喹唑啉衍生物在制备防治砷致肝损伤药物中的用途

1.本发明属于药物技术领域，尤其涉及喹唑啉衍生物在制备防治砷致肝损伤药物中的用途。


背景技术：

2.砷(as)作为一种自然存在的环境毒物和致癌物，很容易通过食物、水和职业污染进入人类和动物体内，导致多器官系统损害。目前，全世界有超过2亿人口面临饮水中砷含量超标的问题，导致大量砷中毒现象，尤其以落后的发展中国家为主要发生地。在我国贵州和陕西两省，还存在较多的燃煤污染型地方性砷中毒现象。
3.肝脏作为砷的主要代谢和解毒器官，在其代谢过程中可高浓度潴留，从而导致肝脏病变，如肝功能异常、肝肿大、肝纤维化、肝硬化甚至发生癌变等不同程度的肝脏疾病，成为砷致死的主要原因之一。现有研究发现：氧化应激和脂质过氧化是砷引起肝脏损伤的致病因素，砷在肝脏代谢中可产生大量的自由基和非自由基产物，引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应，使细胞膜和细胞器结构破坏，膜流动性失常；大量肝细胞内酶(alt、ast)释放入血，并可使清除自由基酶(sod、gpx)耗竭，肝细胞损伤进一步加重，谷胱甘肽(gsh)活力水平降低，丙二醛(mda)水平增加，导致肝功能异常，脂肪代谢紊乱。
4.喹唑啉类化合物(quinzoline)是一类含氮类杂环化合物，其普遍存在于自然界中。喹唑啉的环结构是多种生物碱的骨架，不同结构的喹唑啉类化合物可能具备不同的功效，达克替尼、吉非替尼、多沙唑嗪等药物以喹唑啉为药效基团，分别具备优良的抗肿瘤、抗高血压等功效。喹唑啉类化合物具有低毒、高效、作用方式独特且易于改造等优点，已成为药物化学、药理学领域的研究热点之一。
5.喹唑啉类化合物在抗肿瘤、抗高血压、抗疟疾、抗菌消炎、抗结核、杀虫、除草等领域发挥了重要作用，尚未见喹唑啉在防治肝损伤方面的报道。


