miR-505激动剂联合放疗在治疗非小细胞肺癌中的应用的制作方法

mir-505激动剂联合放疗在治疗非小细胞肺癌中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，特别是涉及mir-505激动剂联合放疗在治疗非小细胞肺癌中的应用。


背景技术：

2.根据who发布的2020年全球肿瘤数据，肺癌死亡率和发病率已分别位居第一和第二位。病理上,非小细胞肺癌(nsclc)约占所有肺癌的80％,而目前肺癌患者的治疗方式主要包括手术、化疗和放疗，其中约90％的nsclc患者在手术后接受放疗，对其治疗方案多采用常规的局部分割放疗，即1.8-2.0gy，每天1次，每周5天的局部照射，在肿瘤区域累积60-70gy的总照射剂量，持续约6～8周，以达到对照射部位肿瘤细胞的杀伤作用。然而，许多临床研究表明，在单纯接受放疗的iii期肺癌患者中，90％以上死于放疗后肺癌的复发和转移。其侵袭转移已成为影响肺癌患者生存率的重要原因之一。近年来的研究表明，放疗可能通过增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力来促进存活肿瘤细胞的转移，但其机制尚不完全清楚。因此，放疗如何影响肺癌细胞的侵袭和迁移能力还需要进一步的研究来验证。
3.micrornas(mirnas)在肿瘤细胞的侵袭和迁移过程中起着重要的作用,肿瘤细胞通过与靶基因(mrnas)结合,抑制mrnas的转录后翻译,从而发挥其生物学效应。全身照射后小鼠血清中的mirnas也发生了改变，并且在接受放疗的患者和动物中都检测到了不同程度的mirna表达谱，提示mirnas在电离辐射诱导的细胞功能中起着重要作用。但mirna在电离辐射诱导的肿瘤侵袭转移促进中的作用及机制仍需进一步研究。


技术实现要素：

4.鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种mir-505激动剂联合放疗在治疗非小细胞肺癌中的应用，用于解决现有技术中非小细胞肺癌放疗后缺乏降低肿瘤细胞侵袭迁移能力药物的问题。
5.本发明的一方面提供给了mir-505作为评价指标在非小细胞肺癌放疗中的应用。
6.mir-505作为评价指标是指根据mir-505的表达量来评估放疗的方案是否合理或者指定新的放疗方案。
7.本发明的另一方面提供了mir-505激动剂在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途，所述药物与放疗联合应用。
8.所述药物与放疗联合应用是指，药物在放疗时或者放疗后作为辅助药物应用。
9.所述mir-505激动剂是指可以上调mir-505表达的物质，包括不限于核酸分子、小分子化合物等。
10.所述非小细胞肺癌可是癌症发病的早期、中期或晚期。
11.mir-505激动剂在制备具有以下功效之一产品中的用途：
12.降低非小细胞肺癌放疗后lamp1的表达；
13.降低非小细胞肺癌放疗后cdcp1的表达；
14.降低非小细胞肺癌放疗后肿瘤细胞的侵袭迁移能力。
15.进一步地，所述药物还包括以下特征中的一项或多项：
16.1)所述mir-505激动剂是指对mir-505具有抑制效果的分子；
17.2)所述mir-505激动剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一。
18.本发明的另一方面提供了一种非小细胞肺癌放疗联合治疗药物，所述药物包含治疗有效量的mir-505激动剂。
19.进一步地，所述药物具有至少以下功效之一：
20.降低非小细胞肺癌放疗后lamp1的表达；
21.降低非小细胞肺癌放疗后cdcp1的表达；
22.降低非小细胞肺癌放疗后肿瘤细胞的侵袭迁移能力。
23.所述药物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
24.进一步地，所述药物还包括人体可以接受的辅料。
25.本发明的另一方面提供了一种治疗非小细胞肺癌的药物组合物，所述药物组合物的有效成分之一为mir-505激动剂。
26.进一步地，所述药物组合物中还包括非小细胞肺癌治疗药物。所述药物包括不限于核酸分子、小分子化合物等。
