排(rewire)。因此，dna甲基化机制的微调对于产生早期胚胎样细胞是绝对必要的。

技术实现思路

1、一方面，本公开公开了一种用于培养psc的化学成分限定的培养基(chemicallydefined culture medium)，其包含用于培养干细胞的基础培养基，并补充有s-腺苷高半胱氨酸水解酶(s-adenosylhomocysteine hydrolase，sah)抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(histonedeacetylase，hdac)抑制剂和wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂。

2、在一个或多个实施方案中，sah抑制剂是多梳抑制复合物(polycomb repressivecomplexe，prc)和/或ezh2抑制剂。

3、在一个或多个实施方案中，wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂是端锚聚合酶抑制剂。

4、在一个或多个实施方案中，化学成分限定的培养基进一步补充有一种或多种选自由l-抗坏血酸或其衍生物、jak/stat3信号转导激活剂和丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulatedkinase，mapk/erk)信号转导抑制剂组成的组的组分；任选地，培养基进一步补充有一种或多种选自由activin/nodal信号转导激活剂、rho相关蛋白激酶(rho-associated proteinkinase，rock)抑制剂和细胞外基质组成的组的组分。

5、在一个或多个实施方案中，sah/prc/ezh2抑制剂选自由3-去氮腺嘌呤a(3-deazaneplanocin a，dznep)和cpi-1205组成的组。

6、在一个或多个实施方案中，dznep以5至80nm、优选5至50nm的终浓度存在于培养基中。

7、在一个或多个实施方案中，cpi-1205以0.5至5mm、优选1至3mm的终浓度存在于培养基中。

8、在一个或多个实施方案中，hdac抑制剂选自由曲古抑菌素a(trichostatin a，tsa)、丙戊酸(valproic acid，vpa)和丁酸钠(sodium butyrate，nab)组成的组。

9、在一个或多个实施方案中，tsa以3至30nm、优选3至25nm的终浓度存在于培养基中。

10、在一个或多个实施方案中，vpa以0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的终浓度存在于培养基中。

11、在一个或多个实施方案中，nab以0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的终浓度存在于培养基中。

12、在一个或多个实施方案中，端锚聚合酶抑制剂选自由iwr1和xav939组成的组。

13、在一个或多个实施方案中，培养基中wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂的终浓度为2至8μm。

14、在一个或多个实施方案中，培养基中l-抗坏血酸的终浓度为40至70μg/ml。

15、在一个或多个实施方案中，培养基中jak/stat3信号转导激活剂的终浓度为10至50ng/ml。

16、在一个或多个实施方案中，jak/stat3信号转导激活剂是lif。

17、在一个或多个实施方案中，培养基中pd0325901的终浓度为0.5至3μm。

18、在一个或多个实施方案中，mapk/erk信号转导抑制剂是pd0325901。

19、在一个或多个实施方案中，activin/nodal信号转导激活剂的终浓度为10至25ng/ml。

20、在一个或多个实施方案中，activin/nodal信号转导激活剂选自由activin a和nodal组成的组。

21、在一个或多个实施方案中，培养基中rock抑制剂的终浓度为0.5至2μm。

22、在一个或多个实施方案中，rock抑制剂选自由y27632、thiazovivin和羟基法舒地尔(hydroxyfasudil)组成的组。

23、在一个或多个实施方案中，培养基中细胞外基质的量为0.1至0.5％(v/v)。

24、在一个或多个实施方案中，细胞外基质选自由matrigeltm、geltrextm和ecmtm组成的组。

25、在一个或多个实施方案中，培养基包含终浓度为5至15nm的dznep或终浓度为0.5至3mm的cpi-1205；终浓度为3至10nm的tsa，或终浓度为0.25至1mm的vpa，或终浓度为0.25至1mm的nab；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；和终浓度为2至8μm、优选3至6μm的iwr1或xav939；并且进一步补充有：

26、(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；和0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质；或

27、(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；和终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或

28、(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；和0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质；或

29、(4)终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；和0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质；或

30、(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度为0.5至2μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质。

31、在一个或多个实施方案中，培养基包含10nm的dznep或1mm的cpi-1205；5nm的tsa，或0.5mm的vpa，或0.5mm的nab；50μg/ml的l-抗坏血酸；20ng/ml的lif；1μm的pd0325901；和5μm的iwr1或5μm的xav939；并且进一步补充有(1)20ng/ml的人activin a或人nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，和1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activina或nodal，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的细胞外基质。

32、在一个或多个实施方案中，培养基包含终浓度为40至70nm的dznep或终浓度为2至4mm的cpi-1205；终浓度为10至30nm的tsa，或终浓度为0.5至1.5mm的vpa，或终浓度为0.5至1.5mm的nab；终浓度为40至70μg/ml的l-抗坏血酸；终浓度为10至30ng/ml的lif；终浓度为0.5至1.5μm的pd0325901；和终浓度为2至8μm、优选3至6μm的iwr1或xav939；并且进一步补充有：

