川蛭通络制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明涉及川蛭通络制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，属于中药领域，具体涉及川蛭通络制剂在制备治疗肝脏及肺脏恶性肿瘤药物中的应用。

背景技术：

1、肿瘤(tumour)是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。根据新生物的细胞特性及对机体的危害性程度，肿瘤又可分为良性肿瘤和恶性肿瘤两大类，其中恶性肿瘤是当今世界严重威胁人类生命和健康且发病率极高的疾病，是全世界人类死亡的一个主要原因。在中国，恶性肿瘤在十大疾病死亡率排行榜中仅次于脑血管病而位居第二，其发病率高达22.08％，死亡率约为12.94％。因此，恶性肿瘤的预防与治疗是生命科学领域的共同难题。

2、目前，临床上常用的经典治疗手段主要有外科手术、内科化疗以及放射疗法等。其中，手术治疗和放疗均属于局部疗法，对于癌细胞已经转移的患者就起不了作用。而且放疗和化疗在杀伤患者体内肿瘤细胞的同时，也破坏(杀伤)机体正常细胞和免疫细胞，导致多种组织及器官损伤。尤其是很多化学合成抗癌药会引起骨髓抑制、免疫力低下、肝肾损伤和心脏毒性等严重的副作用。并且机体还会因免疫系统的损伤而导致免疫功能低下，使免疫监视系统不能正常发挥作用而诱发其他肿瘤。另外，患者在使用化疗药物的过程中会产生抗药性，不仅对同类型药物产生耐药，而且对与之化学结构及作用机理完全不同的化疗药物也会产生交叉抗药，极大地降低了药效和治疗效果，导致治疗效果不理想。总之，迄今为止肿瘤的治疗尚未达到较好的效果。因此，寻找一种高效、低副作用并能修复免疫系统，提高机体免疫力的肿瘤治疗药物已成为国际学者关注的新焦点。

3、近年来，中医中药在治疗肿瘤方面取得了长足发展，其具有多组分、多靶点协同作用、毒副作用小、不良反应少以及药源广泛、价格低廉等优点，在临床肿瘤的治疗中发挥着重要的协同作用，可通过调节免疫、减少副作用和消除耐药性提高肿瘤的治疗效果，在减轻患者症状、延长生存时间或与放化疗协同治疗等方面呈现出较好的疗效。

4、本发明的制剂名称为川蛭通络胶囊，由鲁南厚普制药有限公司生产，批准文号：国药准字z20090031，临床上用于治疗以血瘀气虚为主要表现症状的缺血性中风。在临床使用过程中，发现其对肿瘤有很好的疗效。川蛭通络制剂由水蛭、川芎、黄芪、丹参四味原料药材制备组成，具有活血化瘀，益气通络之功效，是以补阳还五汤为依据研发而成。方中以水蛭为君药，善化瘀血，破血消积；川芎为臣药，其性上行，可协同水蛭达于脑络，活血通络，使整体气血流畅，脏腑功能健旺；黄芪、丹参为佐药，黄芪补气以行血滞、温通经脉，丹参活血祛瘀、安神养心；全方共奏活血化瘀、益气通络之功效。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种川蛭通络制剂在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。所述的应用是公司药物在临床应用过程中发现的，后经相关的药效学试验证实，具有较大的商业价值。

2、发明人在川蛭通络胶囊临床应用过程中，发现川蛭通络胶囊具有治疗恶性肿瘤的功效。药效学试验表明，川蛭通络胶囊是治疗肝脏及肺脏恶性肿瘤的有效组方，可抑制肿瘤细胞生长、缩小瘤体，增强机体免疫功能，延长肿瘤患者生命，为临床用药提供了新的选择，体现出复方中药具有整体性、多靶点和多成分协同作用的疗效特点。

3、需要说明的是，本发明所述的应用依托于已上市产品川蛭通络胶囊制剂，但是本发明的应用不限于上述制剂，采用本发明如下的技术方案所得到的川蛭通络制剂均能实现治疗恶性肿瘤的应用。