27.所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
28.如上所述，本发明的mir-505激动剂联合放疗在治疗非小细胞肺癌中的应用，具有以下有益效果：
29.本研究结果证实了4gy x射线能增强nsclc细胞的侵袭和迁移能力,并揭示了mir-505通过lamp1、cdcp1和ras/raf/mapk通路的作用机制,为改进nsclc常规分割治疗方案提供了新的标志物和治疗靶点。
附图说明
30.图1a.2、4、6gy x线照射后a549和h1299细胞后24h transwell图。
31.图1b.2、4、6gy x线照射后a549和h1299细胞后24h transwell穿行细胞数统计图。图1c.荧光a549细胞尾静脉荷瘤体内肿瘤活体成像图。
32.图1d.体内肿瘤荧光强度统计图。
33.图1e.4gy x线照射a549细胞后mirna表达测序热图。
34.图1f.a549和h1299细胞中mir-505在4gy x线照射后24h表达。
35.图1g.临床样本中nsclc和癌旁组织中mir-505表达。
36.图1h.a549和h1299细胞转染mir-505mimics后transwell图。
37.图1i.a549和h1299细胞转染mir-505mimics后transwell穿行细胞数统计图。
38.图1j.a549和h1299细胞转染mir-505后4gy x线照射的transwell图。
39.图1k.a549和h1299细胞转染mir-505后4gy x线照射的transwell穿行细胞数统计图。
40.图2a.mir-505与lamp1可能的结合位点图。
41.图2b.293t细胞中转染mir-505的mimics后lamp1的荧光强度统计图。
42.图2c.a549和h1299细胞中转染mir-505的mimics或inhibitor后lamp1基因的表达。
43.图2d.a549和h1299细胞中转染mir-505的mimics或inhibitor后lamp1蛋白的表达。
44.图2e.a549和h1299细胞4gy x线照射后24h的lamp1基因的表达。
45.图2f.a549和h1299细胞4gy x线照射后24h的lamp1蛋白的表达。
46.图2g.a549和h1299细胞中敲低lamp1后细胞的transwell图。
47.图2h.a549和h1299细胞中敲低lamp1后细胞的transwell穿行细胞数统计图。
48.图2i.临床样本中nsclc和癌旁组织中lamp1表达。
49.图3a.a549和h1299细胞敲低lamp1后4gy x线照射的transwell图。
50.图3b.a549和h1299细胞敲低lamp1后4gy x线照射的transwell穿行细胞数统计图。
51.图3c.荧光a549细胞尾静脉荷瘤体内肿瘤活体成像图。
52.图3d.体内肿瘤荧光强度统计图。
53.图3e.肺组织he染色全片扫描图。
54.图3f.he染色图肿瘤面积/总面积统计图。
55.图4a.a549细胞中敲低lamp1后二代测序差异基因热图。
56.图4b.a549细胞中敲低lamp1后二代测序差异基因火山图。
57.图4c.a549细胞中敲低lamp1后二代测序差异统计图。
58.图4d.a549细胞中敲低lamp1后cdcp1基因表达。
59.图4e.a549细胞中敲低lamp1后cdcp1蛋白表达。
60.图4f.临床样本中nsclc和癌旁组织中cdcp1表达。
61.图4g.tcga数据库中nsclc患者cdcp1表达与患者生存期关系。
62.图4h.a549细胞敲低cdcp1后的transwell图。
63.图4i.a549细胞敲低cdcp1后的transwell穿行细胞数统计图。
64.图4j.a549细胞敲低cdcp1后4gy照射的transwell图。
65.图4k.a549细胞敲低cdcp1后4gy照射的transwell穿行细胞数统计图。
66.图5.a549细胞敲低cdcp1后ras/raf/mapk通路相关蛋白表达。
具体实施方式
