乳剂制备方法与流程

本发明涉及一种乳剂制备方法，具体涉及一种采用狭缝式均质和微射流均质工艺的水包油乳剂制备方法。

背景技术：

1、疫苗通常需要添加佐剂来增强机体对抗原的免疫应答。佐剂是一种非特异性免疫增强剂，本身不具抗原性，但能非特异性地改变或增强抗原的免疫原性或改变免疫反应类型。

2、乳剂型佐剂（包括水包油乳剂、油包水乳剂等）是一种重要的新型佐剂，包含油相成分、水相成分及乳化剂，三种成分的选择和配比决定了乳剂的安全性、稳定性及免疫刺激活性。水包油乳剂以水相成分为主，人体耐受性较高，且与多数疫苗抗原的相容性较好。人用佐剂中的油相成分通常选择可代谢油（如角鲨烯等）。常用的乳化剂通常为安全性好的非离子型乳化剂。

3、目前，已批准上市的疫苗中包含的水包油乳剂有mf59和as03等。mf59的成分包含角鲨烯、聚山梨醇酯80（吐温 80）和失水山梨糖醇三油酸酯（司盘 85）。as03的成分包含角鲨烯、α-生育酚和聚山梨醇酯80。疫苗中使用的水包油乳剂须具有合适的平均粒径以及粒径分布，这也是水包油乳剂制备中的一个技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种乳剂制备方法，用于提高乳剂的粒径均匀性和乳剂的生产效率。

2、为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种乳剂制备方法，包括以下步骤：

4、（1）将油相与含有乳化剂的水相混合后乳化；和

5、（2）乳化后依次进行狭缝式均质和微射流均质。

6、在一些实施方式中，所述乳剂为水包油乳剂或油包水乳剂。

7、在一些实施方式中，步骤（1）中的乳化在高速搅拌下进行。

8、在一些实施方式中，搅拌速度为5000rpm~15000rpm，例如6000rpm~14000rpm、7000rpm~13000rpm、8000rpm~12000rpm或9000rpm~11000rpm。

9、在一些实施方式中，搅拌温度为15-30℃，例如16-28℃、18-26℃或20-25℃。

10、在一些实施方式中，搅拌时间为10-30min，例如12-28min、14-26min或15-20min。

11、在一些实施方式中，步骤（2）进行2-7个循环，例如3个、4个、5个或6个循环。

12、在一些实施方式中，狭缝式均质的压力为20-100mpa，优选50-80 mpa。

13、在一些实施方式中，微射流均质的压力为80-150mpa，例如90-140mpa、100-130mpa或110-120mpa。

14、在一些实施方式中，均质温度为10-30℃，优选15-25℃。

15、在一些实施方式中，微射流均质采用单通道微射流交互腔或多通道微射流交互腔。

16、在一些实施方式中，微射流交互腔的通道呈y型或z型。

17、在一些实施方式中，所述油相包含可代谢油。

18、在一些实施方式中，所述可代谢油为角鲨烯。

19、在一些实施方式中，所述油相进一步包含α-生育酚。

20、在一些实施方式中，角鲨烯与α-生育酚的重量比为0.8-1，例如0.85-0.95，优选为0.9。

21、在一些实施方式中，所述乳化剂包含聚氧乙烯失水山梨糖醇脂肪酸酯(吐温)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(司盘)、辛苯聚醇-9(曲拉通x-100)或聚乙二醇辛基苯基醚以及卵磷脂中的一种或两种。

22、在一些实施方式中，所述乳化剂溶解在缓冲溶液中。

23、在一些实施方式中，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲液、tris-hcl缓冲液、醋酸盐缓冲液或柠檬酸-磷酸缓冲液。

24、在一些实施方式中，所述乳化剂包含吐温80和司盘85中的一种或两种。

25、在一些实施方式中，所述水包油乳剂包括角鲨烯、α-生育酚和吐温80。该乳液可以包括磷酸盐缓冲液。这些乳液可以包含2-10wt.%的角鲨烯、2-10 wt.%的α-生育酚和0.3-3wt.%的吐温80，并且角鲨烯 : α-生育酚的重量比优选<1（例如0.90），这样可以提供更稳定的乳液。角鲨烯和吐温80的重量比为1.5-3，例如1.8-2.8，优选为2.0-2.5，例如2.1、2.2、2.3或2.4。在一些优选的实施例中，这三种组分（角鲨烯、α-生育酚、吐温80）的重量比为大约55:61:25，例如1068:1186:485。在一些实施例中，所述水包油乳剂可用于人用疫苗的佐剂，其中每人剂量包含0.5-10 mg角鲨烯、0.5-11 mg α-生育酚、和0.1-4 mg吐温80，优选的，这三种组分的重量比为大约55:61:25，例如1068:1186:485。

26、在一些实施方式中，所述水包油乳液包括角鲨烯、司盘85和吐温80。乳液可以包括柠檬酸根离子，例如10mm柠檬酸钠缓冲液。在一些实施方式中，该乳液的组成按体积计可以是2-10%角鲨烯、0.2-1.0%司盘85和0.2-1.0%吐温80。在一些实施例中，该乳液的组成按体积计为约5%角鲨烯、约0.5%司盘85和约0.5%吐温80。按重量计，该乳液的组成为4.3%角鲨烯、0.5%司盘85和0.48%吐温80。

27、在一些实施方式中，所述油相进一步包含免疫调节剂，优选地，所述免疫调节剂为单磷酰脂质a（mpl）。

28、在一些实施方式中，所述水相中进一步包含皂苷。

29、在一些实施方式中，所述皂苷选自qs-7、qs-17、qs-18、qs-21中的一种或多种，优选为qs-21。

30、在一些实施方式中，步骤（2）中乳剂的粒径低于170nm时停止乳化。

31、在一些实施方式中，所述方法进一步包括在均质后进行过滤。

32、在一些实施方式中，过滤时采用的过滤器的材质为聚醚砜（pes）或聚偏氟乙烯（pvdf）。

33、在一些实施方式中，所述过滤器的孔径低于0.45微米，优选为0.2微米。

34、在一些实施方式中，过滤的次数为至少一次，优选为两次。

35、在一些实施方式中，过滤一次后静置，然后进行第二次过滤。

36、在一些实施方式中，过滤时使乳剂经过串联设置的两个或更多个过滤器。

37、相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

38、本发明水包油乳剂制备方法采用狭缝式均质和微射流均质，可以显著降低均质所需时间，提高生产效率，并且能够提高乳剂的粒径均匀性，从而提高过滤载量，节省过滤时间和过滤成本。另外，利用本发明所述方法制备的水包油乳剂质量稳定，保质期长，满足疫苗佐剂的要求。

39、本发明水包油乳剂能够与不同的抗原或抗原组合物联合使用，例如：人疱疹病毒、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒(诸如gpi、ii和ie63)、或者来自肝炎病毒、或者来自其他病毒病原体，如副粘病毒：呼吸道合胞病毒、sars病毒、副流感病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人乳头瘤病毒或者流感病毒。本发明制备的水包油乳剂与新型冠状病毒的候选抗原联合免疫balb/c小鼠，检测血清中中和抗体及抗原特异性igg抗体，抗体滴度显著优于传统铝佐剂（氢氧化铝佐剂）5-10倍以上。