4、本发明所述的川蛭通络制剂由下列中药组分制成：

5、水蛭300-800重量份      川芎300-800重量份

6、黄芪200-600重量份      丹参200-600重量份。

7、优选地，所述中药组合物由下列组分制成：

8、水蛭600重量份         川芎600重量份

9、黄芪400重量份         丹参400重量份

10、本发明中药组合物除了具有活血化瘀、益气通络的功效，可在临床上治疗缺血性脑中风，包括脑组织缺血、缺氧，脑血栓、脑梗塞及腔隙性梗塞等疾病外，还可以治疗肿瘤病，其安全性高，作用效果明显，为治疗肿瘤开辟了一种新的中药治疗方法。

11、以本发明所述中药为原料，加入不同辅料，按照常规工艺，可以将本发明中药组分制备成临床上可接受的不同的口服药物制剂，如颗粒剂、胶囊剂、片剂或丸剂等。

12、为了上述剂型能够实现，需要在制备上述剂型时，加入药用辅料，这些药用辅料可以包括但不限于填充剂、黏合剂、防腐剂、矫味剂、保湿剂、崩解剂、润滑剂。

13、所述口服药物制剂的制备工艺包括下列步骤：

14、a、取处方量的水蛭药材，粉碎成粗粉，加入4-8倍量的水，于37℃条件下搅拌提取10-30h，离心弃去沉淀，上清液经膜滤过后，再经超滤器滤过并浓缩，浓缩液冷冻干燥，得水蛭冻干粉，备用；

15、b、取处方量的川芎、黄芪、丹参，加入4-8倍量65％-95％乙醇回流提取两次，每次2-3h，过滤，合并滤液，滤液浓缩至50-60℃时相对密度为1.15-1.25的浸膏ⅰ，备用，药渣备用；

16、c、取步骤b所得药渣，加入原药材重量3-5倍量的水，煎煮1次，时间为1-2h，滤过，滤液浓缩至50-60℃时相对密度为1.15-1.25的浸膏ⅱ，备用；

17、d、将步骤b所得浸膏ⅰ与步骤c所得浸膏ⅱ合并，喷雾干燥，得川蛭通络提取物细粉，备用；

18、e、将步骤a所得水蛭冻干粉与步骤d所川蛭通络提取物细粉混匀，粉碎成细粉，经常规工序直接或加入药学上可接受的辅料制成口服药物制剂。

19、优选地，步骤a取处方量的水蛭药材，加入6倍量的水，于37℃、100r/min的条件下搅拌提取20h，在6000r/min的条件下离心30min，弃去沉淀，上清液经1μm孔径膜滤过后，再经0.2μm孔径膜滤过除菌，再经截留分子量为6000-10000da超滤器滤过并浓缩至600ml，浓缩液冷冻干燥，得水蛭冻干粉。

20、优选地，步骤b加入6倍量80％乙醇，滤液浓缩至50-60℃时相对密度为1.20的浸膏。

21、优选地，步骤c加入原药材重量4倍量的水，滤液浓缩至50-60℃时相对密度为1.20的浸膏。

22、为验证本发明中川蛭通络制剂在治疗恶性肿瘤方面的功效，发明人开展了药效学试验研究。需要说明的是，本发明药品药效学试验所选取的药品为本发明具有代表性的配方及其制备方法所得的药品，本发明所包含的其它配方及制备方法所得药品涉及的试验及其结果，由于篇幅限制，在此不一一穷举。

23、实验例1川蛭通络胶囊对h22肝癌荷瘤小鼠的影响研究

24、1实验材料

25、1.1实验动物

26、昆明种小鼠，雌性，4-6周龄，体重18-22g，实验动物许可证号：syxk(鲁)-20180008，由山东新时代药业有限公司提供。实验前所有小鼠置于室温24-26℃，相对湿度50％-60％，通风及光照良好的环境中，标准鼠饲料常规喂养，自由摄食、饮水。