67.1998年，《柳叶刀》报道，在2128例非小细胞肺癌患者中，术后放疗与未放疗相比，死亡风险增加21％。同样，2016年也有报道称，术后放疗治疗的nsclc患者死亡风险增加18％。此外，许多研究证实一定剂量的电离辐射可以促进肿瘤的侵袭和迁移能力。提示我们的患者术后放疗是否可能通过增强肿瘤细胞的侵袭和迁移能力而影响患者生存，并增加死亡风险。在前期的研究中,我们还发现2,4和6gy的x射线对a549和h1299细胞的侵袭和迁移能力有明显的增强作用,其中以4gy的x射线照射效果明显。
68.为探讨其作用机制,对4gy x射线照射后a549细胞的mirna表达谱进行了测序,其中mir-505表达谱显著降低,证实mir-505是一个能显著抑制nsclc细胞侵袭和迁移能力的
抑癌基因。同时检测患者肿瘤组织中mir-505的表达，其表达与癌旁组织相比明显降低。大量研究证实mir-505与骨肉瘤、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的转移有关,但在非小细胞肺癌的辐射增强转移方面尚未见报道。
69.我们发现4gy x射线在体外显著增强人肺腺癌a549细胞和h1299细胞的侵袭能力，其中mir-505表达不同。因此，我们推测mir-505可能与4gy x射线增强a549和h1299细胞体外侵袭迁移能力有关。我们的研究结果证实了4gy x射线能增强nsclc细胞的侵袭和迁移能力,并揭示了mir-505通过lamp1、cdcp1和ras/raf/mapk通路的作用机制,为改进nsclc常规分割治疗方案提供了新的标志物和治疗靶点。
70.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
71.化学品和试剂
72.动物与伦理声明
73.成年雄性sprague-dawley大鼠购自spf(北京)生物技术有限公司，饲养于解放军火箭部队特色医学中心动物室。实验条件为：温度控制在24℃-26℃，相对湿度为50
±
5％。大鼠在12:12小时的光照/黑暗循环中喂养，自由获得食物和水。所有实验程序均根据《实验室动物护理和使用指南》(第8版，国家科学院出版社，华盛顿特区，2011年)执行，并经当地伦理审查委员会批准。
74.细胞系和细胞培养
75.本研究中使用的人nsclc细胞株a549、h1299，以及人胚胎肾293t细胞是2004年从atcc获得的。并在含有10％胎牛血清(gibco，usa)，100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素(gibco，usa)，rpmi(roswell park memorial institute)1640培养基中培养。细胞在37℃饱和湿度、5％co2的培养箱中孵育，每隔一天更换一次培养基。
76.辐照设备
77.中国人民解放军火箭军特色医学中心放疗科提供直线加速器(precise)作为辐照装置，根据实验需求照射不同剂量x线。
78.人nsclc样本
79.经火箭军特色医学中心伦理委员会批准，并经相关人员书面知情同意，于2015年2月至2020年12月在该机构采集50例未经治疗患者的nsclc样本及匹配的邻近组织。
80.细胞迁移和侵袭分析
81.从培养基中抽吸目的细胞，用pbs洗涤2次，加入胰蛋白酶消化2min后加入适量完全培养基终止消化，将细胞吹下抽入离心管，离心，弃上清液，再加入1ml无血清培养基重新悬浮。用计数板计算细胞密度，然后加入相应的无血清培养基，调整密度为2.5
×
105/ml。将500μl胎牛血清加入transwell的下室，将200μl重悬细胞加入上腔。在培养箱中培养10h后,取出培养室,用棉签轻轻擦掉培养室的上层细胞,用pbs洗涤2次,多聚甲醛固定2min,随后用甲醇渗透20min,倒掉,用pbs洗涤2次,用结晶紫染色液染色15min，回收结晶紫，并洗去多余染液。在200x倒置显微镜下随机计数6个视场，计算平均值。
82.体内转移试验
83.用4gy的x射线照射带有gfp荧光标记的a549细胞,再用4gy的x射线构建shlamp1稳定转移株,经尾静脉注射至裸鼠体内,每只裸鼠1
×
107个细胞。继续培养8周后处死取肺组织，在ivis spectrum小动物活体成像系统中拍摄，分别定量测定两组肺组织的荧光强度。
