IL-4在制备用于治疗视网膜变性疾病药物中的应用

il-4在制备用于治疗视网膜变性疾病药物中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及il-4在制备用于治疗视网膜变性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.视网膜变性疾病是一类严重危害人类视功能的难治性致盲眼病，已成为我国日益突出的主要致盲眼病，包括老年性黄斑变性（amd）、视网膜色素变性（rp）和stargardt病等，临床上尚缺乏有效的治疗方法。视网膜色素上皮细胞（rpe）的功能障碍和缺失是这类疾病常见的共同病理特征。既往研究认为rpe细胞通过营养、屏障、吞噬等作用参与视网膜病理生理过程，部分rpe细胞可表达tlrs、fc-γ等免疫相关受体，介导局部免疫反应，影响细胞存活和修复。从免疫因素探寻rpe的功能特征及修复潜能是治疗视网膜变性疾病的重要研究方向。
3.il-4是一种具有免疫调节功能的细胞因子，可由肥大细胞、th2细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞分泌，在生理和病理条件下，参与调控白细胞存活，th2细胞介导的免疫，b细胞中的ige类别转换，以及通过调控巨噬细胞呈抑炎表型，促进组织修复和体内平衡。在不同的视网膜疾病中，il-4的表达情况存在争议。在湿性年龄相关性黄斑变性、黄斑囊样水肿和缺血性视网膜静脉阻塞中，有报道称通过眼内液筛查发现il-4表达增加；但在其他几项研究中，如eales病、糖尿病性视网膜病变中，也报告了il-4表达降低或检测不到。在视网膜变性疾病中，尚无应用il-4作为活性因子进行治疗的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决现有技术中视网膜变性疾病治疗所存在的问题，从而提供了一种有效治疗视网膜变性疾病的药物组合物，其以il-4作为活性成分，能够有效改善视网膜色素上皮的氧化应激状态，延缓视网膜光感受器细胞死亡的进程，同时具有抗炎和神经保护作用，能够减轻视网膜损伤，改善视网膜功能，为临床治疗视网膜变性疾病提供了切实的实验依据和理论基础。
5.为了解决上述技术问题，本发明是通过如下技术方案得以实现的。
6.本发明第一方面提供了一种治疗眼部疾病的药物组合物，包含il-4、磷酸盐缓冲液，所述il-4的浓度为2μg/μl。
7.作为优选地，所述眼部疾病选自视网膜变性。
8.本发明第二方面提供了一种治疗眼部疾病的药物制剂，包含il-4、磷酸盐缓冲液以及药学上可接受的辅料，所述il-4的浓度为2μg/μl。
9.作为优选地，所述眼部疾病选自视网膜变性。
10.作为优选地，所述药物制剂剂型选自溶液剂、溶胶剂、乳剂、混悬剂中的一种或多种。
11.作为优选地，所述药物制剂剂型选自溶液剂。
12.作为优选地，所述药学上可接受的辅料选自溶剂、增溶剂、表面活性剂、抑菌剂中、抗氧化剂、螯合剂中的一种或多种。
13.本发明第三方面提供了il-4在治疗眼部疾病和/或改善与眼部疾病相关生理指标的药物中的应用。
14.作为优选地，所述眼部疾病选自视网膜变性。
15.作为优选地，所述与眼部疾病相关生理指标选自视网膜下沉积的rpe色素紊乱团块数量、视网膜渗出及皱襞数量、视网膜光感受器细胞层厚度、视网膜rpe细胞表达抗氧化应激物的水平中的一种或多种。
16.本发明相对于现有技术具有如下技术效果：（1）本发明通过大量研究，充分证实了il-4对于视网膜变性疾病的相关治疗作用。其中，il-4主要是通过调控视网膜rpe细胞的氧化应激状态，显著抑制视网膜rpe细胞的氧化应激反应，使得视网膜电图（erg）波形振幅提高，并调控视网膜炎症微环境，使得视网膜下沉积的rpe色素紊乱团块减少、视网膜渗出及皱襞减少，从而使视功能得到改善。il-4具有抗炎和神经保护作用，增加视网膜光感受器细胞层厚度，减轻视网膜损伤，改善视网膜功能，为临床治疗视网膜变性疾病开辟提供了新的治疗思路。
17.（2）本发明对il-4在治疗视网膜变性疾病中的相关机制进行了深入研究，明确了il-4能能激活视网膜rpe细胞的表达il-4受体il-4rα，增加视网膜rpe细胞表达抗氧化应激物的水平，抑制视网膜炎症反应，为后续视网膜相关疾病的治疗及药物开发提供了切实的理论依据。