技术实现要素：

6.为丰富现有技术，扩大喹唑啉类化合物的应用范围，本发明在前期研究构建和筛选得到式ⅰ所示的喹唑啉衍生物的基础上，从体内、体外水平，对砷中毒细胞模型及染毒小鼠进行喹唑啉衍生物的干预，探讨喹唑啉衍生物对砷致肝损伤的预防和保护作用，提供喹唑啉衍生物在制备防治砷致肝损伤药物中的用途。
7.本发明的目的将通过下面的详细描述来进一步说明。
8.本发明提供喹唑啉衍生物在制备防治砷致肝损伤药物中的用途，所述喹唑啉衍生物的结构式如式ⅰ所示：
9.在本发明中，该喹唑啉衍生物的代号为kzl-047，在部分说明书附图中，进一步简化为kzl。
10.优选地，所述砷为亚砷酸钠。
11.更优选地，所述肝损伤包括：肝功能异常、肝肿大、肝纤维化、肝硬化、肝癌变。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本发明从体内、体外水平证实了式ⅰ所示喹唑啉衍生物(kzl-047)在防治砷致肝损伤方面的功效，提供喹唑啉衍生物在制备防治砷致肝损伤药物中的用途。本发明通过构建砷中毒细胞模型并进行kzl-047的干预，发现kzl-047可缓解亚砷酸钠介导的肝细胞生长抑制活性，可缓解亚砷酸钠诱导的l-02细胞凋亡。本发明通过构建砷中毒小鼠模型并进行kzl-047的干预，发现kzl-047可预防和治疗sa导致的小鼠肝损伤。
附图说明
13.图1不同浓度的kzl-047对l-02细胞生长的影响结果图。
14.图2不同浓度的kzl-047对sa处理的l-02细胞增值的影响结果图。其中，2-a为通过mtt试验检测sa对l-02细胞体外生长有抑制影响的结果图，且有浓度依赖性；2-b为显微镜下观察到随着sa浓度升高，l-02细胞的形态检测图；2-c为选用20μmol/l的sa作为染毒浓度处理l-02细胞24h后，用不同浓度的kzl-047继续处理细胞48h的细胞增值影响结果图；2-d为选用20μmol/l的sa作为染毒浓度处理l-02细胞24h后，用不同浓度的kzl-047继续处理细胞48h的形态检测图。
15.图3 20μmol/l sa和不同浓度的kzl-047对l-02细胞凋亡的影响结果图。其中，3-a为用sa和不同浓度的kzl-047处理后的细胞凋亡水平检测结果图；3-b为20μmol/l sa诱导的细胞凋亡和不同浓度的kzl-047缓解细胞凋亡的流式细胞图。
具体实施方式
16.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。
17.本发明中，所涉及的实验材料为常规市售产品或可通过本领域的常规技术手段获得，所使用的检测方法按本领域的通用方法或试剂盒说明书进行，采用添加胎牛血清的dmem高糖培养基作为l-02细胞的培养液。
18.本实验中所用的正常人肝细胞系(l-02)购自中国科学院细胞库，中国上海；亚砷酸钠(sa)为标准剂，购自美国sigma公司；四甲基偶氮唑蓝(mtt)粉末及二甲基亚砜(dmso)，购自北京索莱宝公司；dmem高糖培养基，购自美国hyclone公司；胎牛血清(fbs)，购自四季青公司；96孔板，购自美国nest公司。昆明种spf级雄性小鼠140只，8-10周龄，体重25-30g，
由辽宁省实验动物资源中心提供，动物许可证号(证号：scxk(辽)2020-0001)。
19.实施例一 mtt法检测kzl-047对l-02细胞增殖的影响
20.分别取传三代状态良好的l-02细胞，将细胞浓度调整至5
×
103/孔并接种于96孔板中，每个孔中加入200μl细胞培养液，放置于37℃培养箱里孵育24h后，分别加入不同浓度(dmso、1.25、2.50、5.0、10.0、20.0μmol/l)的kzl-047，每个浓度5个复孔。在37℃培养箱里分别持续处理48h后，在倒置荧光显微镜拍照。然后，每个孔分别加入20μl mtt，37℃孵育4h，常温3000rpm/min离心30min，再用吸水纸吸出96孔板中的液体，加入150μl dmso，室温震荡15min，在490nm激发光下用酶标仪检测吸光度(od)，检测结果如图1所示，以三个独立实验的平均值
±
sd表示，与对照组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01。低浓度的kzl-047作用48h可以明显促进l-02细胞增殖(p《0.05)，高浓度促进作用降低，因此，后续实验选用5.0μmo/l和10.0μmol/l进行干预。
21.实施例二 kzl-047对sa导致l-02细胞增殖抑制和细胞凋亡的影响
22.按实施例一中的方法，分别将sa按不同浓度(dmso、10.0、20.0、40.0、80.0和160μmol/l)持续处理l-02细胞24h后，在490nm激发光下用酶标仪检测吸光度(od)，检测结果如图2-a所示，以三个独立实验的平均值
±
sd表示，与对照组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p《0.001。不同浓度sa处理l-02细胞24h，ic
50
值为25.80
±