84.rna提取及qrt-pcr分析
85.用trizol试剂(sigma,usa)从细胞中提取总rna，用primescript rt试剂盒和gdna eraser(takara,dalian,china)逆转录mrna。使用sybr green taq mix(takara，dalian，china)试剂盒进行实时pcr。扩增条件为：95℃预变性30s,95℃变性5s,60℃退火延伸30s,循环40次。所用引物如下：
86.mir-505，正向(seq id no.1):5'-cgtcaacacttgctggtttcctaggaaa-3'和反向(seq id no.2):5'-agtgcagggtccgaggtatt-3'；lamp1(seq id no.3),正向：5'-ctctgtggacaagtacaacgt-3'和反向(seq id no.4)：5'-gttgatgttgagaagccttgtc-3'；gapdh,正向(seq id no.5)：5'-caggaggcattgctgatgat-3'和反向(seq id no.6)：5'-gaaggctggggctcattt-3'
87.以gapdh为对照,按2^-δδct法进行计算分析。
88.双荧光素酶报告试验
89.在萤火虫荧光素酶pgl3报告载体(promega，madison，wi，usa)的kpnl和hindiii位点之间插入lamp1启动子的野生型(wt)和突变型(mut)片段序列(距离lamp1转录起始位点0-2.0kb)。将hek-293t细胞接种于96孔培养板中(5,000个细胞/孔)。用产生的萤火虫萤光素酶载体和mir-505mimics或对照非特异性mimic-nc瞬时共转染细胞，使用lipofectamine rnai max作为转染试剂。转染后，用双荧光素酶报告系统(promega)检测荧光素酶的相对活性。
90.转染分析
91.细胞在标准条件下培养，密度达到60-80％开始转染。gene pharma(中国苏州)设计并生产了特异性靶向lamp1的小干扰rna(sirnas),命名为silamp1。用lipofectamine 3000(invitrogen,usa)转染a549和h1299细胞。转染后24h更换培养基。培养36h后用qrt-pcr检测mrna的表达,培养48h后用western blot检测蛋白表达。sirna序列为(seq id no.7):silamp1,5'-aaacguuugccagaaagugug-3'；
92.蛋白质印迹
93.用ripa裂解液裂解a549或h1299细胞。用bca蛋白定量测定试剂盒(beyotime，china)测定蛋白质浓度。用10％sds-page分离10μg总蛋白，然后转移到pvdf膜(bio-rad，usa)上。在室温下用5％脱脂牛奶在tris缓冲盐吐温(tbst)中封闭膜1小时，然后与抗体在4
℃孵育过夜。在tbst中洗涤膜三次(每次10分钟)后，在室温下孵育二抗(1:5000，abcam，uk)1小时，然后用tbst洗涤三次(每次10分钟)。化学发光后,用image j软件对目的条带和内参比(gapdh)进行定量。
94.本实验所用抗体如下:anti-lamp1(cell signaling technology,usa；9091s,1:1000)；anti-cdcp1(cell signaling technology,usa,4115,1:1000)；anti-ras(cell signaling technology,usa,67648t,1:1000)；anti-phospho-c-raf(cell signaling technology,usa,67648t,1:1000)；anti-phospho-mek1/2(cell signaling technology,usa,9154t,1:1000)；anti-phospho-p44/42mapk(cell signaling technology,usa,4370,1:1000)；anti-gapdh(cell signaling technology,usa；5174s,1:1000).