附图说明
18.图1为il-4对小鼠视网膜电图（erg）的影响结果示意图。
19.图2为il-4对小鼠眼的光相干断层扫描（oct）的情况影响结果示意图。
20.图3为眼底照相结果示意图。
21.图4为il-4对小鼠视网膜下紊乱的rpe色素团块数量影响结果示意图。
22.图5为il-4对小鼠rpe-巩膜复合体铺片免疫荧光检测结果示意图。
23.图6为il-4对小鼠rpe-巩膜复合体表达炎症因子及氧化应激相关因子在mrna水平影响结果示意图。
具体实施方式
24.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
25.在无特别说明的情况下，本发明所使用的试剂、耗材以及仪器中，均通过市售获得。动物伦理及所有实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》。本发明所使用的实验方法，例如免疫组化、动物实验等均为本领域的常规方法和技术。
26.生物学实验重复中选择具有代表性的结果呈现在上下文附图中，数据按照图示中规定的以mean
±
sd和mean
±
sem展示。所有体外实验至少重复三次，动物实验重复两次。数据采用graphpad prism 8.0或spss 22.0软件进行分析。采用t检验、卡方检验、方差分析等
常规医学统计学方法比较两组或两组以上的平均值差异。p＜0.05被认为是一个显著的差异。
27.实施例1 疾病模型的构建碘酸钠（naio3）是一种稳定的氧化剂，通过特异性地与黑色素之间的化学反应，增加黑色素细胞内的甘氨酸转化为具有细胞毒性化合物乙醛酸，因而naio3选择性地损伤了rpe细胞，继而光感受器细胞发生了继发性损伤，模拟了视网膜变性的病理改变。因而本发明采用naio3进行相关疾病模型的构建。具体步骤如下：（1）将il-4溶于磷酸盐缓冲液（pbs）配制成2μg/μl的浓度，获得il-4溶液备用；（2）将8-12周的c57bl/6j小鼠（购于江苏集萃药康生物科技有限公司）随机分成三组，每组10只；（3）组1（空白组）于尾静脉注射pbs，同时于玻璃体腔内注射1μl pbs；组2（模型组）于尾静脉注射naio3，玻璃体腔注射1μl pbs；组3（治疗组）于尾静脉注射naio3，玻璃体腔注射1μl经步骤（1）制备获得的il-4溶液。组2和组3中尾静脉注射naio3的浓度为20mg/kg，组1尾静脉注射与组2和组3等体积的pbs；（4）尾静脉造模的同一天给予玻璃体腔注药一次，造模后第7天取材，评估治疗的效果。
28.实施例2 视网膜电图（erg）评价il-4治疗后小鼠的视网膜功能实验全过程在微弱红光照明条件下进行。
29.（1）在经实施例1 naio3造模第7天，采用视网膜电图仪（celeris-diagnosys system）对上述各组小鼠进行视网膜电图（erg）检测。检查前对小鼠进行12小时的暗适应。腹腔内注射4.3%水合氯醛（10ml/kg）进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳；（2）将小鼠固定于实验板上，安装电极。在角膜上滴少许甲基纤维素，将记录电极（0.2mm铜丝制成的环状角膜电极）紧贴在角巩缘上，将参考电极（针形电极）放置在小鼠同侧颊部皮下，接地电极放置在小鼠尾部皮下；（3）再次暗适应约5分钟后开始进行相关的检查。应用国际临床视觉电生理标准化方案进行暗适应erg（scotopic erg）检测和记录。分别记录1.0cd
•
m-2
，3.0cd
•
m-2
和10.0cd
•
m-2
光照强度下小鼠的erg波形，检测频闪反应时对其进行30 hz的标准闪光刺激，并舍弃前三个反应波。应用软件对波形进行分析和统计。
