1.本发明涉及生物医用新材料领域，尤其是涉及一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂、其制备方法和应用。
背景技术：
2.声动力治疗因其无创，可控，实用的性质受到科研人员的广泛关注(参见wang x,zhong x,bai l,et al.journal of the american chemical society,2020,142(14):6527-6537.)。但是有机分子声敏剂产生活性氧能力弱，超声稳定性差的缺点限制了声动力治疗的发展。
3.卟啉基共价有机框架材料可将小分子声敏剂进行规整排列并且形成多孔结构，这将避免因疏水声敏剂无序堆积产生的活性氧淬灭，同时有助于活性氧的扩散，提高活性氧的产生能力。因框架结构对声敏剂的空间限制作用将使得卟啉基共价有机框架材料具有理想的超声稳定性。所以卟啉基共价有机框架声敏剂将在声动力治疗领域具有潜在的应用前景。(参见wang d,zhang z,lin l,et al.biomaterials,2019,223:119459.)。
4.肿瘤细胞内的高gsh水平将限制活性氧的产生，通过金属离子与gsh间的氧化还原反应将改善这种高度还原性的肿瘤微环境，来增加细胞内因声动力产生的活性氧数量。同时高价金属离子还可以与h2o2进行反应，因化学动力学效果产生的活性氧将进一步增加活性氧数量。所以金属离子配位的卟啉基共价有机框架声敏剂有望实现多重增强的声动力治疗效果。基于此，我们希望开发一种基于卟啉基共价有机框架的高效声敏剂用于肿瘤的治疗。
技术实现要素：
5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂的制备方法，本发明制备的声敏剂具有治疗效果好，稳定性高的特点。
6.本发明提供了一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂的制备方法，包括：
7.a)多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉反应，得到p-cof；
8.b)p-cof和苯胺在溶剂存在下反应，得到p-cof纳米粒子；
9.c)p-cof纳米粒子与可溶性金属盐配位反应得到金属盐-cof纳米粒子。
10.优选的，步骤a)所述多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉的摩尔质量比为(1～3):1。
11.优选的，所述多醛基单体选自对苯二甲醛、2,5-二羟基对苯二甲醛、2,5-双(2-丙炔氧基)对苯二甲醛、2,5-双甲氧基对苯二甲醛、2,5-二羟基对苯二甲醛修饰的双醛基单体、苯三甲醛和1,3,5-三(对甲酰基苯基)苯中的一种或几种。
12.优选的，步骤a)所述反应的溶剂为邻二氯苯、正丁醇和乙酸；所述反应的温度为100～130℃；反应的时间为3～7天；所述反应后还包括离心，所述离心的速率为5000～10000rpm，所述离心的时间为5～15min。
13.优选的，步骤b)所述苯胺与p-cof的亚胺键的摩尔比为(0.025～0.5)1；所述溶剂为dmf；
14.所述反应在超声下进行；所述超声时间为20～60min。
15.优选的，步骤c)所述可溶性金属盐与p-cof纳米粒子中卟啉单体的摩尔比为(1～10)：1。
16.优选的，所述可溶性金属盐选自氯化锌、乙酸锌、硝酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化镁、硝酸镁、硝酸银、氯化锰、硝酸锰、氯化铜或硝酸铜中的一种或几种。
17.优选的，步骤c)所述配位反应的时间为12～36h，温度为100～130℃；
18.所述反应后还包括离心，所述离心的速率为5000～10000rpm，所述离心的时间为5～15min。
19.本发明提供了一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
20.本发明上述任意一项所述的制备方法制备得到的基于卟啉基共价有机框架的声敏剂在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