95.免疫荧光
96.用4％的多聚甲醛固定细胞15min，然后在室温下用0.2％的triton x-100打孔10min，随后用3％正常山羊血清在37℃下封闭1h，与一抗抗体在4℃下孵育过夜。洗涤后，根据所使用的一抗，加入coralite594结合的山羊抗兔igg(h+l)(proteintech，usa；sa00013-4，1:250)。随后使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，1:500，abcam，uk)染色5分钟以显影细胞核。用荧光显微镜(德国leica)检测lamp1蛋白的表达和细胞内定位。本实验所用抗体如下:anti-lamp1(cell signaling technology,usa；9091s,1:200)。使用image j对图像进行荧光强度分析。
97.异种移植模型
98.带有gfp荧光标签的a549细胞在4gy x线照射，构建shlamp1稳转株再行4gy x线照射之后，通过尾静脉注射到裸鼠体内，每只裸鼠注射1
×
107个细胞。继续培养8周后处死取肺组织，在ivis spectrum小动物活体成像系统中拍照，对两组的荧光强度分别进行定量分析。
99.统计分析
100.使用graphpad prism 7.0(graphpad software，inc.，la jolla，ca，usa)进行统计分析。数据以均值
±
均值标准误差(sem)表示。组间差异通过单因素方差分析(anova)和后tukey's检验进行评估。每个实验重复为三个独立的实验，除非指定。p《0.05有统计学意义。
101.实施例1 4gy x线照射可增强nsclc细胞的侵袭和迁移能力
102.首先，我们分别用2、4和6gy的x射线照射a549和h1299细胞，用transwell法检测照射后细胞的侵袭和迁移能力。结果表明：2、4、6gy剂量照射后nsclc细胞的侵袭迁移能力均有不同程度的增强，以4gy剂量最显著(图1a-b)。同时，应用ivis spectrum小动物活体成像系统，对4gy x射线照射后的裸鼠肺组织进行gfp荧光标记照相，并分别进行荧光强度定量(图1c-d)。结果表明：4gy x射线照射后a549细胞的体内转移能力明显增强。
103.4 gy x线照射后mir-505显著降低
104.为探讨4gy x射线照射增强nsclc细胞侵袭和迁移能力的mirna机制，我们对4gy x射线照射后a549细胞mirna表达谱进行了测序，热图显示差异基因中mir-505在4gy照射后减少(图1e)。用qrt-pcr方法检测4gy x射线照射后的a549和h1299细胞中mir-505的表达。结果证实，mir-505在照射后显著降低(图1f)。为探讨mir-505对nsclc细胞侵袭和迁移能力的影响,将mir-505mimics和inhibitor转染a549和h1299细胞，检测其侵袭和迁移能力，结
果表明，mir-505可显著抑制nsclc细胞的侵袭和迁移能力；而mir-505mimics转染促进了nsclc细胞的侵袭和迁移能力(图1h-i)，说明mir-505在nsclc细胞侵袭和迁移的调控中起重要作用。此外，mir-505可显著抑制照射对nsclc细胞侵袭和迁移能力的促进作用(图1j-k)，证明mir-505的下调介导了电离照射诱导的nsclc细胞侵袭和迁移能力的增强，同时在临床样本中，mir-505在肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织(图1g)。
105.实施例2 mir-505通过靶向lamp1作用于照射增强的nsclc侵袭迁移能力
