一种基于MAS技术的玉米育种方法

一种基于mas技术的玉米育种方法
技术领域
1.本技术涉及育种技术领域，尤其是涉及一种基于mas技术的玉米育种方法。


背景技术：

2.玉米的最适生长温度为28℃～32℃，其种子萌发、生长发育及干物质积累对温度十分敏感。玉米播种后，若平均温度下降到8℃以下，持续3～4天可使种子发生粉种、腐烂甚至难以成苗，造成严重减产。玉米萌发期低温冷害是一个全球中高纬度玉米产区的严重问题。我国东北地区低温冷害严重年份，玉米甚至减产20％以上。从1961年到2007年的低温冷害发生频率来看，黑龙江省的低温冷害平均发生率最高，达到38％。选育和创造萌发期耐低温性强的玉米种质是解决低温危害最经济有效的方法。
3.玉米耐低温是由微效多基因控制的复杂数量性状，通过常规方法选育和创造耐低温种质难度较大。随着生物技术的快速发展，国内外学者在玉米耐低温分子设计育种研究上已经开展了一些有益的探索，但目前尚未定位到主效qtl 或关键基因。
4.近年来，借助mas分子标记辅助育种技术加快作物抗逆性状遗传改良进程已取得一定进展，但由于控制作物抗逆性状的基因多数为数量性状遗传，受qtl 定位的多种因素的限制，mas技术尚未在玉米育种实践中广泛应用。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本技术的目的在于提供一种基于mas技术的玉米育种方法，研究以ibm2 2008neighbors为参考图谱，通过元分析的方法，整合了295 个玉米耐低温相关qtl，获得在不同条件均能检测到的效应值较大的“一致性qtl”，评价了玉米耐低温相关qtl效应和位置的关系，为将来在其对应区段开发能够应用于mas技术的分子标记提供有力的帮助，极大的提高了mas的辅助育种效率。
6.meta技术应用于玉米耐低温性状mas的优势在于：受多种因素限制，一次qtl定位难以获得所有目标qtl，qtl表型贡献率可靠性差，研究采用meta，整合前人玉米耐低温相关qtl，为开展mas提供更可靠的分子标记；通常qtl 定位构建的遗传图谱存在标记密度小的问题，用于精细定位的参考价值有限， mas效率较低，研究通过整合前人结果，构建玉米耐低温相关qtl整合图谱，该图谱分子标记丰富，借助meta技术可以获得在不同qtl定位中均能被检测到的mqtl，通过开发与mqtl紧密连锁的分子标记，提高mas效率。
7.本技术实施例提供了一种基于mas技术的玉米育种方法，所述方法包括：
8.将已有的玉米耐低温数量性状位点信息标注到参考图谱，通过meta分析标注后的参考图谱获得玉米耐低温一致性数量性状位点；
9.在预设数量的玉米自交系中选择最强耐低温玉米自交系和最弱耐低温玉米自交系，基于所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系得到玉米萌发期耐低温数量性状位点信息；
10.获取所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温
胁迫处理前后的两份核糖核酸数据，得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的变化数据；
11.基于所述一致性数量性状位点信息和所述玉米萌发期耐低温数量性状位点信息确定玉米萌发期耐低温性状的侯选区域，根据所述变化数据挖掘响应低温显著差异表达候选基因；
12.根据所述候选基因进行玉米育种。
13.可选的，所述将已有的玉米耐低温数量性状位点信息标注到参考图谱，通过meta分析标注后的参考图谱获得玉米耐低温一致性数量性状位点的步骤，包括：
14.获取已有的玉米耐低温数量性状位点信息，其中，所述数量性状位点信息为数量性状位点信息名称、数量性状位点信息染色体、数量性状位点信息lod 值、数量性状位点信息群体类型和数量性状位点信息大小；
15.基于已有的玉米耐低温数量性状位点信息构建数量性状位点信息原始图谱；
16.将所述数量性状位点信息原始图谱和所述参考图谱进行比对，对所述数量性状位点信息原始图谱进行调整；
17.利用齐序函数将原始数量性状位点信息按比例标注到所述参考图谱；
18.通过meta分析标注后的参考图谱获得玉米耐低温一致性数量性状位点。
19.可选的，所述通过meta分析标注后的参考图谱获得玉米耐低温一致性数量性状位点的步骤，包括：
20.通过meta分析标注后的参考图谱确定所述数量性状位点在染色体上的位置；
21.将所述确定位置的所述数量性状位点作为所述一致性数量性状位点。