27、1.2仪器、试剂及药品

28、centrifuge 5415r型高速冷冻离心机(美国eppendorfag公司)；szx-1llb200型倒置显微镜(日本olympus公司)；高糖dmem培养基(美国bi，批号：0033617)；胎牛血清(gibco，批号：42q7380k)；胰酶(美国bi，批号：0010218)；环磷酰胺(百特国际有限公司，批号：6f125a，0.2g/片)；h22瘤株由山东省医学科学院提供；受试药物为川蛭通络胶囊(鲁南厚普制药有限公司提供，国药准字z20090031)；阳性对照药物为平消片(沈阳康达制药集团有限公司，国药准字z21021484)。

29、2实验方法

30、2.1细胞培养

31、鼠肝癌h22细胞用含10％胎牛血清的dmem完全培养基培养于培养皿中，置于37℃5％的co2恒温培养箱中，隔天换液，倒置显微镜下观察细胞的生长状态，当细胞的汇合度达到70％-80％时，进行传代或用于实验。

32、2.2小鼠腹水获取

33、取对数生长期的h22细胞，在800r/min的条件下离心5min，去上清，细胞计数，调整细胞密度为1×107个/ml。随机取2只昆明种小鼠，用1ml注射器取细胞混悬液0.2ml注射入每只小鼠腹腔中，观察腹部状态，7-10天后，若见小鼠腹部明显膨大，说明接种成功，可进行腹水传代。将小鼠颈椎脱臼处死，于超净台中抽取乳白色腹水，用pbs稀释腹水细胞密度至1×107个/ml，继续取细胞0.2ml注射入小鼠腹腔，3次传代后，取第3代腹水细胞即可进行昆明小鼠荷瘤实验。

34、2.3小鼠皮下成瘤实验

35、取第3代腹水h22细胞，细胞计数，调整细胞密度为5×106个/ml，于雌性昆明种小鼠腹部中线皮下注射细胞悬液，每只0.2ml。接种1-2d后，若用游标卡尺测得肿瘤直径为1mm3左右，随机分为模型组，阳性对照组，川蛭通络胶囊低剂量组(简称“低剂量组”)、川蛭通络胶囊中剂量组(简称“中剂量组”)和川蛭通络胶囊高剂量组(简称“高剂量组”)，每组10只，另取10只未作任何处理的小鼠设为空白对照组。根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算小鼠等效剂量，川蛭通络胶囊低、中、高剂量组灌胃0.11375g/kg、0.22750g/kg和0.45500g/kg，阳性对照组平消片腹腔注射0.62790g/kg，空白组和模型组灌胃同等容积的生理盐水。各组均连续给药10天，第10天给药结束后禁食不禁水，次日，眼眶取血后断颈处死小鼠，剥离瘤体，称量肿瘤质量，记录，计算各组抑瘤率。

36、抑瘤率＝(模型组瘤重均值-样品组瘤重均值)/模型组瘤重均值×100％。

37、2.4统计学处理

38、

39、采用spss 21.0统计学软件进行分析，实验数据以“均数±标准差()”的形式表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-wayanova)，p＜0.05表示差异具有统计学意义。

40、3实验结果

41、结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠的平均瘤重显著增加(p＜0.05)，表明造模成功；与模型组相比，给予不同剂量的川蛭通络进行治疗后，小鼠的平均瘤重均有一定程度的降低，差异具有显著性意义(p＜0.05)，表明本发明川蛭通络胶囊不同剂量组和阳性对照组均对h22小鼠的肿瘤生长有抑制作用，而且本发明川蛭通络制剂对肿瘤的抑制作用呈现剂量依赖性。结果见表1。

42、表1本发明中药组合物对小鼠移植性肿瘤h22的抑制作用(n＝10，)

43、

44、注：与正常对照组相比，“#”表示p＜0.05；与模型组相比，“*”表示p＜0.05。

45、实验例2川蛭通络胶囊对smmc-7721肝癌荷瘤小鼠的影响研究

46、1实验材料

47、1.1实验动物

48、balb/c裸鼠，雄性，4-6周龄，体重18-22g，购自上海实验动物中心。实验前所有小鼠置于室温24-26℃，相对湿度50％-60％，通风及光照良好的环境中，标准鼠饲料常规喂养，自由摄食、饮水。