106.为了进一步揭示mir-505介导辐射诱导nsclc侵袭转移的下游分子，我们利用mirna靶基因预测网站预测潜在的靶基因并筛选出mir-505可能的结合位点。lamp1具有良好的预测分数和合适的结合位点，成功地被选为mir-505的靶基因之一(图2a)。随后，进行双荧光素酶基因报告试验来检测mir-505对lamp1的调节作用，这表明mir-505与lamp1的3'utr(untranslated region,非翻译区)有一个精确的结合位点(图2b)。进一步研究表明，mir-505mimics转染a549和h1299细胞后，lamp1的mrna和蛋白表达均显著降低，而mir-505inhibitor转染后lamp1的mrna和蛋白表达均显著增加(图2c-d)。此外，在4gy x射线照射后24h，lamp1的mrna和蛋白表达显著上调(图2e-f)，这与mir-505抑制剂转染一致，提示mir-505可能通过靶向lamp1介导辐射增强的nsclc侵袭和迁移能力。因此，我们进一步研究了lamp1在nsclc细胞侵袭和迁移中的作用。构建了稳定敲低lamp1(shlamp1)或稳定表达阴性对照shrna(shnc)的a549和h1299细胞株，并通过qrt-pcr分析和western blot进行验证。transwell实验显示lamp1敲除后a549和h1299细胞的侵袭和迁移能力显著下降(图2g-h)，同时在临床样本中，lamp1在nsclc组织中的表达显著高于癌旁组织(图2i)。
107.实施例3照射通过上调lamp1增强nsclc细胞体内外侵袭迁移能力
108.为探讨lamp1是否参与辐射诱导nsclc细胞的侵袭和迁移，我们进一步研究表明，将nc组和shlamp1组照射之后，检测nsclc细胞体内体外的侵袭转移能力。4gy照射之后nc组的侵袭转移能力显著增强，但在lamp1敲低组中并未发现这一现象(图3a-d)。并对肺组织做切片染色后，可以明显观察到细胞呈实性片巢生长、核聚集等明显肿瘤组织特征，其中肿瘤组织占全部切片面积的比例与中肿瘤成像结果类似，敲低lamp1后相对于nc组形成的肿瘤组织更小(图3e-f)。这些结果表明4gy电离辐射增强的nsclc细胞侵袭转移能力可以因lamp1敲低而被抑制，说明4gy电离辐射增强的nsclc侵袭转移能力可以通过上调lamp1来实现。
109.实施例4 lamp1可介导cdcp1增强nsclc细胞的侵袭和迁移能力
110.lamp1被普遍认为参与细胞的自噬过程，目前尚无明确的lamp1与肿瘤转移关联的文献。为了验证lamp1如何影响nsclc的侵袭和迁移能力，对有或无lamp1敲除的a549细胞进行转录组测序，其中获得133个上调基因和253个下调基因(图4a-c)。为了筛选可能与肿瘤侵袭和转移相关的基因，进行qrt-pcr和wb来验证已报道的与肿瘤侵袭和转移相关的基因，其中只有cdcp1在mrna和蛋白下调后显著降低(图4d-e)。并且在临床样本中，nsclc中cdcp1表达显著高于癌旁组织(图4f)，并且来自tcga数据库的生存曲线分析高表达cdcp1会显著降低患者的生存期(图4g)。因此，我们假设lamp1通过cdcp1介导辐射诱导的nsclc细胞侵袭和迁移能力增强。为验证这一假说，将sicdcp1转染a549细胞，检测其侵袭和迁移能力。抑制cdcp1显著抑制了a549细胞的侵袭和迁移能力，证实了cdcp1对侵袭和迁移的调节作用(图4h-i)。进一步研究表明，cdcp1抑制了辐射增强的a549细胞侵袭迁移能力(图4j-k)，提示
cdcp1可能是mir505/lamp1的下游靶基因,在电离辐射诱导的nsclc侵袭和迁移增强中起重要作用。
111.实施例5 lamp1通过ras/raf/mapk途径增强nsclc的侵袭和迁移能力
