硫化铁纳米酶抗人乳头瘤病毒的用途的制作方法

1.本发明涉及人乳头瘤病毒感染类疾病防治领域，具体涉及一种利用硫化铁纳米酶预防 或治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的用途。


背景技术：

2.宫颈癌已经成为全球十大恶性肿瘤之一，且发病群体日趋年轻化。
3.2007年，我国科学家发现了fe3o4磁性纳米粒子具有类过氧化物酶活性，并从酶学角度系 统研究了纳米材料的酶学特性，这类纳米材料模拟酶随后被定义为纳米酶(nanozyme)。在抗 菌方面，基于纳米酶的类过氧化物酶、氧化酶等不同类酶活性，其可清除细菌生物膜，进而 发挥抗菌活性。2020年，扬州大学硕士学位论文《铁/碳复合材料的制备及其抑菌性能研究》 公开了fe7s8纳米片的制备方法，并研究了其抗菌性能及抗菌机理。在病毒检测方面，纳米酶 已应用于呼吸道合包病毒(rsv)、人类免疫缺陷病毒(hiv)、新型冠状病毒(covid-19)等 的检测。在抗病毒方面，有研究发现了银纳米颗粒、氧化铁纳米颗粒等具有抗hiv、hsv、hcv、 h1n1等的活性，并揭示了纳米酶抗流感病毒的作用机制，即：铁基纳米酶于流感病毒颗粒接 触后，通过酶促反应催化病毒囊膜发生脂质过氧化，氧化产物进一步瓦解血凝素蛋白和神经 氨酸酶蛋白，导致流感病毒结构和功能被破坏，使病毒丧失入侵和复制能力。
4.人乳头瘤病毒(human papilloma virus，hpv)属乳头多瘤空泡病毒科(papovaviridae)。 hpv是一种dna病毒，外层无囊膜，侵入宿主细胞后其dna分子可与宿主细胞染色体整合，从而 使宿主细胞的某些基因功能失活，可引起人类皮肤黏膜增生性病变，是女性下生殖道感染、 宫颈癌及癌前病变的重要“元凶”。hpv共有100多个亚型，直接的皮肤-皮肤接触是hpv最常 见的传播途径。根据引起宫颈癌的可能性，2012年国际癌症研究机构(iarc)将与生殖道感 染有关的40多个hpv亚型分为高危型、疑似高危型和低危型。高危型、疑似高危型hpv与宫颈 癌及高级别外阴、阴道、宫颈鳞状上皮内病变(sil)等相关，低危型hpv与生殖器疣及低级 别外阴、阴道、宫颈sil等相关。常见的高危型hpv包括hpv-16、hpv-18、hpv-31和hpv-33等 10多个亚型，而hpv-16和hpv-18可导致约70％的宫颈癌病例。常见的低危型hpv包括：hpv-6、 hpv-11、hpv-40、hpv-42等。作为一种无囊膜双链环状dna病毒，hpv免疫原性较低，容易形 成持续感染，且感染仅停留于局部皮肤和粘膜中，不进入血液循环产生病毒血症。而且，对 于hpv感染类疾病(生殖器疣、鳞状上皮内病变、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌或外阴癌等)，现 有治疗手段(激光、微波、冷冻、免疫治疗等)的疗效不尽人意，疫苗几乎目前是对抗hpv 感染的唯一防控手段。但是，因生产工艺复杂及生产周期长等的制约，hpv疫苗长期以来存在 相当严重的患者可及性问题。
5.因此，开发直接杀灭或抑制hpv的药物对于hpv感染类疾病患者意义重大，也成为相关药 物研发领域技术人员的迫切追求。