30.检测结果如图1所示。其中1a为不同光强度刺激下a波的改变情况；1b为b波的变化情况。图中pbs组即为空白组组1，naio3+pbs组即为为视网膜变性小鼠的干预模型对照组，naio3+il-4组即为视网膜变性小鼠的il-4治疗组。暗适应12小时后，在1.0，3.0及10.0cdsm/2光照强度下，统计erg的a波及b波震幅，可以观察到naio3小鼠的a波及b波的波幅较pbs对照组明显下降；经过il-4治疗后，在暗适应两种不同的刺激强度（1.0，3.0 及10.0cds/m2）下均发现erg的a波和b波均出现一个有统计学意义的波形振幅，提示视网膜神经功能有部分改善可见治疗组与对照组相比振幅明显改善：*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
31.实施例3 光相干断层扫描（oct）评价il-4治疗后小鼠的视网膜厚度（1）在经实施例1 naio3造模第7天，采用视网膜电图仪（spectralis-oct，heidelberg，德国）对上述各组小鼠进行oct检测。检查前腹腔内注射4.3%水合氯醛（10ml/
kg）进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳；（2）麻醉后将小鼠头固定于oct颌架合适位置上，用镊子夹住球结膜以转动眼球位置，使oct探测光源对准激光斑点区域。选用计算机内设定的三维立体扫描法扫描激光斑点，以距离视乳头3mm的点为圆心，1.5mm为半径扫描。扫描范围覆盖视网膜的横向、纵向、鼻侧、颞侧四个方向，以计算视网膜的平均厚度。
32.检测结果如图2所示。其中2a-c为il-4治疗后小鼠眼的光相干断层扫描（oct）的情况，箭头所指为代表视网膜下rpe病灶的高反射点，虚线所示为光感受器细胞所在的外核层（onl），naio3造模后，rpe病灶增多，光感受器损伤丢失，onl厚度变薄，而il-4治疗后rpe病灶明显减少，onl厚度增加；2d为视网膜厚度的统计图。说明在il-4治疗后，病变视网膜的结构明显恢复，***p＜0.001。
33.实施例4 眼底照相评估il-4治疗后视网膜的炎症渗出情况（1）在经实施例1 naio3造模第7天，采用小动物视网膜成像系统（micron ii，phoenix research laboratories）对上述各组小鼠进行眼底成像检查。检查前腹腔内注射4.3%水合氯醛（10ml/kg）进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳，眼睛表面涂人工泪液保湿；（2）麻醉后将小鼠头置于颌架合适位置上，使眼底照相系统探测光源对准角膜顶点。调节进光方向及光源亮度，使视乳头位于视野正中心，成像整个后极部。
34.检测结果如图3所示。结果3a显示，naio3病变视网膜上的白色皱襞（白色箭头）及渗出灶（黑色箭头）明显增多，说明视网膜变性程度越严重，小鼠的治疗组（naio3+il-4）较对照组白色皱襞及渗出灶明显减少，说明视网膜变性程度减轻，3b为视网膜渗出灶的统计图；3c为视网膜白色皱襞的统计图，***p＜0.001。
35.实施例5 石蜡切片h&e染色观察il-4治疗小鼠视网膜结构的变化（1）在经实施例1 naio3造模第7天对各组小鼠进行颈椎脱臼处死，取得眼球，置于10%福尔马林固定18～24小时；（2）梯度乙醇中进行脱水12小时；依次在二甲苯浸泡2小时、65℃石蜡浸泡3～4h进行透化和浸蜡；（3）自动包埋机将组织包制，切片机获得取3～4μm切片贴附于载玻片上；（4）利用二甲苯脱蜡，100%、95%、75%梯度酒精清洗至水化；（5）利用苏木精浸染 10～15分钟进行染色，流动水清洗；（6）利用1%盐酸酒精分化1-2秒，饱和氨水蓝化数秒流水冲洗15～30分钟；（7）以1%醇溶性伊红浸染5～15秒；常规脱水、透明、封片。
36.检测结果如图4所示。结果4a显示，naio3病变小鼠的视网膜下紊乱rpe色素团块明显增加，小鼠的治疗组（naio3+il-4）较对照naio3病变组的rpe色素团块明显减少。4b为视网膜下紊乱rpe色素团块数量的统计图，**p＜0.01。。
37.实施例6 rpe-巩膜复合体铺片免疫荧光染色：（1）在经实施例1 naio3造模第7天对各组小鼠进行颈椎脱臼处死，取得眼球；（2）将眼球置于20倍以上体积的4% pfa中固定60min；（3）在解剖显微镜下用有齿镊固定眼球，先去除视神经，去除球壁的结缔组织和肌肉，剪开角膜，去掉虹膜、晶体及视网膜等组织，获得完整rpe-巩膜复合体；（4）将rpe-巩膜复合体置于0.5%triton x-100/pbs+5%bsa室温封闭1小时或4℃封
