1.本发明涉及干细胞因子缓释微球，特别涉及一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子缓释微球的制备方法。
背景技术：
2.女性在各种病理因素如宫腔操作、子宫缺血、感染等原因均可造成子宫内膜损伤。子宫内膜修复障碍是女性宫腔粘连、闭经、不孕的重要原因，目前促进子宫内膜损伤修复的方法很多，但针对重度子宫内膜损伤修复障碍的临床治疗方法也有限。子宫内膜是一层包裹着宫腔的粘膜层，主要分为功能层与基底层。子宫内膜的增殖与崩解是受到月经周期调节的。雌激素与孕激素的表达下降会引发子宫内膜的脱落和出血。其后内膜创面迅速再生修复、功能重建。其主要原因是内膜基底层在月经时并不脱落。但在临床上频繁的宫腔操作、感染及部分药物的试用一旦损伤子宫内膜基底层，会使子宫内膜细胞和腺体再生障碍，新生血管形成受损，子宫内膜难以实现自我修复，最后导致形成宫腔粘连和薄型子宫内膜。
3.重度子宫内膜损伤修复目前临床上没有很好的药物治疗手段。目前正在开展研究的方法主要有有支架疗法和细胞疗法。支架疗法是采用生物膜片覆盖子宫内膜损伤处，起到覆盖创面与引导细胞生长，恢复内膜的结构与功能，同时防止宫腔粘连。其使用的材料即有合成的聚乳酸、聚乙酸等高分子膜材料，也有如胶原、纤维素、壳聚糖、透明质酸等天然生物材料制备的膜片。但是合成材料生物相容性与组织粘附性较差，影响使用效果。而天然材料又存在机械力不足，降解速度快等特点。但最为关键的是，支架材料只能发挥细胞引导作用，不能实质上调节子宫内膜基底细胞自我修复与再生的信号通路。
4.干细胞是一类具有多向分化和自我更新潜能的细胞，根据细胞来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是来源于成熟组织的多能干细胞的统称，现已在多种组织器官中被发现，特别是间充质干细胞，具有多向分化潜能的同时，还有低免疫原性。由于间充质干细胞独特的生物学特性，使得其在再生医学领域有非常大的应用前景。间充质干细胞疗法已在多种疾病损伤或退行性疾病中开展了研究，都取得了显著的疗效，而在妇产科疾病特别是在宫腔粘连和薄型子宫内膜的治疗也显示这巨大的潜力。直接或间接递送间充质干细胞促进子宫内膜损伤修复已成为重要的研究方向。不少研究发现不同来源的干细胞对子宫内膜损伤修复具有积极的影响，如减少纤维化面积、增加子宫内膜厚度及腺体数量、刺激血管生成以及改善妊娠结局等。
5.尽管目前有部分研究显示，间充质干细胞修复子宫内膜损伤是通过分化为子宫内膜细胞和血管细胞的能力。如骨髓来源的间充质干细胞在雌激素的刺激下会向上皮细胞分化。胚胎来源的间充质干细胞与子宫内膜上皮细胞共培养在雌激素的刺激下也具有转化为子宫内膜样细胞的能力。但是这些研究仅仅是体外研究，并不能实质说明在体内间充质干细胞分化为子宫内膜细胞。
6.间充质干细胞修复子宫内膜损伤后的研究发现，干细胞移植数量是有限的，在体内的定植与增殖能力也有限，尤其是异体间充质干细胞在体内存活时间通常不会超过6～8
周，因此移植的间充质干细胞替代整个子宫内膜细胞几乎不可能。因此越来越多的学者认为干细胞的旁分泌作用或许是其参与治疗的主要机制，即干细胞主要依靠其外泌体和分泌的生长因子促进组织修复，而不是单纯的细胞替代。干细胞外泌体内包含多种趋化因子、细胞因子以及转录因子等，在子宫内膜再生方面主要通过促进血管再生、刺激宿主子宫内膜细胞活性以及免疫调节等方式减少细胞死亡，并为宿主细胞提供营养支持和促进组织的再生。由于利用干细胞外泌体或生长因子相较与间充质干细胞本身更为安全，通过离心、过滤等方式提取干细胞外泌体和生长因子后，再将含有外泌体和生长因子的溶液注射至损伤部位的无细胞移植已成为干细胞研究的新热点，有望成为再生医学的新治疗方式。然而直接使用外泌体溶液或因子溶液用于子宫内膜修复存在暴释的问题，不能稳定的修复子宫内膜损伤，同时溶液形式的因子或外泌体本身难以起到防粘连的效果。因此本发明制作了一种具有缓释干细胞因子和外泌体的微球，该产品能在宫腔内稳定存在一段时间缓释出干细胞因子，起到持续修复的作用，又能够黏附创面起到预防宫腔粘连的作用。
技术实现要素：
7.本发明的目的在于提供一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子缓释微球的制备方法。该方法获得的干细胞因子缓释微球稳定性好，而且与组织有良好的黏附性。