49、1.2细胞株

50、人肝癌细胞株smmc-7721购买于中国科学院上海生物研究所细胞库。

51、1.3仪器、试剂及药品

52、dmem培养基购自gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶购自闪晶生物公司；二氧化碳培养箱(150型，美国科峻仪器公司)；z-320k高速冷冻离心机(德国hermle公司)；u90-136002荧光倒置显微镜(德国徕卡公司)。

53、2实验方法

54、2.1细胞培养

55、smmc-7721细胞以适当浓度接种于细胞瓶中，加入含10％胎牛血清的dmem培养液，置37℃、5％co2、饱和湿度的培养箱中培养。

56、2.2肝癌小鼠模型实验

57、取雄性balb/c裸鼠，体重(20±2)g，适应性饲养3天后用于种瘤。无菌条件下，取对数生长期的smmc-7721肝癌细胞用于实验。将smmc-7721肝癌细胞0.25％胰酶消化后，台盼蓝拒染法测定活细胞数大于95％，用pbs稀释成1×107/ml的细胞悬液，接种于小鼠右腋皮下，每只接种体积为0.2ml，即每只小鼠接种细胞2×106个。观察小鼠成瘤情况，当扪及接种皮下出现结节，并不断增长时，判断为模型成功。

58、2.3分组、给药及检测指标

59、在接种后的第7-9天(瘤体体积约为0.05cm3)，随机分为模型组，阳性对照组，川蛭通络胶囊低剂量组(简称“低剂量组”)、川蛭通络胶囊中剂量组(简称“中剂量组”)和川蛭通络胶囊高剂量组(简称“高剂量组”)，每组10只，另取10只未作任何处理的小鼠设为空白对照组。

60、根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算小鼠等效剂量，川蛭通络胶囊低、中、高剂量组灌胃0.11375g/kg，0.22750g/kg，0.45500g/kg，阳性对照组平消片腹腔注射0.62790g/kg，空白组和模型组灌胃同等容积的生理盐水。各组均连续给药10天，第10天给药结束后禁食不禁水，次日，眼眶取血后断颈处死小鼠，剥离瘤体，称量肿瘤质量，记录，计算各组抑瘤率。

61、抑瘤率＝(模型组瘤重均值-样品组瘤重均值)/模型组瘤重均值×100％。

62、2.4统计学处理

63、采用spss 21.0统计学软件进行分析，实验数据以“均数±标准差”的形式表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。

64、3实验结果

65、结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠的平均瘤重显著增加(p＜0.05)，表明造模成功；与模型组相比，给予不同剂量的川蛭通络进行治疗后，小鼠的平均瘤重均有一定程度的降低，差异具有显著性意义(p＜0.05)，表明本发明川蛭通络胶囊不同剂量组和阳性对照组均对肝癌小鼠的肿瘤生长有抑制作用。

66、实验表明，本发明组和阳性对照组均对肝癌小鼠的肿瘤生长有抑制作用，而且本发明川蛭通络胶囊剂量越大，抑制肿瘤作用越明显。与模型组相比，本发明川蛭通络胶囊低、中、高剂量组和阳性对照组均有显著性(p＜0.05)差异。结果见表2。

67、表2本发明中药组合物对肺癌小鼠肿瘤的抑制作用(n＝10，)

68、

69、注：与正常对照组相比，“#”表示p＜0.05；与模型组相比，“*”表示p＜0.05。

70、实验例3川蛭通络胶囊对lewis肺癌荷瘤小鼠的影响研究

71、1实验材料

72、1.1实验动物

73、c57bl/6小鼠，雄性，4-6周龄，体重18-22g，实验动物许可证号：syxk(鲁)-20180008，由山东新时代药业有限公司提供。实验前所有小鼠置于室温24-26℃，相对湿度50％-60％，通风及光照良好的环境中，标准鼠饲料常规喂养，自由摄食、饮水。