22.可选的，所述在预设数量的玉米自交系中选择最强耐低温玉米自交系和最弱耐低温玉米自交系的步骤，包括：
23.获取所述预设数量的玉米自交系的实验数据，其中，所述实验数据为所述预设数量的玉米自交系连续至少两年田间和室内耐低温鉴定数据；
24.基于所述耐低温鉴定数据统计出所述预设数量的玉米自交系的生长数据，其中，所述生长数据包括相对出苗指数、相对萌发率和相对萌发指数；
25.基于所述相对出苗指数、所述相对萌发率和所述相对萌发指数确定出最强耐低温玉米自交系和最弱耐低温玉米自交系。
26.可选的，所述基于所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系得到玉米萌发期耐低温数量性状位点信息的步骤，包括：
27.以所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系作为基础数据构建分离群体；
28.通过室内耐低温鉴定筛选所述分离群体的极端子代，得到极端子代数据；
29.通过集群分离分析法对所述极端子代数据进行基因组重测序，得到玉米萌发期耐低温数量性状位点信息。
30.可选的，所述获取所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的两份核糖核酸数据的步骤，包括：
31.获取所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系在萌发期低温胁迫处理前的初始核糖核酸数据；
32.对所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系进行萌发期低温胁迫处理，得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系进行萌发期低温胁迫处理后的目标核糖核酸数据。
33.可选的，所述得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的变化数据的步骤，包括：
34.将所述初始核糖核酸数据和所述目标核糖核酸数据进行对比，得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的差异表达核糖核酸数据和显著富集代谢途径数据；
35.将所述差异表达核糖核酸数据和所述显著富集代谢途径数据作为所述变化数据。
36.可选的，所述基于所述一致性数量性状位点信息和所述玉米萌发期耐低温数量性状位点信息确定玉米萌发期耐低温性状的侯选区域，根据所述变化数据挖掘响应低温显著差异表达候选基因的步骤，包括：
37.比对筛选位于所述一致性数量性状位点信息和所述玉米萌发期耐低温数量性状位点信息的转录组显著差异表达基因；
38.将所述转录组显著差异表达基因作为响应低温显著差异表达候选基因。
39.可选的，在所述根据所述候选基因进行玉米育种的步骤之前，还包括：
40.对所述响应低温显著差异表达候选基因进行验证。
41.可选的，所述参考图谱为玉米ibm 2 2008neighbors参考图谱。
42.为使本技术的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
43.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
44.图1示出了本技术实施例所提供的一种基于mas技术的玉米育种方法的流程图；
45.图2示出了本技术实施例所提供的基于mas技术的玉米育种方法的技术路线图；
46.图3示出了本技术实施例所提供的基于mas技术的玉米育种方法中重测序实验流程图；
47.图4示出了本技术实施例所提供的基于mas技术的玉米育种方法中mapk 级联信号系统示意图。
具体实施方式
48.为使本技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本技术实施例中附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本技术实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本技术的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本技术的范围，而是仅仅表示本技术的选定实
施例。基于本技术的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的每个其他实施例，都属于本技术保护的范围。