33、(1)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；终浓度在0.5至2μm范围内的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；和0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质；或

34、(2)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；和终浓度在0.5至2μm范围内的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或

35、(3)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；和0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质；或

36、(4)终浓度在0.5至2μm范围内的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；和0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质；或

37、(5)终浓度为10至25ng/ml的activin a或nodal；或终浓度在0.5至2μm范围内的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；或0.1％至0.5％(v/v)的量的细胞外基质。

38、在一个或多个实施方案中，培养基包含50nm dznep或3mm cpi-1205；20nm tsa，或1mm vpa，或1mm nab；50μg/ml l-抗坏血酸；20ng/ml lif；1μm pd0325901；和5μm iwr1或5μm xav939；并且进一步补充有(1)20ng/ml的activin a或nodal，1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(2)20ng/ml的activin a或nodal，和1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔；(3)20ng/ml的activin a或nodal，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(4)1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和0.2％(v/v)的细胞外基质；或(5)20ng/ml的activin a或nodal，或1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，或0.2％(v/v)的细胞外基质。

39、在一个或多个实施方案中，基础培养基选自由以下组成的组：dulbecco改良的eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、格拉斯哥最小必需培养基(gmem)、iscove改良的dulbecco培养基、neurobasal培养基、dmem/f12和高级(advanced)dmem/f12及其组合；优选地，基础培养基为高级dmem/f12和neurobasal的1:1(v/v)比例的培养基的混合物。

40、在一个或多个实施方案中，所述培养基进一步补充有一种或多种选自由以下组成的组的组分：血清替代物、替代碳源、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺或其替代物和抗生素。

41、在一个或多个实施方案中，所述血清替代物选自由以下组成的组：knockouttm血清替代物(kosr)、n2和b27及其组合；优选地，所述血清替代物为n2和b27的1:1(v/v)比例的混合物；所述替代碳源为丙酮酸盐，例如丙酮酸钠；所述l-谷氨酰胺或其替代物为glutamaxtm补充剂，其包含0.85％ nacl中的l-丙氨酰-l-谷氨酰胺二肽；和/或所述抗生素选自由以下组成的组：青霉素、链霉素、或青霉素和链霉素的混合物。

42、另一方面，本公开公开了一种用于将灵长类psc转化为植入前icm样细胞(icm-like cell，iclc)和/或8细胞胚胎样细胞(8-cell embryo-like cell，8clc)的方法，包括在sah/prc/ezh2抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase，hdac)抑制剂和wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂的存在下培养所述灵长类psc或iclc。本公开还公开了一种用于将iclc转化为8clc的方法，包括在sah/prc/ezh2抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂和wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂的存在下培养所述iclc。

43、在一个或多个实施方案中，该方法包括在sah/prc/ezh2抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂和wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂和一种或多种选自由l-抗坏血酸、jak/stat3信号转导激活剂和mapk/erk信号转导抑制剂组成的组的组分的存在下、并且任选地在一种或多种选自由activin/nodal信号转导激活剂、rock抑制剂和细胞外基质组成的组的组分的存在下，培养所述灵长类psc或iclc。

44、在一个或多个实施方案中，所述sah/prc/ezh2抑制剂选自由dznep和cpi-1205组成的组。

45、在一个或多个实施方案中，所述hdac抑制剂选自由tsa、vpa和nab组成的组。

46、在一个或多个实施方案中，所述wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂是端锚聚合酶抑制剂。

47、在一个或多个实施方案中，所述端锚聚合酶抑制剂选自由iwr1和xav939组成的组。

48、在一个或多个实施方案中，所述wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂或所述端锚聚合酶抑制剂的终浓度为2至8μm。

49、在一个或多个实施方案中，在终浓度为5至80nm、优选5至50nm的dznep或终浓度为0.5至5mm、优选1至3mm的cpi-1205的存在下，并且在终浓度为3至30nm、优选3至25nm的tsa，或终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的vpa，或终浓度为0.25至2mm、优选0.5至1.5mm的nab的存在下，并且在终浓度为2至8μm、优选3至6μm的iwr1或xav939的存在下，培养所述灵长类psc或iclc。在一个或多个实施方案中，l-抗坏血酸以40至70μg/ml的终浓度存在。