74、1.2仪器、试剂及药品

75、小鼠lewis肺癌细胞株(购自上海和元生物技术有限公司)；注射用环磷酰胺(ctx，山西普德药业有限公司，国药准字h14023686)。电子天平(奥豪斯国际贸易有限公司)；co2培养箱(thermo3111)。

76、2实验方法

77、2.1荷瘤小鼠模型的构建

78、lewis肺癌细胞复苏后传代，取第三代细胞接种于c57bl/6小鼠右侧腋下，培养8天后，选择精神状态良好，瘤体饱满的小鼠，脱颈椎处死后75％酒精消毒，分离肿瘤组织并剪成约1mm3大小组织块，研磨。用无菌生理盐水调制肿瘤细胞悬液浓度为1×107个/ml。用台盼蓝计数法，显微镜下观察并计数活细胞数＞95％，以每鼠0.2ml于右侧腋窝皮下接种，制作成lewis肺癌荷瘤小鼠动物模型。

79、2.2分组、给药及检测指标

80、c57bl/6小鼠根据体质量，随机分为空白对照组组、模型组、阳性对照组(环磷酰胺)及川蛭通络胶囊低剂量组(简称“低剂量组”)、川蛭通络胶囊中剂量组(简称“中剂量组”)和川蛭通络胶囊高剂量组(简称“高剂量组”)，每组10只。除空白对照组外，其余各组均接种0.2ml的瘤细胞悬液于小鼠右上肢腋部皮下处。从制备肿瘤细胞悬液至接种的整个操作过程应在60min完成。接种24h后，除阳性组隔天腹腔注射ctx 40mg/kg外，川蛭通络各剂量组灌胃给予相应浓度的药物，空白对照组与模型组灌胃给予蒸馏水，每天1次，连续给药14天。

81、根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算小鼠等效剂量，川蛭通络胶囊低、中、高剂量组灌胃0.11375g/kg，0.22750g/kg，0.45500g/kg，阳性对照组平消片腹腔注射0.62790g/kg，空白组和模型组灌胃同等容积的生理盐水。各组均连续给药14天，第14天给药结束后禁食不禁水，次日，眼眶取血后断颈处死小鼠，剥离瘤体，称量肿瘤质量，记录，计算各组抑瘤率。

82、抑瘤率＝(模型组瘤重均值-样品组瘤重均值)/模型组瘤重均值×100％。

83、2.3统计学处理

84、采用spss 21.0统计学软件进行分析，实验数据以“均数±标准差”的形式表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)，以p＜0.05表示差异具有统计学意义。

85、3实验结果

86、结果显示，与正常对照组相比，模型组小鼠的平均瘤重显著增加(p＜0.05)，表明造模成功；与模型组相比，给予不同剂量的川蛭通络进行治疗后，小鼠的平均瘤重均有一定程度的降低，差异具有显著性意义(p＜0.05)，表明本发明川蛭通络胶囊不同剂量组和阳性对照组均对lewis肺癌荷瘤小鼠的肿瘤生长有抑制作用。

87、实验表明，本发明川蛭通络胶囊组和阳性对照组均对lewis小鼠的肿瘤生长有抑制作用，而且本发明组中药组合物剂量越大，抑制肿瘤作用越明显。与模型组相比，本发明川蛭通络胶囊低、中、高剂量组和阳性对照组均有显著性(p＜0.05)差异。结果见表3。

88、表3本发明中药组合物对小鼠移植性肿瘤lewis的抑制作用(n＝10，)

89、

90、

91、注：与正常对照组相比，“#”表示p＜0.05；与模型组相比，“*”表示p＜0.05。

92、综上所述，本发明川蛭通络制剂具有抑制肝癌和肺癌肿瘤生长的功能，对于治疗恶性肿瘤效果显著，且作为一种已上市中成药具有安全性好的优点。