8.本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种修复子宫内膜损伤的干细胞因子缓释微球的制备方法，取间充质干细胞培养液、海藻酸钠和聚乙二醇4000(peg4000)混合作为水相溶液，然后与乳化剂混合，搅拌条件下制成干细胞因子缓释微球。
9.其中，海藻酸钠和聚乙二醇4000(peg4000)构成的水溶液与间充质干细胞培养液之间的质量比为1:5-5:1，而海藻酸钠和聚乙二醇4000(peg4000)之间的质量比为 0.05-0.5％:0.5-5％。
10.本发明中，水相溶液和乳化剂混合后，以不低于2000rpm/min的速率高速均值2～10 分钟，在搅拌过程中加入质量体积比为0.5％～2％的cacl2溶液，添加量为水相溶液和乳化剂总质量的2％～8％。
11.作为本发明的一个实施例，水相溶液和乳化剂的质量比为1/20-1/5。
12.本发明的一个实施例中，乳化剂为含吐温80和司盘20的橄榄油溶液。
13.本发明中，搅拌完成后，所得的物料经预冷丙酮脱水后，过滤、干燥得微球，在以含 0.5-2％1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)的无水乙醇溶解微球，振荡交联处理后，用乙醇洗脱，干燥得缓释微球。本发明的间充质干细胞来源于胎盘、脐带、脂肪、骨髓、牙髓等组织。间充质干细胞培养液由原代间充质干细胞培养至第3-8代的培养液。具体地，所述原代间充质干细胞经无血清培养基培养至第3-8代时，经过超滤膜过滤去除小于3kd的小分子物质以及代谢物后，浓缩2-10倍，得所述间充质干细胞培养液。
14.本发明具有以下优点：
15.1.本发明以海藻酸钠和peg4000作为材料制作了包裹干细胞因子的微球。采用海藻酸钠原料因为该成分为天然高分子材料，生物相容性好，获取便捷，非动物源性，且在体内与透明质酸、明胶等原料相比降解相对缓慢。利用peg4000作为辅料是因为peg4000能赋予微球高黏弹性，能快速黏附与组织、够覆盖内膜组织，防止受损子宫内膜与周围的接触粘连。peg4000还可以通过聚集宫腔内膜的蛋白质，延缓吸收并延长组织分离效果，达到辅助
防粘连的效果。
16.2.本发明在乳化制备过程中以不低于2000rpm/min的速率高速搅拌30～180分钟，制得的微球粒径小，因子包裹均匀。
17.3.本发明制备的缓释微球，与edc交联后微球在宫腔内的降解时间可以显著延长，有助于促进子宫内膜损伤的再生修复，同时起到良好的防粘连的效果。
具体实施方式
18.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
19.实施例一
20.一、胎盘间充质干细胞的培养：
21.1.在无菌条件下，取足月顺产胎盘的胎儿面组织，pbs反复冲洗至液体澄清。
22.2.眼科剪将胎盘组织剪成约1mm*1mm*1mm的碎片。
23.3.然后用0.1％的ii型胶原酶，浸没组织碎片，并于37℃恒温震动箱中消化45分钟。
24.4.消化后的胎盘组织过200目筛网研磨并收集细胞悬液，室温1000rpm/min离心5分钟，弃上清。
25.5.用2ml磷酸盐缓冲液重悬细胞后加入等量的人淋巴细胞分离液，2000rpm/min离心 10分钟后尽量吸取白膜层。
26.6.用含无血清的培养液，调整细胞浓度为1*108l-1
，接种于培养瓶中，体积分数5％的 co2恒温箱中37℃培养。无血清培养液为购买的商业培养液。
27.7.4～7天后首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次。
28.8.细胞达到90％融合后，0.25％胰蛋白酶37℃消化三到四分钟，1000rpm/min离心5 分钟，弃上清，按1:2比例传代，继续培养至第5代。
29.二、胎盘干细胞培养液的超滤与浓缩
30.1.收集上述步骤一中的培养至第5代的间充质干细胞培养液，以500g离心10分钟去除残余细胞；
31.2.以2000g离心20分钟以去除细胞碎片。
32.3.将经离心处理后的间充质干细胞培养液加入到3kd的超滤离心管中，以3000g离心 30分钟，去除小分子物质以及细胞的代谢产物，同时将培养液浓缩5倍。
33.三、缓释微球的制备
34.1.取海藻酸钠和peg4000分别以质量体积比0.1％和1％的浓度加入去离子水中，80℃搅拌溶解。
35.2.待温度下降到室温后，以1:1的体积比例将超滤后的间充质干细胞培养液加入海藻酸钠溶液，2000rpm/min搅拌均匀，制成水相溶液。