49.首先，对本技术可适用的应用场景进行介绍。本技术可应用于玉米育种、培育场景。
50.经研究发现，由于控制作物抗逆性状的基因多数为数量性状遗传，受qtl 定位的多种因素的限制，mas技术尚未在玉米育种实践中广泛应用。
51.基于此，本技术实施例提供了一种基于mas技术的玉米育种方法，以以 ibm2 2008neighbors为参考图谱，通过元分析的方法，整合了295个玉米耐低温相关qtl，获得在不同条件均能检测到的效应值较大的“一致性qtl”，评价了玉米耐低温相关qtl效应和位置的关系，为将来在其对应区段开发能够应用于mas技术的分子标记提供有力的帮助，极大的提高了mas的辅助育种效率。
52.meta技术应用于玉米耐低温性状mas的优势在于：受多种因素限制，一次qtl定位难以获得所有目标qtl，qtl表型贡献率可靠性差，研究采用meta，整合前人玉米耐低温相关qtl，为开展mas提供更可靠的分子标记；通常qtl 定位构建的遗传图谱存在标记密度小的问题，用于精细定位的参考价值有限， mas效率较低，研究通过整合前人结果，构建玉米耐低温相关qtl整合图谱，该图谱分子标记丰富，借助meta技术可以获得在不同qtl定位中均能被检测到的mqtl，通过开发与mqtl紧密连锁的分子标记，提高mas效率。
53.如图1中所示，本技术实施例提供的基于mas技术的玉米育种方法，所述方法包括：
54.s101、将已有的玉米耐低温数量性状位点信息标注到参考图谱，通过meta 分析标注后的参考图谱获得玉米耐低温一致性数量性状位点；
55.s102、在预设数量的玉米自交系中选择最强耐低温玉米自交系和最弱耐低温玉米自交系，基于所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系得到玉米萌发期耐低温数量性状位点信息；
56.s103、获取所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的两份核糖核酸数据，得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的变化数据；
57.s104、基于所述一致性数量性状位点信息和所述玉米萌发期耐低温数量性状位点信息确定玉米萌发期耐低温性状的侯选区域，根据所述变化数据挖掘响应低温显著差异表达候选基因；
58.s105、根据所述候选基因进行玉米育种。
59.示例性的，所述方法包括：玉米耐低温相关qtl的meta分析；玉米萌发期耐低温性鉴定；玉米低温抗性的bsa重测序分析；萌发期玉米响应低温胁迫的转录组分析；玉米萌发期响应低温相关候选基因的挖掘与验证。
60.示例性的，如图2所示，以玉米ibm2 2008neighbors为参考图谱，运行 biomercator2.1软件，将搜集的295个玉米低温性状相关qtl进行meta分析，获得玉米耐低温一致性qtl。对296份国内外优良玉米自交系连续进行多年田间和室内耐低温鉴定，统计相对出苗指数、相对萌发率和相对萌发指数等，筛选田间与室内低温胁迫条件下表现稳定的极端材料。以筛选出的强耐低温玉米自交系r144，即，最强耐低温玉米自交系和极弱耐低温玉米自交系s319，即，最弱耐低温玉米自交系为亲本构建分离群体，室内耐低温鉴定筛选
positionfrom to载入到各自的原始图谱中，应用映射功能将原始qtl映射到ibm 2 2008 neighbors上；映射后的qtl覆盖了整个基因组，而且可以看到有很多qtl密集区域且彼此之间有区间的重叠。舍弃区间与参考图谱无公共标记而无法映射的 qtl，最终有204个qtl映射成功。染色体左侧垂直线为qtl置信区间，水平线为lod值。
78.玉米耐低温相关qtl的映射：
79.映射是指利用齐序函数将原始qtl的位置及两端标记按比例标注到参考图谱。利用biomercator2.1软件的映射功能将搜集到的玉米耐低温相关qtl映射到 ibm 2 2008neighbors上：
①
载入原始图谱与ibm 2 2008neighbors参考图谱上相关标记；
②
录入每个原始图谱qtl的详细信息；
③
应用biomercator2.1软件映射功能将原始图谱的qtl映射到ibm 2 2008neighbors上。单标记qtl需要通过公式计算其95％置信区间，并将其位置进行标注。玉米耐低温是复杂的数量性状，存在多基因调控现象，且易受环境影响。前人研究中由于采用作图群体和统计方法等的不同，所定位到的玉米耐低温相关qtl分散于10条染色体上。本研究在做元分析时，同样出现了耐低温相关qtl广泛分布于10条染色体的现象，此外，耐低温相关qtl还具有成簇分布的特点。研究结果验证了玉米中qtl富集现象，原因很可能是一因多效，其结果为获得玉米抗逆基因富集区域提供了一定的参考，对今后开展mas实践具有指导意义。