21.与现有技术相比，本发明提供了一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂的制备方法，包括：a)多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉反应，得到p-cof；b)p-cof和苯胺在溶剂存在下反应，得到p-cof纳米粒子；c)p-cof纳米粒子与可溶性金属盐配位反应得到金属盐-cof纳米粒子。本发明所述备的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂具有高效、超声稳定性高等优点。在肿瘤组织，此声敏剂可以进行光声成像指导治疗，可以消耗肿瘤部位的gsh与h2o2实现三重增强的声动力治疗效果。与未治疗组相比，治疗组具有更好的肿瘤抑制效果。
附图说明
22.图1实施例1得到的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂的扫描电子显微镜照片；
23.图2为实施例3肿瘤抑制曲线结果图；
24.图3为实施例1卟啉基共价有机框架的高效声敏剂的声动力性能验证图；
25.图4为实施例1卟啉基共价有机框架的高效声敏剂的超声稳定性验证图。
具体实施方式
26.本发明提供了一种基于卟啉基共价有机框架的高效声敏剂、其制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
27.本发明提供了一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂的制备方法，包括：
28.a)多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉反应，得到p-cof；
29.b)p-cof和苯胺在溶剂存在下反应，得到p-cof纳米粒子；
30.c)p-cof纳米粒子与可溶性金属盐配位反应得到金属盐-cof纳米粒子。
31.本发明提供的基于卟啉基共价有机框架的声敏剂的制备方法首先多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉反应，得到p-cof。
32.本发明所述多醛基单体选自对苯二甲醛、2,5-二羟基对苯二甲醛、2,5-双(2-丙炔氧基)对苯二甲醛、2,5-双甲氧基对苯二甲醛、2,5-二羟基对苯二甲醛修饰的双醛基单体、苯三甲醛和1,3,5-三(对甲酰基苯基)苯中的一种或几种。
33.按照本发明，所述多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉的摩尔质量比为(1～3):1；更优选为2:1。
34.所述反应的溶剂为邻二氯苯、正丁醇和乙酸。
35.本发明上述乙酸同时具有溶剂和催化的作用。
36.邻二氯苯和正丁醇的体积优选为0.25～1ml，更优选为0.5ml。3m乙酸体积优选为100～300μl，更优选为100μl。
37.即为，所述邻二氯苯、正丁醇和乙酸的体积比为0.5ml：0.5ml：0.1ml。
38.多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉、邻二氯苯、正丁醇和乙酸的比例为：0.44mmol：0.22mmol：0.5ml：0.5ml：0.1ml。
39.所述反应为封管反应；所述反应的温度为100～130℃；反应的时间为3～7天；更优选为105～125℃，反应3～6天；最优选为110～120℃；反应3～5天。
40.反应结束后进行离心操作，所述离心速率优选为5000～10000rpm，更优选为10000rpm。所述离心时间为5～15min，更优选为10min。
41.p-cof和苯胺在溶剂存在下反应，得到p-cof纳米粒子。
42.本发明所述苯胺与p-cof的亚胺键的摩尔比为(0.025～0.5)1；更优选为0.02:1。
43.所述反应在超声下进行；超声时间优选为20～60min，更优选为30min。作用结束后进行离心操作，所述离心速率优选为5000～10000rpm，更优选为10000rpm。所述离心时间优选为5～30min，更优选为20min。
44.所述反应的溶剂包括但不限于dmf。
45.p-cof纳米粒子与可溶性金属盐配位反应得到金属盐-cof纳米粒子。
