异位联合表达Atoh1和Tbx2基因促进内毛细胞再生及其应用

本发明涉及生物制剂和生物，尤其涉及atoh1和tbx2联合过表达促进耳蜗支持细胞转分化为内毛细胞及其应用。

背景技术：

1、耳蜗是听觉系统的声音感受器。耳蜗的听觉上皮细胞，又被称为柯蒂氏器(organof corti)，包含一排内毛细胞(ihcs)和三排外毛细胞(ohcs)。内外毛细胞可以表达多种毛细胞共同基因，如myo7a，但内外毛细胞在许多方面存在各自的特点。如作为声音信号放大器的外毛细胞，特异性的表达由slc26a5编码的运动蛋白prestin，slc26a5-/-小鼠由于外毛细胞的功能损伤表现出严重的听力障碍。内毛细胞作为声音的主要感觉细胞，特异性表达slc17a8编码的vglut3。vglut3是内毛细胞和耳蜗螺旋神经节(sgns)之间特有的带状突触结构释放兴奋性神经递质谷氨酸的关键，slc17a8-/-小鼠的内毛细胞无法传递神经递质到神经节细胞，从而导致听力完全丧失。因此，内外毛细胞对声音传递至关重要，遗憾的是哺乳动物不具备毛细胞再生的能力，意味着毛细胞一旦损坏将导致不可逆的永久性耳聋。

2、支持细胞(scs)与毛细胞(hcs)相邻排列，它们存在多种不同亚型，沿耳蜗轴内侧到外侧依次排列内侧边缘细胞(ibcs)、内指细胞(iphs)、柱细胞(pcs)和deiters’细胞(dcs)。ibcs和iphs属于内侧支持细胞亚群，它们的基因谱和发育起源与外侧pcs和dcs不同。如在pcs和dcs中prox1是瞬时表达，fgfr3持续表达，plp1和slc1a3则在ibcs和iphs中富集表达。但目前内侧支持细胞群的ibcs与iphs无法通过某个特定的分子标记来区分，因此将它们合并定义为ibcs/iphs。

3、与哺乳动物不同，鸡和鱼等非哺乳动物能够在毛细胞损伤后，通过支持细胞的转分化可以再生形成新的毛细胞。atoh1是耳蜗毛细胞发育的重要基因，在atoh1-/-小鼠中，毛细胞完全消失。相反，异位表达atoh1可以诱导产生额外的新生毛细胞。外侧支持细胞群pcs和dcs被认为与ohcs具有相同的细胞发育起源。atoh1可以将幼年的pcs和dcs转化为表达早期毛细胞标记myo7a的新生毛细胞，但新生毛细胞不能表达prestin。最新的研究表明，在成年小鼠的pcs和dcs中，同时异位诱导atoh1和ikzf2，可以再生出表达prestin的新生ohc，即prestin+类外毛细胞。ikzf2在小鼠出生后的外毛细胞中特异性表达，对外毛细胞的成熟至关重要。这提示了我们，在毛细胞分化中发挥了重要功能的基因，可能对促进新生毛细胞的成熟同样起到非常重要的作用。

4、ibcs/iphs与内毛细胞在分布位置上彼此邻近，并且在发育过程中具有相同的细胞起源。已报道的研究表明，新生小鼠ibcs/iphs细胞中异位表达atoh1，可以使ibcs/iphs转化为未成熟毛细胞。新生毛细胞表达myo7a和内毛细胞早期特异性标记基因fgf8。但新生毛细胞不能表达vglut3，不具有内毛细胞功能。因此，vglut3+内毛细胞的再生对于修复内毛细胞导致的听力损伤具有重要意义。

5、因此，本领域仍需探究可以促进myo7a+/fgf8+/vglut3-新生毛细胞转变为成熟的vglut3+新生内毛细胞的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的在于一种能够促进vglut3+新生内毛细胞再生的活性成分组合，以及包含所述活性成分组合的制剂或药物的用途。

2、本发明的第一方面，提供了一种活性成分组合的用途，用于制备一制剂或药物，所述的制剂或药物用于：(i)再生耳蜗內毛细胞；和/或(ii)治疗或预防听力受损；

3、其中，所述的活性成分组合包括：

4、(a)tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合；和

5、(b)atoh1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。

6、在另一优选例中，所述tbx2蛋白具有如seq id no:1或5所示的氨基酸序列。

7、在另一优选例中，所述atoh1蛋白具有如seq id no:2或6所示的氨基酸序列。

8、在另一优选例中，所述的听力受损为与耳蜗内毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。

9、在另一优选例中，所述的耳蜗内毛细胞为人或非人哺乳动物的耳蜗内毛细胞。

10、在另一优选例中，所述的耳蜗內毛细胞为myo7a+/fgf8+/vglut3+的内毛细胞。

11、本发明的第二方面，提供了一种可用于再生耳蜗內毛细胞的活性成分组合，包括：

12、(a)tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合；和

13、(b)atoh1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。

14、在另一优选例中，所述tbx2蛋白具有如seq id no:1或5所示的氨基酸序列。

15、在另一优选例中，所述atoh1蛋白具有如seq id no:2或6所示的氨基酸序列。

16、在另一优选例中，所述的耳蜗內毛细胞为myo7a+/fgf8+/vglut3+的内毛细胞。

17、本发明的第三方面，提供了一种表达载体，所述的表达载体包括：

18、(z1)第一表达载体，所述第一表达载体含有用于表达tbx2蛋白的第一表达盒；

19、(z1)第二表达载体，所述第二表达载体含有用于表达atoh1蛋白的第二表达盒；

20、其中，所述的第一表达载体和第二表达载体是同一载体或不同的载体。

21、在另一优选例中，所述的表达载体选自下组：质粒、病毒载体。

22、在另一优选例中，所述病毒载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。

23、在另一优选例中，所述病毒载体为腺相关病毒载体，具体地包括：aav7m8、aav-anc80、或aav-ie。

24、在另一优选例中，所述表达载体含有编码tbx2蛋白和/或atoh1蛋白的核苷酸序列。

25、在另一优选例中，所述编码tbx2蛋白的核苷酸序列如seq id no:3或7所示。

26、在另一优选例中，所述编码atoh1蛋白的核苷酸序列如seq id no:4或8所示。

27、在另一优选例中，所述的第一表达盒从从5’端-3’端具有式i结构：

28、z0-z1-z2    (i)