80.玉米耐低温qtl的meta分析：
81.biomercator2.1软件的meta分析可以计算出5个模型，一般认定aic值最小的模型为“一致性qtl”(mqtl)。利用软件meta分析功能进行分析，得到 47个玉米耐低温相关的mqtl及其区间标记，mqtl的95％置信区间大小为0.04 cm-102.73cm，原始qtl数目为3-14，平均遗传贡献率为3.32％-14.32％。
82.每个qtl模型都是通过高斯定理计算出其在染色体上的最可能位置，计算公式如下：
83.var(qtl)＝1/∑1/σi284.σi2为qtl位置方差，mqtl95％置信区间计算公式如下：
85.c.i.＝3.92
×
var(qtl)
1/2
86.获得的mqtl为不同遗传背景下多个试验结果的整合，可用平均r2来评价 mqtl的r2。
87.在一种可能的实施方式中，所述在预设数量的玉米自交系中选择最强耐低温玉米自交系和最弱耐低温玉米自交系的步骤，包括：
88.获取所述预设数量的玉米自交系的实验数据，其中，所述实验数据为所述预设数量的玉米自交系连续至少两年田间和室内耐低温鉴定数据；
89.基于所述耐低温鉴定数据统计出所述预设数量的玉米自交系的生长数据，其中，所述生长数据包括相对出苗指数、相对萌发率和相对萌发指数；
90.基于所述相对出苗指数、所述相对萌发率和所述相对萌发指数确定出最强耐低温玉米自交系和最弱耐低温玉米自交系。
91.示例性的，于试验地进行田间玉米耐低温鉴定，土壤为中性黑钙土，前茬为玉米田，结合秋整地施磷酸二铵150kg/hm2，氯化钾50kg/hm2。田间玉米出苗期耐低温性鉴定试验共分2期播种。第一期为5-10cm地温稳定通过5℃时进行低温播种，第二期为地温稳定通
过10℃时进行适温播种，两次播种后均及时喷灌。试验采取随机区组设计，每区2行，行长5m，行距65cm，单粒播种，株距20cm，每个处理3次重复。
92.试验期间每日定时采集试验田附近气象观察点数据，记载地温、田间最高温度、最低温度及日平均温度。出苗后每日定时登记出苗数，待材料出苗停止后，统计材料田间出苗率，并计算相对出苗率和相对出苗指数。
93.挑选大小一致的玉米种子用0.5％naclo溶液浸泡5min，然后用自来水冲洗种子3次，将种子置于上下铺有滤纸的培养皿内，保持滤纸湿透但不致有水流出。人工气候箱5℃/4d萌发培养，然后转置25℃人工气候箱培养3d后统计萌发率，并计算相对萌发率和相对萌发指数，注意观察保证水分充足，保持温度稳定。试验设置3次重复，每个重复100粒，对照为25℃人工气候箱培养7d。
94.出苗率(％)＝(出苗种子数/供试种子数)
×
100
95.相对出苗率(％)＝(低温处理出苗率/适温播种出苗率)
×
100
96.出苗指数＝∑gt/dtgt：t日出苗数，dt：相应出苗日数
97.相对出苗指数(％)＝(低温处理出苗指数/适温播种出苗指数)
×
100。
98.296份玉米自交系适温播种平均出苗率为86.87％，低温播种平均出苗率为 62.48％，低温胁迫造成平均出苗率下降。根据相对出苗率将296份玉米自交系分为5级，分别为强耐低温玉米自交系(相对出苗率86％以上)、中耐低温玉米自交系(相对出苗率70～85％)、中弱耐低温玉米自交系(相对出苗率55～69％)、弱耐低温玉米自交系(相对出苗率36～54％)和极弱耐低温玉米自交系(相对出苗率0～35％)。鉴定出r144、lx71、lx111、lx107等25份材料相对出苗率在86％以上，为强耐低温玉米自交系；lx35、lx1、lx27、s319相对出苗率为0～35％，是极弱耐低温玉米自交系。筛选连续两年以上田间相对出苗指数前25％且高于 85％的玉米自交系，获得不同年际间相对出苗指数稳定，耐低温一致性较好，田间耐低温能力强的玉米自交系26份，包括lx207、lx16、r144、lx131等。
99.由于田间鉴定试验试验条件的不可重复性，田间鉴定结果存在年际间的差异，结合田间相对出苗率和田间相对出苗指数进行综合筛选，可大大降低不可控因素影响。研究经田间相对出苗率和田间相对出苗指数两个指标鉴定，获得 lx131、r144、lx116、lx208等田间强耐低温玉米自交系16份，lx35、s319、 lh27等极弱耐低温玉米自交系6份。