技术实现要素：

6.经过多年研究，发明人在金属纳米材料抗病毒领域获得了重大突破，即：发明人利用 科学的对照研究方法证实，硫化铁纳米酶对人乳头瘤病毒具有明显的杀灭作用。据此，本 发明提供了一种利用硫化铁纳米酶预防或治疗人乳头瘤病毒感染类疾病的方法。
7.具体地，本发明提供了一种硫化铁纳米酶在制备抗人乳头瘤病毒感染类疾病药物中的 用途。
8.优选地，本发明提供了一种硫化铁纳米酶在制备预防或治疗人乳头瘤病毒感染类疾病 药物中的用途。
9.优选地，本发明提供了一种硫化铁纳米酶在制备预防或治疗女性下生殖道人乳头瘤病 毒感染药物中的用途。
10.其中，所述的人乳头瘤病毒感染类疾病包括：生殖器疣(如尖锐湿疣)、鳞状上皮内病 变、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌、外阴癌或其他基于人乳头瘤病毒感染所致的妇科癌前病变 等疾病。
11.其中，所述的硫化铁纳米酶的可以利用常规的制剂手段将fe7s8纳米酶制备成口服剂、 注射剂或外用制剂等，通过口服、注射、涂抹、冲洗等常规途径给予需要的人群，优选栓 剂、凝胶剂、泡沫剂、冲洗剂等制剂。例如，将fe7s8纳米酶粉末加入适量纯化水中，加入 制剂辅料，混匀，分装，即可制备成特定浓度(如0.1mg/g、0.25mg/g、0.5mg/g、1.0mg/g 或2.0mg/g)的fe7s8纳米酶凝胶剂。
12.其中，所述的人乳头瘤病毒为高危型hpv、疑似高危型hpv或低危型hpv，所述的高危 型人乳头瘤病毒优选hpv-16、hpv-18或hpv-33，所述的低危型人乳头瘤病毒优选hpv-6。
13.其中，所述的硫化铁纳米酶优选fe7s8纳米酶或fe3s4纳米酶。
14.其中，所述的抗人乳头瘤病毒感染类疾病药物的给药剂量可以为1-500mg/日，优选 5-100mg/日，更优选10-50mg/日，或根据人乳头瘤病毒感染类疾病的种类、严重程度等因 素确定。
15.另外，本发明提供了一种利用水(溶剂)热反应法制备硫化铁纳米酶的方法，包括利 用含铁化合物、硫化物在弱碱性条件下制备所述硫化铁纳米酶的方法。当然，本发明所述 的硫化铁纳米酶也可以采用其他任何已知的方法进行制备，例如：共沉淀法、微乳液法、 微波辐射法等。
16.基于上述技术方案，本发明取得了如下有益效果：
17.(1)本发明通过科学实验证实，浓度为0.1-2.0mg/ml的fe7s8纳米酶溶液对高危型人 乳头瘤病毒hpv-16、hpv-18、hpv-33及低危型人乳头瘤病毒hpv-6均具有确定的灭活作 用；而且，0.5mg/ml以上的fe7s8纳米酶溶液对上述人乳头瘤病毒亚型的灭活率均高达99％ 以上。
18.(2)本发明首次提出并证实了硫化铁纳米酶，特别是fe7s8纳米酶在抗人乳头瘤病毒感 染类疾病中的用途，为人类预防和治疗人乳头瘤病毒感染类疾病，特别是预防和治疗生殖 器疣、鳞状上皮内病变、宫颈上皮内瘤变、宫颈癌、外阴癌或其他妇科癌前病变提供了一 条有效的实现途径。
附图说明
19.图1：八硫化七铁纳米酶透射电镜图；
20.图2：八硫化七铁纳米酶xrd图。
具体实施方式
21.本发明的具体实施方式仅为举例说明本发明可行的实施方案而提供，不应解释为对本 发明的任何限制。本发明实施例涉及的原辅材料、试剂、仪器设备等均为市购。
22.实施例1 fe7s8纳米酶的制备方法
23.(1)称取六水合三氯化铁8.2克(0.03mol)，放入500ml烧杯中，加入400ml乙二醇， 室温搅拌直至三氯化铁完全溶解，标记为a溶液；
24.(2)称取无水乙酸钠24.6克(0.30mol)，加入a溶液中，搅拌直至完全溶解，标记 为b溶液；将b溶液冰浴冷却、超声30min；