29、式中，

30、各“-”独立地为化学键或核苷酸连接序列；

31、z0为无、或5’utr序列；

32、z1为编码tbx2蛋白的核苷酸序列；和

33、z2为无、或3’utr序列。

34、在另一优选例中，所述的第二表达盒从从5’端-3’端具有式ii结构：

35、z0’-z1’-z2’   (ii)

36、式中，

37、各“-”独立地为化学键或核苷酸连接序列；

38、z0’为无、或5’utr序列；

39、z1’为编码atoh1蛋白的核苷酸序列；和

40、z2’为无、或3’utr序列。

41、在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。

42、在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。

43、在另一优选例中，所述第一表达载体和第二表达载体是不同的载体，其中，所述第一载体为瞬时表达载体，所述第二表达载体是持续(或稳定)表达载体。

44、本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的表达载体。

45、在另一优选例中，所述宿主细胞为耳蜗支持细胞(sc)。

46、在另一优选例中，所述耳蜗支持细胞选自下组：内侧边缘细胞(ibcs)、内指细胞(iphs)、柱细胞(pcs)、deiters’细胞(dcs)、或其组合。

47、在另一优选例中，所述宿主细胞为内侧边缘细胞(ibcs)和/或内指细胞(iphs)。

48、本发明的第五方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)如本发明第二方面所述的活性成分组合，或本发明第三方面所述的载体，或如本发明第四方面所述的细胞，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

49、在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

50、在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗或预防听力受损，较佳地治疗耳蜗內毛细胞变性和/或损伤。

51、本发明的第六方面，提供了一种如本发明第二方面所述的活性成分组合，如本发明第三方面所述的表达载体，如本发明第四方面所述的宿主细胞，或如本发明第五方面所述的药物制剂在制备用于治疗或预防听力受损的药物中的用途。

52、在另一优选例中，所述的听力受损为与耳蜗内毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。

53、本发明的第七方面，提供了一种再生耳蜗內毛细胞的方法，包括将本发明第二方面所述的活性成分组合，或本发明第三方面所述的表达载体，转导进入耳蜗支持细胞。

54、在另一优选例中，所述耳蜗支持细胞选自下组：内侧边缘细胞(ibcs)、内指细胞(iphs)、柱细胞(pcs)、deiters’细胞(dcs)、或其组合。

55、在另一优选例中，所述耳蜗支持细胞为内侧边缘细胞(ibcs)和/或内指细胞(iphs)。

56、在另一优选例中，所述再生的耳蜗內毛细胞为myo7a+/fgf8+/vglut3+的内毛细胞。

57、在另一优选例中，所述再生的耳蜗內毛细胞与内源性内毛细胞具有相似的电生理特征。

58、本发明的第八方面，提供了一种活性成分的用途，用于制备一制剂或药物，所述的制剂或药物用于：促进未成熟的毛细胞转变成熟的vglut3+内毛细胞；

59、其中，所述的活性成分包括：tbx2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。

60、在另一优选例中，所述tbx2蛋白具有如seq id no:1或5所示的氨基酸序列。

61、在另一优选例中，所述未成熟的毛细胞为myo7a+/fgf8+/vglut3-新生毛细胞。

62、在另一优选例中，所述未成熟的毛细胞为在新生小鼠ibcs/iphs细胞中异位表达atoh1所转化得到的细胞，其具有myo7a+/fgf8+/vglut3-表型。

63、在另一优选例中，所述成熟的vglut3+内毛细胞是指具有内毛细胞功能的内毛细胞。

64、本发明的第九方面，提供了一种治疗或预防听力受损的方法，所述方法包括将本发明第五方面所述的药物制剂施用于有需要的对象。

65、在另一优选例中，所述的听力受损为与耳蜗内毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。

66、在另一优选例中，所述有需要的对象包括人和非人哺乳动物。

67、在另一优选例中，所述有需要的对象患有与耳蜗內毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。

68、在另一优选例中，所述方法包括直接将本发明所述的载体施用至需要的对象的耳部。

69、在另一优选例中，所述方法包括直接将本发明所述的宿主细胞植入需要的对象的耳蜗。

70、在另一优选例中，所述方法可以使得由于耳蜗內毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损的需要对象的耳蜗内毛细胞再生。

71、在另一优选例中，所述方法还包括将用于再生耳蜗外毛细胞的药物制剂施用于有需要的对象。

72、在另一优选例中，所述有需要的对象患有与耳蜗內毛细胞变性和/或损伤以及耳蜗外毛细胞变性和/或损伤相关的听力受损。

73、在另一优选例中，所述用于再生耳蜗外毛细胞的药物制剂中包括以下活性成分组合：

74、(c)ikzf2蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合；和

75、(d)atoh1蛋白、其编码序列、或其促进剂、或其组合。

76、应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。