100.在一种可能的实施方式中，所述基于所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系得到玉米萌发期耐低温数量性状位点信息的步骤，包括：
101.以所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系作为基础数据构建分离群体；
102.通过室内耐低温鉴定筛选所述分离群体的极端子代，得到极端子代数据；
103.通过集群分离分析法对所述极端子代数据进行基因组重测序，得到玉米萌发期耐低温数量性状位点信息。
104.示例性的，296份玉米自交系三年室内平均相对萌发率分别为83.45％、 86.73％和85.46％，三年间室内平均相对萌发率基本相当。根据室内平均相对萌发率将296份玉米自交系分为5级，分别为强耐低温玉米自交系(相对萌发率 86％以上)、中耐低温玉米自交系(相对萌发率70～85％)、中弱耐低温玉米自交系(相对萌发率55～69％)、弱耐低温玉米自交系(相对萌发率36～54％)和极弱耐低温玉米自交系(相对萌发率0～35％)。鉴定出相
对萌发率在86％以上的强耐低温玉米自交系119份，相对萌发率0～35％的极弱耐低温玉米自交系24份。筛选连续两年以上室内相对萌发指数前25％且高于85％的玉米自交系，获得不同年际间相对萌发指数稳定，耐低温一致性较好，室内耐低温能力强的玉米自交系8份，包括lx163、lx101、lx131、r144等，室内极弱耐低温玉米自交系8 份，分别是lx100、lx39、s319、lx87等。
105.对田间出苗期和室内萌发期耐低温性状间相关性进行分析，其中，2017年室内相对萌发率与2018年室内相对萌发率、2019年室内相对萌发率、田间相对出苗率呈显著相关，相关系数分别为0.53，0.61和0.32；2018年室内相对萌发率与2019年室内相对萌发率和田间相对出苗率呈显著相关，相关系数分别为 0.59和0.25；2019年室内相对萌发率与田间相对出苗率呈显著相关，相关系数为0.16。田间相对出苗率与2017年和2018年田间相对出苗指数显著相关，相关系数分别为0.62和0.54。在显著相关的指标中，田间相对出苗率与2017年田间相对出苗指数的相关系数最大(0.62)；2019年室内相对萌发率与田间相对出苗率的相关系数最小(0.16)。
106.综合田间和室内耐低温鉴定结果发现，不同玉米自交系的耐低温性在田间和室内表现不一致，存在个别玉米自交系在室内表现为强耐低温，但在田间却表现为中耐低温现象，分析原因主要是室内耐低温试验胁迫条件可控，检测指标主要为玉米自交系在低温胁迫条件下的萌发能力，而田间耐低温试验涉及的影响因素较多，比如土层含水量、播种深度、镇压强度以及种子拱土能力等。研究综合田间及室内耐低温试验结果，筛选出r144、lx85、xzd270、lx174等低温处理时表现稳定的强耐低温玉米自交系10份，lh27、s319、lx120、lx83 极弱耐低温玉米自交系4份。
107.示例性的，室内玉米萌发期耐低温性鉴定及极端表型个体的筛选：
108.将收获的f2单株果穗种子用于玉米低温抗性的室内鉴定，统计f2单株果穗种子室内低温胁迫条件的萌发率，根据萌发率结果确定f2群体中极端表型个体。
109.示例性的，如图3所示，采用改良ctab法分别提取亲本强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319及构建的f2群体中极端表型个体及的幼叶基因组dna，检测dna的浓度和纯度，合格的极端表型个体dna进行等量混合分别用于构建子代抗感dna混池。
110.随机打断待测序dna至片段大小约350bp，修饰片段末端，构建测序文库， illumina hiseq上机重测序。
111.具体的，包括：
112.数据质控。过滤原始数据，从碱基测序质量分布和碱基类型分布等方面进行质量评估，评估合格后对原始数据进行进行过滤，去除带接头的以及低质量的序列，从而获得无冗余的序列。
113.比对参考基因组。将无冗余序列定位到玉米参考基因组(b73refgen-v4) 上，应用bwa软件进行比对，定位无冗余序列在b73 refgen-v4上的位置。
114.检测与注释snp和small indel。使用gatk软件检测snp和small indel，根据无冗余序列在b73 refgen-v4的定位结果，采用picard去重复、运用gatk重比对，检测、过滤snp和small indel。snpeff软件注释和预测获得的snp和smallindel，根据snp和small indel在b73 refgen-v4上的位置信息，定位snp和smallindel所在区域，分析snp和small indel变异是否产生同义突变。