闭过夜；（5）新鲜配制免疫荧光一抗抗体（zo-1，il-4rα）：5%bsa以1：100比例进行稀释，将rpe-巩膜复合体置于抗体中，4℃孵育过夜，期间每隔数小时将ep管轻轻摇晃以充分接触抗体。
38.（6）将rpe-巩膜复合体取出孵育二抗，室温1-2小时，注意避光；pbst清洗6次，每次10分钟；（7）将rpe-巩膜复合体转移至载玻片上，解剖体视显微镜下用无齿镊去除杂质，以视盘为中心，放射状切开4-6刀，rpe层向上，滴少许抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察并照相。
39.检测结果如图5所示。结果显示，正常鼠的rpe细胞呈蜂窝状六边形结构，形成完整的紧密连接屏障，naio3病变组的rpe细胞紧密连接破坏，而il-4治疗后紧密连接获得恢复。另外，il-4干预后，il-4受体il-4rα主要表达于rpe细胞，说明il-4可通过il-4rα作用于rpe细胞，促进其屏障功能的恢复。
40.实施例7 rpe-巩膜复合体qpcr检测mrna水平基因表达变化（1）提取小鼠rpe-巩膜复合体rna：将2个rpe-巩膜复合体一组，置于1ml trizol中，剧烈震荡，震碎组织；（2）加入200-300μl氯仿，剧烈晃动，室温下静置10-15分钟；（3）4℃离心（13.2万转，30-40分钟），将上层透明的上清400-500μl液体小心的转入新的ep管；（4）加入等体积异丙醇，剧烈晃动后置于-20℃静置2小时以上，离心后弃上清；（5）加入1ml 70%无rna酶乙醇，弹起沉淀，再次离心后吸出酒精，在通风橱内自然风干；（6）加入20-30μl depc水（根据沉淀的大小），置于冰上并检测a260/280及浓度。使用primescript
tm rt reagent kit cdna反转录试剂盒进行cdna反转录；然后根据说明书使用sybergreen试剂盒进行实时定量pcr，gapdh作为内参，用2
‑∆∆
ct
进行结果分析，其中pcr引物如下表1所示。
41.表1 pcr引物引物名称forwardreversenqo1
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
aggatgggaggtactcgaatcaggcgtccttccttatatgctagapdhgccaaggctgtgggcaaggttctccaggcggcacgtcagail-6 actcacctcttcagaacgaattgccatctttggaaggttcaggttgnfkb1ggaggcatgttcggtagtggccctgcgttggatttcgtg检测结果如图6所示。其中，il-6及nf-kb反映炎症的情况，nqo1体现抗氧化应激因子表达的情况。可见在naio3干预的模型组中，炎症因子表达增高，抗氧化应激的因子表达水平降低，在经过il-4治疗后，naio3模型组中炎症因子的表达下降，抗氧化应激的保护性因子表达水平升高，表明il-4能有效改善视网膜色素上皮的氧化应激状态, 抑制视网膜炎症反应。
42.综合上述可知，本发明通过erg、oct、眼底成像、h&e等实验证实，玻璃体腔注射il-4能显著减少视网膜变性小鼠的rpe细胞损伤，保护视功能，延缓视网膜变薄。免疫荧光染色
证实il-4可作用于视网膜色素上皮细胞的il-4rα受体，调控视网膜变性模型小鼠rpe细胞的紧密连接获得恢复。il-4干预后可降低rpe巩膜复合体炎症因子的表达水平，并上调其抗氧化应激相关基因，从而改善视网膜色素上皮的氧化应激状态，延缓视网膜光感受器细胞死亡的进程。本发明为il-4治疗视网膜变性疾病以及il-4作为免疫调控剂的潜在临床应用提供实验依据和理论基础，il-4在制备治疗视网膜退行性疾病药物制剂中将有广阔的应用前景。
43.以上具体实施方式部分对本发明所涉及的分析方法进行了具体的介绍。应当注意的是，上述介绍仅是为了帮助本领域技术人员更好地理解本发明的方法及思路，而不是对相关内容的限制。在不脱离本发明原理的情况下，本领域技术人员还可以对本发明进行适当的调整或修改，上述调整和修改也应当属于本发明的保护范围。