2.34μmol/l，结果显示，l-02细胞活力随着sa浓度增加而下降，说明sa能以浓度依赖的方式抑制l-02细胞的增殖，选择20μmol/l作为后续染毒和造模浓度。在倒置荧光显微镜拍照观察细胞形态变化，结果如图2-b所示，细胞形态由梭形变圆，数量减少。后续实验设计分为4个组，空白组(dmso)、模型组(20μmol/l sa)、和kzl-047干预组(20μmol/l sa处理后+5μmol/l kzl、20μmol/lsa处理后+10μmol/l kzl)，sa处理24h后吸尽培养液，kzl-047干预组再加入含有相应浓度kzl-047的细胞培养液处理细胞48h，并进行检测，结果如图2-c所示。与对照组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与模型组相比，ap《0.05，
aa
p《0.01。结果显示：当sa浓度为20μmol/l，造模成功，与对照组相比，细胞生长明显受到抑制(p《0.05)；而增加5μmol/l和10μmol/l的kzl-047处理后，与对照组相比，细胞生长仍受到一定程度的抑制(p《0.05)，但细胞生长抑制的程度明显低于模型组(p《0.05)。这些结果表明，低浓度的kzl-047可以明显减轻sa对正常肝细胞增殖的抑制作用。观察细胞形态如图2-d所示，很明显，在用20μmol/l的sa处理肝细胞24h后，细胞形态开始由光滑变不规则，边界模糊，细胞间隙变大，但用5μmol/l和10μmol/l的kzl-047处理48h后，细胞形态逐渐恢复，边界变清晰，变圆细胞减少。这些数据表明，kzl-047在较低的浓度下可以缓解20μmol/l sa处理后的正常肝细胞的生长抑制，表现出一定的恢复效应。
23.将传三代的l-02细胞以3
×
105/ml的浓度接种于6孔板中，加入20μmol/l的sa造模培养24h后，吸尽原培养液，再加入不同浓度的kzl-047培养48h，分别设三个平行实验。收集细胞，用pbs洗涤两次，用1
×
binding buffer缓冲液调细胞浓度至1
×
106/ml，5μl fitc和5μl pi加入到细胞中。轻轻混合，室温下避光孵育15min，收集细胞，fitc和pi染色，立即用流式细胞仪检测凋亡，结果如图3-b所示。流式细胞仪检测kzl-047缓解sa诱导l-02细胞凋亡的潜在作用，结果如图3-a所示。研究结果显示，选用20μmol/l的sa诱导人肝细胞l-02凋亡率为13.56％(与对照组相比，p＜0.01)，用5μmol/l和10μmol/l的kzl-047处理细胞，l-02细胞凋亡率分别降至8.59％(p《0.05)和3.81％(p《0.01)，逐渐接近于未处理的正常肝细胞的情况。与空白组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01；与模型组相比，ap《0.05，
aa
p《0.01。以三个独立实验
的平均值
±
sd表示。以上结果表明，kzl-047可以明显减轻sa诱导的正常肝细胞凋亡。
24.实施例三 kzl-047的动物实验考察
25.分组及给药：正式实验前适应性喂养1周(室温20～24℃，湿度50％～60％，昼夜循环，自由饮水)，将140只spf级雄性昆明小鼠随机等分为预防和治疗两个大组，每一大组均设立空白组(生理盐水)，模型组(5mg/kg sa)，阳性对照组(11.375mg/kg的双环醇和182mg/kg的谷胱甘肽)，kzl低、中、高剂量组(25、50、100mg/kg)，共计7个小组；在预防组中，空白组灌胃等体积生理盐水，模型组灌胃5mg/kg的sa溶液，其余5组分别灌胃相应剂量的药物+5mg/kg的sa溶液，每天1次，连续灌胃4周；在治疗组中除空白组外，其余各组连续4周按照5mg/kg
·
d的sa溶液进行造模处理，从第五周开始，模型组灌胃生理盐水，其余5组给予相应的药物持续治疗4周。
26.测定与观察方法：末次给药后，所有小鼠均禁食、不禁水8h，；摘取眼球法收集小鼠血液样本，室温静置半小时后以3 000r/min离心15min收集上清，测定alt、ast、tbil等生化指标将所得数据进行统计学处理，与均数
±
标准差表示，差异显著性以t检验判定，结果分别如表1和表2所示。
27.所有实验小鼠没有观察到死亡或临床异常。预防组和治疗组中，跟空白组和喹唑啉处理后的小鼠相比，sa处理的小鼠消耗的食物量更少。
28.表1预防组小鼠血清中alt、ast、tbil活性的变化
[0029][0030]
注：与空白组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
aa
p＜0.01。
[0031]
表2治疗组小鼠血清中alt、ast、tbil活性的变化
[0032][0033]
注：与空白组比较，
**
p＜0.01；与模型组比较，
aa
p＜0.01。
[0034]
由预防组结果(表1)和治疗组结果(表2)可见，实验小时给予sa处理过后，模型组的alt、ast、tbil活性均明显上升，与空白组相比有显著差异(p《0.01)，说明造模成功。在预防组中，与空白组比较，模型组小鼠alt、ast、tbil活性显著上升(p《0.01)，阳性对照组及kzl-047各剂量组均无显著差异(p》0.05)，然而与模型组比较，阳性对照组及kzl-047各剂量组小鼠alt、ast、tbil活性下降(p《0.01)，以及kzl-047各剂量组与阳性对照组进行上述指标的比较，均无显著差异(p》0.05)。在治疗组中(见表2)，小鼠血清alt、ast、tbil活性变化趋势与预防组相一致，且呈剂量依赖性，即随着kzl-047剂量升高，其活性随之下降。说明本发明制备得到的喹唑啉衍生物具有很好的预防和治疗肝损伤的作用，且效果与阳性药活性相当。
[0035]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。