46.本发明所述可溶性金属盐与p-cof纳米粒子中卟啉单体的摩尔比为(1～10)：1；更优选为2～8:1；最优选为5:1。
47.具体的，所述可溶性金属盐选自氯化锌、乙酸锌、硝酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化镁、硝酸镁、硝酸银、氯化锰、硝酸锰、氯化铜或硝酸铜中的一种或几种；更优选为氯化铁、氯化镁、硝酸镁、硝酸银、氯化锰中的一种或几种。
48.本发明所述反应溶剂包括但不限于dmf；dmf体积优选为10～20ml，更优选为10ml。
49.本发明所述配位反应的时间为12～36h，更优选为16～30h，最优选为24h。温度为100～130℃；更优选为110～120℃；最优选为120℃。
50.反应结束后进行离心操作，所述离心速率优选为5000～10000rpm，更优选为10000rpm。所述离心时间优选为5～30min更优选为20min。超声分散后，制备出基于卟啉基共价有机框架的高效声敏剂。
51.本发明提供了一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂，由上述技术方案任意一项所述的制备方法制备得到。
52.本发明上述任意一项所述的制备方法制备得到的基于卟啉基共价有机框架的声
敏剂在制备治疗肿瘤的产品中的应用。
53.本发明对于所述声敏剂的制备方法已经有了清楚的描述，对其不再赘述。
54.本发明制备的声敏剂可以进行光声成像指导治疗，可以消耗肿瘤部位的gsh与h2o2实现三重增强的声动力治疗效果。与未治疗组相比，治疗组具有更好的肿瘤抑制效果。
55.本发明提供了一种基于卟啉基共价有机框架的声敏剂的制备方法，包括：a)多醛基单体与5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉反应，得到p-cof；b)p-cof和苯胺在溶剂存在下反应，得到p-cof纳米粒子；c)p-cof纳米粒子与可溶性金属盐配位反应得到金属盐-cof纳米粒子。本发明所述备的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂具有高效、超声稳定性高等优点。在肿瘤组织，此声敏剂可以进行光声成像指导治疗，可以消耗肿瘤部位的gsh与h2o2实现三重增强的声动力治疗效果。与未治疗组相比，治疗组具有更好的肿瘤抑制效果。
56.根据本发明，所制备的基于卟啉基共价有机框架的高效声敏剂具有高效、超声稳定性高等优点。在肿瘤组织，此声敏剂可以进行光声成像指导治疗，可以消耗肿瘤部位的gsh与h2o2实现三重增强的声动力治疗效果。与未治疗组相比，治疗组具有更好的肿瘤抑制效果。本发明优选按照以下进行：
57.1)细胞培养：在本发明中，选用4t1细胞系，优选含10％的胎牛血清对细胞进行培养，所述培养条件优选为体积分数为5％、培养温度为37℃的二氧化碳的培养箱。
58.2)光声成像及肿瘤蓄积：在本发明中，实验选用4t1肿瘤模型，采用20g左右的balb/c裸鼠，按照每只小鼠5.0
×
106细胞的密度接种于小鼠腋下。待瘤体积长至200～400mm3时，将卟啉基共价有机框架的高效声敏剂通过尾静脉注入老鼠体内，采用光声成像仪器对不同时间点肿瘤区域的光声信号情况进行检测(仪器设定测试波长范围为680～800nm，背景吸收波长设置为900nm)。
59.3)三重增强的声动力治疗：体内实验选用4t1肿瘤模型，采用20g左右的balb/c小白鼠，按照每只小鼠5.0
×
106细胞的密度接种于小鼠腋下，待瘤体积长至60mm3时，将卟啉基共价有机框架的高效声敏剂通过尾静脉注入老鼠体内，当肿瘤蓄积量达到最大时，采用超声治疗仪发射超声波照射肿瘤处，功率优选为0.8～2.0w/cm2，更优选1.5w/cm2。照射时间优选为5～10min，最优选为5min，在14天后对比肿瘤质量变化(超声每两天照射一次，每两天注射一次材料)。
60.为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种基于卟啉基共价有机框架的高效声敏剂、其制备方法和应用进行详细描述。
61.以下实施例中所用到的试剂均为市售商品。
62.本发明实施例和图中的金属盐-cof纳米粒子均为fe-cof(三价铁配位)。
63.实施例1