50、在一个或多个实施方案中，所述jak/stat3信号转导激活剂的终浓度为10至50ng/ml。

51、在一个或多个实施方案中，所述jak/stat3信号转导激活剂是lif。

52、在一个或多个实施方案中，所述mapk/erk信号转导抑制剂的终浓度为0.5至3μm。

53、在一个或多个实施方案中，所述mapk/erk信号转导抑制剂是pd0325901。

54、在一个或多个实施方案中，所述activin/nodal信号转导激活剂的终浓度为10至25ng/ml。

55、在一个或多个实施方案中，所述activin/nodal信号转导激活剂选自由人activina和人nodal组成的组。

56、在一种或多种实施方式中，所述rock抑制剂的终浓度为0.5至2μm。

57、在一个或多个实施方案中，所述rock抑制剂选自由y27632、thiazovivin和羟基法舒地尔组成的组。

58、在一个或多个实施方案中，所述细胞外基质以0.1-0.5％(v/v)的量存在。

59、在一个或多个实施方案中，所述细胞外基质选自由matrigeltm、geltrextm和ecmtm组成的组。

60、另一方面，本公开还公开了一种用于将灵长类psc转化为iclc的方法，包括在本公开的培养基中培养所述psc以转化为iclc，其中所述培养基的基础培养基选自由以下组成的组：dulbecco改良的eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、格拉斯哥最小必需培养基(gmem)、iscove改良的dulbecco培养基、neurobasal培养基和dmem/f12及其组合；优选地，所述基础培养基为高级dmem/f12和neurobasal培养基的1:1(v/v)比例的混合物。

61、另一方面，本公开公开了一种用于将灵长类psc或iclc转化为8clc的方法，包括在本公开的培养基中培养所述灵长类psc或iclc以将灵长类psc转化为iclc或8clc，其中所述培养基的基础培养基选自由以下组成的组：dulbecco改良的eagle培养基(dmem)、最小必需培养基(mem)、基础培养基eagle(bme)、rpmi1640、f10、f12、α最小必需培养基(αmem)、格拉斯哥最小必需培养基(gmem)、iscove改良的dulbecco培养基、neurobasal培养基、dmem/f12和高级dmem/f12及其组合；优选地，所述基础培养基为高级dmem/f12和neurobasal培养基的1:1(v/v)比例的混合物。

62、在一个或多个实施方案中，所述灵长类psc选自由以下组成的组：

63、(i)来自esc系和/或ecc系的细胞；

64、(ii)来自ipsc系的细胞；

65、(iii)来自体外培养的植入前囊胚的icm的细胞；

66、(iv)来自体外培养的植入后囊胚的icm的细胞；

67、(v)体外培养的8c期至桑葚胚期的胚胎的细胞。

68、在一个或多个实施方案中，在一种或多种选自由以下组成的组的条件下培养所述灵长类psc或iclc：(i)在饲养细胞上；(ii)在没有饲养细胞的细胞外基质上；(iii)在没有饲养细胞的悬浮液中；(iv)在约37℃的温度的低氧或常氧条件下增殖；(v)每3至4天以1:4至1:8的平分比数(split ratio)作为单细胞传代；(vi)每天更换培养基。

69、另一方面，本公开提供了一种分离的iclc，其具有接近相应灵长类植入前icm的转录组、转座因子谱、dna甲基化组、染色质景观和代谢状态。

70、在一个或多个实施方案中，所述灵长类iclc的特征还在于以下特征中的一种或多种：

71、1)能够在培养物中自我更新和保持多能性；

72、2)根据核型在培养物中保持基因组稳定性；

73、3)能够产生3个胚层的细胞；

74、4)能够产生原始生殖细胞样细胞；

75、5)能够整合到小鼠胚胎中并且对胚胎组织和胚胎外组织有促成作用；

76、6)能够在体外转换(transit)至胚胎外细胞命运；和

77、7)能够在体外形成囊胚样结构。

78、在一个或多个实施方案中，所述iclc是通过本技术中描述的用于产生iclc的任一方法获得的。

79、另一方面，本公开提供了一种分离的灵长类8clc，其表达的8c胚胎特异性标志物的水平显著高于iclc和/或始发态psc；优选地，所述细胞具有接近相应灵长类8c期胚胎的转录组、转座因子谱和染色质景观。

80、在一个或多个实施方案中，所述8clc的特征还在于以下特征中的一种或多种：

81、1)根据核型在培养物中保持基因组稳定性；

82、2)能够产生3个胚层的细胞；

83、3)能够产生原始生殖细胞样细胞；

84、4)能够整合到小鼠胚胎中并且对胚胎组织和胚胎外组织有促成作用；

85、5)能够在体外转换至胚胎外细胞命运；和

86、6)能够在体外形成囊胚样结构。

87、在一个或多个实施方案中，所述8clc是通过本技术中描述的用于产生8clc的任一方法获得的。

88、本发明还提供了一种细胞培养物，包含本技术的任一实施方案中所述的灵长类iclc和/或8clc和培养基；优选地，所述培养基为本技术的任一培养基实施方案中所定义的。

89、本公开还提供了一种试剂盒，包含sah/prc/ezh2抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂和wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂，和任选地