112.cdcp1通过ras/raf/mapk通路调控nsclc细胞的侵袭和迁移能力。目前多篇文献报道cdcp1与肿瘤细胞的侵袭和迁移能力有关，mapk通路在其中起重要作用。我们通过敲低cdcp1检测mapk通路相关蛋白的表达，结果也显示ras/raf/mapk等蛋白的表达明显降低，说明cdcp1通过作用于ras/raf/mapk通路调控nsclc细胞的侵袭转移能力(图5)。
113.分析与讨论
114.为探讨mir-505在nsclc辐射诱导转移中的作用机制,首先利用生物信息学软件预测了mir-505的靶基因,然后利用双荧光素酶报告系统确定了lamp1为mir-505的靶基因。已有的研究表明，lamp1与细胞的自噬过程相关，作为一种降解的自噬溶酶体细胞器，也是自噬下游途径的必需基因，被认为是细胞清除杂质的有益过程。但目前尚无研究报道lamp1与nsclc转移的关系。本研究首次提高了照射后lamp1的表达，与mir-505相比，照射后lamp1的表达降低，这与mir-505结合lamp1的mrna发挥抑制作用的机制一致。进一步，体外干扰nsclc细胞lamp1的表达，发现a549和h1299细胞的侵袭和迁移能力显著降低，表明lamp1在nsclc中起重要的促进侵袭和迁移作用。
115.我们已经证实lamp1是mir-505的靶基因，在照射增强nsclc细胞的侵袭和迁移过程中起着不可替代的作用。进一步，为了探讨lamp1对nsclc细胞侵袭和迁移的特异性模式，我们测序了lamp1敲低与否的转录组差异，其中与肿瘤侵袭和转移密切相关的cdcp1在lamp1敲除后明显减少。mapk作为cdcp1的下游分子已被大量研究证实，ras/raf/mapk通路作为一种经典的通路已被证实与乳腺癌、肺癌、肠癌等多种肿瘤的浸润转移相关。由此可见，我们的总体研究思路是“ir-mir-505-lamp1-cdcp1-mapk”轴对nsclc细胞的侵袭迁移能力产生影响。
116.肺癌细胞浸润转移已成为肺癌患者最主要的死亡原因。本研究首次发现4gy x射线照射降低mir-505表达，增加其靶基因lamp1表达，进而增强cdcp1的表达，介导ras/raf/mapk通路增强nsclc细胞的侵袭迁移能力。本研究结果为寻找抑制人肺腺癌细胞侵袭迁移的新靶点提供了实验依据。
117.同时，恶性肿瘤的常规分割放疗仍是常见的放疗方案。基于本研究2、4、6gy x线照射可促进肺癌细胞侵袭和迁移的发现，我们提出了一个值得考虑的假设：是否可在分次放疗开始时使用单一较大剂量，以避免较小剂量对肺癌细胞侵袭和迁移能力的潜在促进作用。我们的假设得到了多项研究的支持，即在50gy(常规分割)全乳腺照射(wbi)之前进行一次增量照射(多数约10gy)可将低危肿瘤的局部复发率降低到1％。在肝癌的治疗中，≥48gy/3剂量的立体定向放射治疗效果较好，肿瘤局部控制率优于≤45gy/3次放射治疗。而且，科罗拉多大学的研究表明，20gy/3次放疗转移性肝癌是安全的，没有x线肝炎。目前的研究和实验也报道了闪光放射治疗，即以超高剂量率(约≥40gy/s)给予超高剂量的辐射，可以在很短的时间内达到治疗剂量，降低皮下荷瘤小鼠自发性肺转移的发生率，这并非巧合。总体而言，我们有信心相信在nsclc放疗早期给予一次较高剂量的照射可能会有更好的治疗效果，这为进一步优化目前常规的分次放疗方案提供了实验依据，值得在更系统的临床研究中加以阐明。
118.总之,本研究揭示了4gy x线照射可增强nsclc细胞的侵袭和迁移,验证了“mir-505-lamp1-cdcp1-mapk”轴在照射诱导nscls转移增强中的作用，为肺癌常规分割放疗方案的改进提供了新的建议,为nsclc侵袭转移的诊断和治疗提供了新的标志物和靶点。
119.以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。