64.5.92mg对苯二甲醛，14.9mg 5,10,15,20-四(4-氨基苯基)卟啉，0.5ml邻二氯苯，0.5ml正丁醇，0.1ml 3m乙酸进行混合。封管反应时间3天。反应温度为120℃。反应结束后进行离心，离心速率为10000rpm，离心时间为10min。10mg p-cof与10ml dmf进行混合，并加入220μl苯胺。使用细胞破碎机进行超声作用，功率为300w，时间为30min。超声结束后进行离心并用乙醇洗涤，离心率为10000rpm，时间为20min，离心洗涤次数为3次。此制备过程重复数次。26mg fecl3，100mg p-cof纳米粒子10ml dmf进行混合在120℃反应24h。反应结束后进行离心操作，离心速率为10000rpm。离心时间为20min。超声分散后，制备出基于卟啉基共
价有机框架的高效声敏剂。
65.利用扫描电镜分别对实施例1制备得到的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂进行分析，得到扫描电镜图片，如图1所示，图1实施例1得到的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂的扫描电子显微镜照片；结果表明，实施例1制备出的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂平均大小在150nm之间。图3为实施例1卟啉基共价有机框架的高效声敏剂的声动力性能验证图；由图3可以看出与商品化原卟啉(ppix)相比卟啉基共价有机框架声敏剂可以产生更多的活性氧，具有优异的声动力性能。图4为实施例1卟啉基共价有机框架的高效声敏剂的超声稳定性验证图。由图4可以看出与商品化原卟啉(ppix)相比卟啉基共价有机框架声敏剂具有更高的超声稳定性，这将有助于实现更好的声动力治疗效果。
66.实施例2
67.采用20g左右的balb/c裸鼠，按照每只小鼠5
×
106细胞的密度接种于小鼠腋下，待瘤体积长至200mm3时，将实施例1得到的诊疗纳米反应器通过尾静脉注入老鼠体内，采用光声成像仪器对不同时间点肿瘤区域的光声信号情况进行检测。结果显示，12小时内随着注射时间的延长，肿瘤区域的光声信号逐渐增强。说明实施例1制备出的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂具有很好的光声成像功能。
68.实施例3
69.体内声动力治疗实验选用4t1肿瘤模型，采用20g左右的balb/c小白鼠，按照每只小鼠5.0
×
106细胞的密度接种于小鼠腋下，待瘤体积长至60mm3时，将卟啉基共价有机框架的高效声敏剂通过尾静脉注入老鼠体内，当肿瘤蓄积量达到最大时，采用超声治疗仪发射超声波照射肿瘤处，功率为1.5w/cm2，照射时间为5min，图2为实施例3肿瘤抑制曲线结果图；在14天后对比肿瘤质量变化(超声每两天照射一次，每两天注射一次材料)。结果显示，14天后治疗组的显示非常好的肿瘤治疗效果。
70.本发明提供的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂具有高效、超声稳定性高等优点。制备的卟啉基共价有机框架的高效声敏剂粒径在150nm左右，具有适宜的纳米尺寸，可以通过epr效应在肿瘤区域高效蓄积；在肿瘤组织，此声敏剂可以进行光声成像指导治疗，可以消耗肿瘤部位的gsh与h2o2实现三重增强的声动力治疗效果。与未治疗组相比，治疗组具有更好的肿瘤抑制效果。
71.对比例1
72.金属盐-cof纳米粒子与p-cof纳米粒子对比试验。体内声动力治疗实验选用4t1肿瘤模型，采用20g左右的balb/c小白鼠，按照每只小鼠5.0
×
106细胞的密度接种于小鼠腋下，待瘤体积长至60mm3时，将卟啉基共价有机框架的高效声敏剂通过尾静脉注入老鼠体内，当肿瘤蓄积量达到最大时，采用超声治疗仪发射超声波照射肿瘤处，功率为1.5w/cm2，照射时间为5min，在14天后对比肿瘤质量变化(超声每两天照射一次，每两天注射一次材料)。结果显示，14天后金属盐-cof纳米粒子组显示更好的肿瘤治疗效果。这是因为高价金属离子消耗gsh并与h2o2反应产生
·
oh增强了声动力治疗的结果。
73.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。