90、(1)一种或多种选自由l-抗坏血酸、jak/stat3信号转导激活剂和mapk/erk信号转导抑制剂组成的组的组分；

91、(2)一种或多种选自由activin/nodal信号转导激活剂、rock抑制剂和细胞外基质组成的组的组分；

92、(3)一种或多种选自由基础培养基、血清替代物、替代碳源、非必需氨基酸、l-谷氨酰胺或其替代物和抗生素组成的组的组分。

93、在一个或多个实施方案中，试剂盒包含如本技术的任一培养基实施方案中定义的培养基。

94、本公开还提供了一种组合物，其包含sah/prc/ezh2抑制剂、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂和wnt/β-连环蛋白信号转导抑制剂，和任选地

95、(1)一种或多种选自由l-抗坏血酸、jak/stat3信号转导激活剂和mapk/erk信号转导抑制剂组成的组的组分；和

96、(2)一种或多种选自由activin/nodal信号转导激活剂和rock抑制剂组成的组的组分。

97、在一个或多个实施方案中，本技术的组合物包含dznep或cpi-1205，和tsa或vpa或nab，和iwr1或xav939，和lif，和pd0325901和任选的l-抗坏血酸；优选地，每种组分的存在量使得包含所述组合物的培养基包含：(a)5至15nm、优选10nm的dznep，或0.5至2mm、优选1mm的cpi-1205；(b)4至6nm、优选5nm的tsa，或0.25至1mm、优选0.5mm的vpa，或0.25至1mm、优选0.5mm的nab；(c)3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939；(d)10至30ng/ml、优选20ng/ml的lif；(e)0.5至1.5μm、优选1μm的pd0325901，和任选地(f)40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸。所述组合物还可包含activin a或nodal，和/或y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或细胞外基质，其中每种组分的存在量使得包含所述组合物的培养基包含10至25ng/ml、优选20ng/ml activin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1％至0.5％(v/v)的细胞外基质。

98、在一个或多个实施方案中，本技术的组合物包含dznep或cpi-1205，和tsa或vpa或nab，和iwr1或xav939，和lif，和pd0325901，和任选的l-抗坏血酸；优选地，每种组分的存在量使得包含所述组合物的培养基包含：40至70nm、优选50nm的dznep，或2至4mm、优选3mm的cpi-1205；10至30nm、优选20nm的tsa，或0.5至1.5mm、优选1mm的vpa，或0.5至1.5mm、优选1mm的nab；3至6μm、优选5μm的iwr1或xav939；10至30ng/ml、优选20ng/ml的lif；0.5至1.5μm、优选1μm的pd0325901；和任选地40至90μg/ml、优选50μg/ml的l-抗坏血酸。所述组合物还可包含activin a或nodal，和/或y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或细胞外基质，其中每种组分的存在量使得包含所述组合物的培养基包含10至25ng/ml、优选20ng/mlactivin a或nodal，和/或0.5至2μm、优选1μm的y27632、thiazovivin或羟基法舒地尔，和/或0.1％至0.5％(v/v)的细胞外基质。

99、本公开还提供了能够促进stella(也称为dppa3和pgc7)表达或提高stella活性的试剂在制备用于促进灵长类psc转化为iclc或促进灵长类psc或iclc转化为8clc的制剂、培养基或试剂盒中的用途，以及能够促进stella表达或提高stella活性的试剂用于促进灵长类psc转化为iclc或促进灵长类psc或iclc转化为8clc的用途。

100、在一个或多个实施方案中，能够促进stella表达或提高stella活性的试剂为sah/prc/ezh2抑制剂，其包括但不限于dznep和cpi-1205。优选地，sah/prc/ezh2抑制剂，例如dznep和cpi-1205，以如本技术中描述的任一实施方案中描述的量用于上述用途。

101、本公开还提供了能够促进khdc1l、trim60和/或属于真哺乳亚纲全能细胞同源盒(eutherian totipotent cell homeobox，etchbox)家族的基因(包括tprx1和argfx)的表达或提高khdc1l、trim60和/或属于etchbox家族的蛋白质(包括tprx1和argfx)的活性的试剂在制备用于促进灵长类psc或iclc转化为8clc的制剂、培养基或试剂盒中的用途，以及能够促进khdc1l、trim60和/或属于etchbox家族的基因(包括tprx1和argfx)的表达或提高khdc1l、trim60和/或属于etchbox家族的蛋白质(包括tprx1和argfx)的活性的试剂用于促进灵长类psc或iclc转化为8clc的用途。

102、在一个或多个实施方案中，能够促进tprx1、khdc1l和/或trim60的表达或提高tprx1、khdc1l和/或trim60的活性的试剂是sah/prc/ezh2抑制剂，其包括但不限于dznep和cpi-1205。优选地，sah/prc/ezh2抑制剂，例如dznep和cpi-1205，以如本技术中描述的任一实施方案中描述的量用于上述用途。