115.snp和small indel的关联分析。过滤低质量的snp和small indel，采用欧式距离(ed)法计算ed值，运用distance方法拟合ed值，选取拟合值的median+3sd 作为分析的关联阈值用以判定关联区域。采用snp-index和indel-index法筛选混池间基因型频率显著差异标记，采用distance方法拟合δsnp-index和δindel-index，选择关联阈值以上的区域作为与玉米萌发期耐低温性状相关的关联区域。综合ed算法、snp-index和indel-index方法得到的关联区域结果取交集确定为玉米萌发期耐低温性状相关候选区域。
116.snp和indel功能注释。筛选玉米萌发期耐低温性状相关候选区域内的非同义突变和移码突变基因，应用blast软件进行nr、go、kegg、cog等数据库的注释。
117.在一种可能的实施方式中，所述获取所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的两份核糖核酸数据的步骤，包括：
118.获取所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系在萌发期低温胁迫处理前的初始核糖核酸数据；
119.对所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系进行萌发期低温胁迫处理，得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系进行萌发期低温胁迫处理后的目标核糖核酸数据。
120.在一种可能的实施方式中，所述得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的变化数据的步骤，包括：
121.将所述初始核糖核酸数据和所述目标核糖核酸数据进行对比，得到所述最强耐低温玉米自交系和所述最弱耐低温玉米自交系经过萌发期低温胁迫处理前后的差异表达核糖核酸数据和显著富集代谢途径数据；
122.将所述差异表达核糖核酸数据和所述显著富集代谢途径数据作为所述变化数据。
123.在一种可能的实施方式中，所述基于所述一致性数量性状位点信息和所述玉米萌发期耐低温数量性状位点信息确定玉米萌发期耐低温性状的侯选区域，根据所述变化数据挖掘响应低温显著差异表达候选基因的步骤，包括：
124.比对筛选位于所述一致性数量性状位点信息和所述玉米萌发期耐低温数量性状位点信息的转录组显著差异表达基因；
125.将所述转录组显著差异表达基因作为响应低温显著差异表达候选基因。
126.示例性的，提取和纯化玉米总rna，按照takara的reverse transcriptasem-mlv(rnase h-)反转录试剂盒操作步骤将rna反转录成cdna。
127.随机选取4条degs进行qpcr验证转录组测序结果。利用beacon designer 软件设计qrt-pcr引物。以玉米actin1为内参基因，反应条件为95℃30sec；95℃ 5sec，60℃30sec，40cycles。2-δδct法计算基因相对表达量，应用spss statisticsv23.0软件进行方差及显著性分析。
128.具体的，差异表达基因的go功能富集分析：
129.采用clusterprofiler软件对degs进行go功能富集分析，结果显示强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319低温胁迫处理12h时有1770个 degs注释到功能，其中分别有792个、690个和288个degs注释到bp功能、 cc功能和mf功能；强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319 低温胁迫处理24h时有1397个degs注释到功能，其中分别有681个、242个和474个degs注释到bp、cc功能和mf功能。