36.3.将司盘20与吐温80按照1:1的质量比加入到橄榄油中，使质量体积比都达到10％，以2000rpm/min搅拌均匀，制成油相溶液，即乳化剂。
37.4.将水相溶液与油相溶液混合均匀，以30000rpm/min的转速高速均值5分钟，然后一边均质一边向混合溶液中添加浓度为0.5％的cacl2溶液，添加量为混合溶液总质量的
2％。
38.5.以5000rpm/min搅拌3小时，并用2倍的预冷丙酮进行脱水，然后用纤维膜过滤微球，于真空干燥箱干燥微球。
39.6.利用含有0.5％edc的无水乙醇重新溶解微球后，振荡交联处理6小时，再用等体积的乙醇洗脱edc三遍后，真空干燥微球。
40.实施例二
41.与实施例一不同的是：
42.一、胎盘间充质干细胞的培养：
43.1.在无菌条件下，取足月顺产胎盘的胎儿面组织，pbs反复冲洗至液体澄清。
44.2.眼科剪将胎盘组织剪成约1mm*1mm*1mm的碎片。
45.3.然后用0.1％的ii型胶原酶，浸没组织碎片，并于37℃恒温震动箱中消化45分钟。
46.4.消化后的胎盘组织过200目筛网研磨并收集细胞悬液，室温1000rpm/min离心5分钟，弃上清。
47.5.用2ml磷酸盐缓冲液重悬细胞后加入等量的人淋巴细胞分离液，2000rpm/min离心 10分钟后尽量吸取白膜层。
48.6.用含无血清的培养液，调整细胞浓度为1*108l-1
，接种于培养瓶中，体积分数5％的 co2恒温箱中37℃培养。无血清培养液为购买的商业培养液。
49.7.4～7天后首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次。
50.8.细胞达到90％融合后，0.25％胰蛋白酶37℃消化三到四分钟，1000rpm/min离心5 分钟，弃上清，按1:2比例传代，继续培养至第3代。
51.二、胎盘干细胞培养液的超滤与浓缩
52.1.收集上述步骤一中的培养至第3代的间充质干细胞培养液，以500g离心10分钟去除残余细胞。
53.2.以2000g离心20分钟以去除细胞碎片。
54.3.将经离心处理后的间充质干细胞培养液加入到3kd的超滤离心管中，以3000g离心 30分钟，去除小分子物质以及细胞的代谢产物，同时将培养液浓缩5倍。
55.三、缓释微球的制备
56.1.取海藻酸钠和peg4000分别以质量体积比0.25％和2.5％的浓度加入去离子水中，80℃搅拌溶解，制成溶液a。
57.2.待温度下降到室温后，以1:1的体积比例将超滤后的间充质干细胞培养液加入溶液 a，2000rpm/min搅拌均匀，制成水相溶液。
58.3.将司盘20与吐温80按照1:1的质量比加入到橄榄油中，使质量体积比都达到20％，以2000rpm/min搅拌均匀，制成油相溶液，即乳化剂。
59.4.将水相溶液与油相溶液混合均匀，以15000rpm/min的转速高速搅拌5分钟，然后一边搅拌一边向混合溶液中添加浓度为1％的cacl2溶液，添加量为混合溶液总质量的4％。
60.5.继续以5000rpm/min搅拌3小时，并用2倍的预冷丙酮进行脱水，然后用纤维膜过滤微球，于真空干燥箱干燥微球。
61.6.利用含有1％edc的无水乙醇重新溶解微球后，振荡交联处理6小时，再用等体积
的乙醇洗脱edc三遍后，真空干燥微球。
62.实施例三
63.一、胎盘间充质干细胞的培养：
64.1.在无菌条件下，取足月顺产胎盘的胎儿面组织，pbs反复冲洗至液体澄清。
65.2.眼科剪将胎盘组织剪成约1mm*1mm*1mm的碎片。
66.3.然后用0.1％的ii型胶原酶，浸没组织碎片，并于37℃恒温震动箱中消化45分钟。
67.4.消化后的胎盘组织过200目筛网研磨并收集细胞悬液，室温1000rpm/min离心5分钟，弃上清。
68.5.用2ml磷酸盐缓冲液重悬细胞后加入等量的人淋巴细胞分离液，2000rpm/min离心 10分钟后尽量吸取白膜层。
69.6.用含无血清的培养液，调整细胞浓度为1*108l-1
，接种于培养瓶中，体积分数5％的 co2恒温箱中37℃培养。无血清培养液为购买的商业培养液。
70.7. 4～7天后首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次。
71.8.细胞达到90％融合后，0.25％胰蛋白酶37℃消化三四分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃上清，按1:2比例传代，继续培养至第8代。