25.(3)称取二烯丙基二硫醚10.0克(0.058mol)，加入b溶液中，标记为c溶液；
26.(4)将c溶液倒入500ml的水热釜内，于220℃反应12小时；
27.(5)反应结束后，自然冷却，弃去上清液，剩余料液倒入离心管内，离心分离；
28.(6)依次用水和无水乙醇各洗涤3次，离心分离；
29.(7)将所得湿品置于60℃鼓风干燥箱中，烘干得fe7s8纳米酶粉末2.78克，摩尔收率 99.0％(以三氯化铁计)，其透射电镜图、xrd图分别如附图1、2所示。
30.实施例2 fe7s8纳米酶抗hpv病毒实验
31.1、纳米酶抗hpv病毒实验方法
32.(1)称取实施例1制备的fe7s8纳米酶粉末，加入水中，震荡混匀，制成以下浓度的2 倍浓度纳米酶溶液：0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml。
33.(2)将vero-e6细胞在37℃温水中迅速融化，转种于含有10ml dmem培养基的培养瓶 中。逐日观察细胞生长情况，在细胞长满单层时，用dmem培养基稀释成约4
×
105～8
×
105个/ml浓度的细胞悬液。
34.(3)将hpv病毒(hpv-16、hpv-18、hpv-6、hpv-33)分别接种于含10ml细胞悬液的 细胞瓶内，置37℃培养并观察，待3/4细胞出现病变时，在冰浴条件下，用超声波(或反 复冻融)破碎细胞，以6000r/min离心15min，取上清液即为病毒悬液。
35.(4)取纳米酶溶液与病毒悬液按照1:1比例混匀，作用2h后的混合液为试验品反应 液。同步操作中用无菌去离子水代替纳米酶溶液，制成对照品反应液。
36.(5)取步骤(4)的反应液，分别用无菌滤芯过滤后加入适量中和剂(1.0％吐温80+0.1％ 卵磷脂+0.5％硫代硫酸钠)，然后用dmem培养基做1:10系列稀释。取各稀释液100μl 分别加入含100μl细胞悬液的96孔培养板内，置37℃，5％co2培养箱培养，逐日观察； 第4天，在各反应孔内补加50μl新鲜dmem培养基；第7天，逐孔观察并记录细胞病变 情况。
37.(6)进行病毒滴度测定，计算灭活对数值和灭活率。
38.2、病毒滴度测定和灭活率计算
39.(1)终点稀释法
40.tcid
50
对数值＝病变率高于50％组稀释度的对数值+距离比例
41.其中，tcid
50
指半数细胞感染剂量。病变率高于50％组指病变率超过50％的最低
组，下 简称“高于50％组”；病变率低于50％组是指病变率低于50％的最高组，下简称“低于50％ 组”。
42.距离比例＝(高于50％组的病变率-50)/(高于50％组的病变率-低于50％组的病变率)
43.(2)平均灭活对数值计算：设阳性对照组平均tcid
50
值为n0，试验组平均tcid
50
值为 nx。
44.平均灭活对数值＝log no－log nx
45.(3)灭活率计算
46.hpv病毒灭活率＝(n
0-nx)/n0×
100％
47.3、纳米酶抗hpv病毒实验结果
48.经计算可知，试验组各浓度的fe7s8纳米酶溶液对hpv-16均具有确定的灭活作用， 0.5mg/ml以上的fe7s8纳米酶溶液对hpv-16的灭活率均高达99％以上，具体实验结果请见下 表1。
49.表1 fe7s8纳米酶抗hpv-16活性
[0050][0051]
对于hpv-18、hpv-6和hpv-33，试验组各浓度的fe7s8纳米酶溶液也均具有确定的灭活作 用，0.5mg/ml以上的fe7s8纳米酶溶液对hpv-18、hpv-6和hpv-33的灭活率同样高达99％以 上，实验结果简略总结如下表2。
[0052]
表2 fe7s8纳米酶抗hpv-18、hpv-6、hpv-33活性
[0053]