130.根据注释到的go功能的显著程度，我们对显著富集(p-value≤0.01， padj≤0.01)的go条目进行了筛选，结果共获得27个显著富集的go注释分类，其中生物过程功能5个、细胞组分功能10个、分子功能12个。耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319低温胁迫处理不同时间有10个共同显著富集的go注释分类，分别为生物过程功能的多肽代谢过程(go:0006518)、转化过程(go:0006412)、多肽生物合成过程(go:0043043)、细胞酰胺代谢过程(go:0043603)、酰胺生物合成(go:0043604)；细胞组成的核糖体 (go:0005840)、细胞内核糖核蛋白复合物(go:0030529)、核糖核蛋白复合物 (go:1990904)；以及分子功能的核糖体的结构组成(go:0003735)、结构分子活性(go:0005198)。细胞组成功能的无膜细胞器(go:0043228)、细胞内无膜细胞器(go:0043232)、蛋白酶体核心复合体(go:0005839)、蛋白酶体复合体 (go:0000502)、内肽酶复合物(go:1905369)、肽酶复合物(go:1905368)、蛋白酶体核心复合体，阿尔法亚单位复合体(go:0019773)7个go注释分类只在低温胁迫处理12h中显著富集，而属于分子功能的12个go注释分类中仅有2 个分类在不同胁迫处理时间中共同显著富集，这说明强耐低温玉米自交系r144 和极弱耐低温玉米自交系s319在遭受低温胁迫不同时间响应的degs其功能分类上存在一定的差异。
131.差异表达基因的kegg功能富集分析，如图4所示：
132.为明确强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319在响应低温胁迫时degs所参与的代谢途径，研究对r144和s319响应低温胁迫的degs 进行kegg注释，筛选出植物mapk信号通路、植物昼夜节律、植物激素信号转导等5条kegg通路显著富集。结果显示强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319在低温胁迫时，适应环境通路、信号转导途径等都受到了显著影响。说明植物在感受外界逆境胁迫时，会启动相应的代谢途径响应逆境，而不同材料间的抗性差异可能来源于其所参与的代谢途径的不同，及参与该途径基因的数量或表达量的差异。
133.植物通常通过植物信号转导通路激发相关基因表达和蛋白合成，促使植物启动适应逆境环境或增强植物抗逆能力的积极响应。本研究低温胁迫处理时，强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319中多个degs显著富集到与信号转导相关的途径中，其中注释到植物mapk信号通路的degs有68个，注释到植物激素信号转导通路的degs有106个。
134.促分裂原活化蛋白激酶(mapk)信号通路在植物高度保守，作用是将受体细胞膜表面感知的信号放大并传递到细胞内，激发胞内转录及代谢水平的变化。低温胁迫处理12h和24h时，强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319共有18和32个显著degs注释到植物mapk信号通路。低温胁迫处理时，注释到mapk signaling pathway-plant通路的所有degs中，多数的degs为强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319共差异表达，且共差异表达的degs在强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319中的变化趋势基本一致；强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319 中特异degs中，loc103651289、loc103647946和loc100285223三个基因表达量变化最为显著，分别编码map3k、乙烯不敏感蛋白3和蛋白磷酸酶。
135.植物激素是植物自身代谢产生的一类微量有机物质，在植物遭受逆境胁迫适应性中起到了非常重要的作用。低温胁迫处理12h和24h时，强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319共有25和41个显著degs注释到植物激素信号转导(plant hormone signal transduction)通路。低温胁迫处理时，极弱耐低温玉米自交系s319相对于强耐低