72.二、胎盘干细胞培养液的超滤与浓缩
73.1.收集上述步骤一中的培养至第8代的间充质干细胞培养液，以500g离心10分钟去除残余细胞。
74.2.以2000g离心20分钟以去除细胞碎片。
75.3.将经离心处理后的间充质干细胞培养液加入到3kd的超滤离心管中，以3000g离心 30分钟，去除小分子物质以及细胞的代谢产物，同时将培养液浓缩5倍。
76.三、缓释微球的制备
77.1.取海藻酸钠和peg4000分别以质量体积比0.5％和5％的浓度加入去离子水中，80℃搅拌溶解，制成溶液a。
78.2.待温度下降到室温后，以1:1的体积比例将超滤后的间充质干细胞培养液加入，溶液a，2000rpm/min搅拌均匀，制成水相溶液。
79.3.将司盘20与吐温80按照1:1的质量比加入到橄榄油中，使质量体积比都达到30％，以2000rpm/min搅拌均匀，制成油相溶液，即乳化剂。
80.4.将水相溶液与油相溶液混合均匀，以10000rpm/min的转速高速均值5分钟，然后一边搅拌一边向混合溶液中添加浓度为2％的cacl2溶液，添加量为混合溶液总质量的8％。
81.5.继续以5000rpm/min搅拌3小时，并用2倍的预冷丙酮进行脱水，然后用纤维膜过滤微球，于真空干燥箱干燥微球。
82.6.利用含有2％edc的无水乙醇重新溶解微球后，振荡交联处理6小时，再用等体积的乙醇洗脱edc三遍后，真空干燥微球。
83.对比例一
84.一、胎盘间充质干细胞的培养：
85.1.在无菌条件下，取足月顺产胎盘的胎儿面组织，pbs反复冲洗至液体澄清。
86.2.眼科剪将胎盘组织剪成约1mm*1mm*1mm的碎片。
87.3.然后用0.1％的ii型胶原酶，浸没组织碎片，并于37℃恒温震动箱中消化45分钟。
88.4.消化后的胎盘组织过200目筛网研磨并收集细胞悬液，室温1000rpm/min离心5分钟，弃上清。
89.5.用2ml磷酸盐缓冲液重悬细胞后加入等量的人淋巴细胞分离液，2000rpm/min离心 10分钟后尽量吸取白膜层。
90.6.用含无血清的培养液，调整细胞浓度为1*108l-1
，接种于培养瓶中，体积分数5％的 co2恒温箱中37℃培养。
91.7. 4～7天后首次半量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3～4天换液1次。
92.8.细胞达到90％融合后，0.25％胰蛋白酶37℃消化三四分钟，1000rpm/min离心5分钟，弃上清，按1:2比例传代，继续培养至第5代。
93.二、胎盘干细胞培养液的超滤与浓缩
94.1.收集上述步骤一中的培养至第5代的间充质干细胞培养液，以500g离心10分钟去除残余细胞。
95.2.以2000g离心20分钟以去除细胞碎片。
96.3.将经离心处理后的间充质干细胞培养液加入到3kd的超滤离心管中，以3000g离心 30分钟，去除小分子物质以及细胞的代谢产物，同时将培养液浓缩5倍。
97.三、缓释微球的制备
98.1.取海藻酸钠和peg4000分别以质量体积比0.6％和10％的浓度加入去离子水中，80℃搅拌溶解，制成溶液a。
99.2.待温度下降到室温后，以1:1的体积比例将超滤后的间充质干细胞培养液加入溶液 a，2000rpm/min搅拌均匀，制成水相溶液。
100.3.将司盘20与吐温80加入到橄榄油中，使质量体积比都达到0.1％，以2000rpm/min 搅拌均匀，制成油相溶液，即乳化剂。
101.4.将水相溶液与油相溶液混合均匀，以5000rpm/min的转速高速搅拌60分钟，然后一边搅拌一边向混合溶液中添加浓度为1％的cacl2溶液，添加量为混合溶液总质量的2％。
102.5.继续以5000rpm/min搅拌3小时，并用2倍的预冷丙酮进行脱水，然后用纤维膜过滤微球，于真空干燥箱干燥微球。
103.试验例一大鼠宫腔损伤修复实验
104.采用10％的水合氯醛0.35ml/100g大鼠腹腔注射，严格无菌操作，切开大鼠下腹部，暴露大鼠子宫，于宫颈上方约5mm处左纵行切口，长度约4mm，采用小的宫腔刮勺经宫颈上方切口对大鼠进行刮宫操作，待宫腔四壁出现粗糙感时停止刮宫。6只大鼠刮宫结束后，将所得的缓释微球沿宫颈上方切口注射到宫腔里面。另外6只不注射缓释微球，作为对照组，缝合大鼠宫腔与腹壁。继续饲养3个月后，处死大鼠，取子宫进行组织切片进行 he染色与masson染色，观察实验组与对照组的宫腔粘连情况。