温玉米自交系r144有较多的degs参与植物激素信号转导通路，且极弱耐低温玉米自交系s319中参与该通路的degs 响应低温胁迫的速度要比强耐低温玉米自交系r144中相关基因响应速度要更快，也就是在低温胁迫12h时，s319中就有较多的degs参与植物激素信号转导通路调控，其中，pyl5和loc103647946两个基因表达量的变化最为显著。
136.在一种可能的实施方式中，在所述根据所述候选基因进行玉米育种的步骤之前，还包括：
137.对所述响应低温显著差异表达候选基因进行验证。
138.示例性的，运用hisat2软件将无冗余序列与b73refgen-v4进行比对，结果 18个样品成功比对到b73 refgen-v4的比例均在85％以上，说明测序数据与b73 refgen-v4一致，相关实验不存在污染，测序数据可应用于下步数据分析。
139.qrt-pcr验证rna-seq结果：
140.随机选择强耐低温玉米自交系r144和极弱耐低温玉米自交系s319响应低温差异表达基因进行qrt-pcr验证(loc100273598、loc103651289、 loc103645931、loc103652527，内参为玉米ubi基因)。结果4条基因表达水平的变化趋势与rna-seq结果基本一致，则验证了rna-seq的准确性。
141.示例性的，根据meta分析获得的玉米耐低温相关“一致性qtl”，结合bsa 重测序获得的与玉米萌发期耐低温性状相关侯选区域，以及转录组测序筛选的显著差异表达基因，比对筛选位于meta分析“一致性qtl”和bsa重测序获得的耐低温相关侯选区域内的转录组显著差异表达基因，并将其确定为玉米萌发期响应低温相关候选基因。
142.在一种可能的实施方式中，所述参考图谱为玉米ibm 2 2008neighbors参考图谱。ibm2 2008neighbors是以b73
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mo17的分离群体为基础的公共图谱，其中亲本玉米自交系b73已完成全基因组测序并用于构建物理图谱，具有高重组率和分辨率，是检测微效qtl的优良群体。图谱图长8054.28cm，包含各类标记 15991个，与已完成或正在绘制的qtl定位图谱间具有较多共有标记，能够提高 mqtl的准确性。
143.通过所述基于mas技术的玉米育种方法，获得47个玉米耐低温相关“一致性qtl”，置信区间大小为0.04cm-102.73cm，原始qtl数目为3-14，平均遗传贡献率为3.32％-14.32％。筛选出r144、lx85、xzd270、lx174等强耐低温玉米自交系10份，lh27、s319、lx120、lx83极弱耐低温玉米自交系4份。重测序获得221.72gbp数据，平均测序深度25.96x，定位4个玉米萌发期耐低温性状相关侯选区间，总长度25.71mb，注释基因1513个，其中非同义突变基因456 个，移码突变基因111个。低温处理12h时，r144和s319间各有1741个和1165 个特异degs；低温处理24h时，r144和s319间各有2109个和1808个特异degs； go分析获得27个显著富集注释分类；kegg分析发现植物mapk信号通路、植物昼夜节律、植物激素信号转导通路等5个代谢途径在两个自交系中均呈现显著富集。在meta分析和bsa-seq获得的玉米萌发期耐低温性状相关侯选区域内挖掘到2个响应低温显著差异表达候选基因，mapkkk 17和map3k a-like基因，对2个候选基因进行qrt-pcr验证，证明低温处理后候选基因的表达模式在极端材料r144和s319间存在极显著差异。
144.最后应说明的是：以上所述实施例，仅为本技术的具体实施方式，用以说明本技术的技术方案，而非对其限制，本技术的保护范围并不局限于此，尽管参照前述实施例对本技术进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：任何熟悉本技术领域的技术人员
在本技术揭露的技术范围内，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改或可轻易想到变化，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改、变化或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本技术实施例技术方案的精神和范围，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以权利要求的保护范围为准。